大学课程遗传学实验实验七 DNA限制酶酶切图谱构建与分析 JC课件
DNA--重组-酶切和连接ppt课件
型限制酶活性缺失，这对外源基因的导入及质粒的 转化是有利的。
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hsdR17(rk12-mk12+)：表示R17 的变异而导致K菌 株来源的hsdR的功能丧失。
recA1： recA为基因重组相关的基因，表达ATP依 赖型DNA重组酶。该基因突变（recA1）导致同源或
引物2
3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’
pETBlue-2
HindⅢ
ATG GCG ATA TCC CGG GAG CTC GTG GAT CCG AAT
引物1： 5’GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3’ BamHⅠ 引物2： 5’GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3’ HindⅢ 12
…………………………………………………………………………. ……
………………………………… AKP CDS ………………………………….
……………………………………………………………………………….
……………………………………………………………………………….
CDS ….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’
1 23
杂带
一条带
两条带
三条带
PET Blue质粒DNA的琼脂糖电泳（1%）
Lane1：sample 1
Lane2：sample 2
Lane3：sample 3
3
我们的结果
12
34
15000bp 10000bp
7500bp 5000bp 2500bp 1000bp
DNA 的限制性内切酶酶切分析讲解
1. DNA中的中的DNase,蛋白,RNA, SDS ,EDTA,酚, 中的 ,蛋白, , , 氯仿和乙醇等
杂质都会影响酶切效果. 氯仿和乙醇等杂质都会影响酶切效果. 2. DNA中的杂中的杂DNA,蛋白可与非专一性结合使酶活中的杂 ,蛋白可与RE非专一性结合使
酶活性降低,另外杂DNA 也竞争酶的切口,往往造成切不也竞争酶的切口, 性降低,另外杂动. 3. DNA中的盐离子(如Mn2+,Cu2+,Co2+和Zn2+等) 中的盐离子( 中的盐离子与有机溶剂(如酚,氯仿和乙醇等) 与有机溶剂(如酚,氯仿和乙醇等)都可抑制限制酶的活性或使限制酶失活或造成DNA切不动或使限制酶的活性或使限制酶失活或造成切不动或使限制酶切割一些非特异序列(*活性活性) 切割一些非特异序列(*活性).
分子克隆
个体克隆多莉羊的克隆。
DNA的限制性酶谱分析ppt课件
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1
一. 实验目的
通过本实验了解限制性内切酶的作用原 理，限制性酶切技术及限制性酶切图谱的 分析方法。
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2
二. 实验原理
限制性内切酶是一类能识别并切割双链 DNA分子中特定核苷酸序列的核酸内切 酶。
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3
限制性酶切反应体系的组成
1，DNA 2，缓冲液 提供限制性酶作用所需的离子浓度及种 类；提供限制性酶作用所需的 pH值 3，限制性内切酶
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4
限制性酶切图谱的分析
DNA在限制性酶切后往往会形成多条片段， 从片段的数量和大小大致可以推断DNA限 制性酶切位点的多少及相对位置。
我们往往利用DNA分子量Marker读出酶 切片段的大小。
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5
DNA分子量Marker
100 bp Marker
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6
三. 实验方法
1．在0.5 ml 离心管中混和如下试剂()：
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8
3．取10µl反应液，1％琼脂糖凝胶电泳检测， 同时以 DNA（EcoRI/HindIII）作为分子量 Marker
4.记录实验结果：对照分子量Marker，记录所 得片段的数量和大小，并分析 DNA有几个 HindIII酶切位点
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后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用
DNA：
2 µl
10×酶切缓冲液：
2 µl
无菌水：
14 µl
HindIII：
1 µl
EcoRI
1 µl
2．37℃水浴 45 min
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DNA的限制性酶切实验原理
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一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它 们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制
与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13
噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。
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琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
dna限制酶切反应和限制酶谱绘制
限制性核酸内切酶能够识别并切割 DNA分子中的特异序列，产生具有特 定末端的片段，这些片段可用于进一 步的分析和实验操作。
限制酶的分类与特性
分类
根据限制酶识别的DNA序列和切割位点的数量，可以将限制酶分为单切酶和双 切酶。
特性
限制酶具有高度的特异性，只切割DNA分子中的特异序列，对非特异性序列不 产生切割作用。此外，不同的限制酶具有不同的温度最适值、pH最适值等特性。
突变分析
通过测序技术检测酶切位 点附近是否存在基因突变， 了解酶切效率的影响因素。
酶切效率评估
通过定量分析酶切产物与 未酶切DNA的比例，评估 酶切效率。
酶谱绘制方法与步骤
进行酶切反应
设计实验
设计合适的酶切反应体系，包括 DNA模板、限制性内切核酸酶、 缓冲液等。
将DNA模板和限制性内切核酸酶 混合，进行酶切反应。
DNA限制酶切反应和限 制酶谱绘制
• DNA限制酶切反应概述 • DNA限制酶谱绘制 • DNA限制酶切反应的应用 • DNA限制酶切反应的挑战与展望 • 实验操作与注意事项
01
DNA限制酶切反应概述
定义与原理
定义
DNA限制酶切反应是指使用限制性 核酸内切酶对DNA分子进行特异性 切割，产生特定长度的DNA片段的 过程。
通过凝胶电泳技术，将酶 切反应产物在电场中分离， 根据条带大小判断酶切位 点。
染色检测
利用荧光染料或溴化乙锭 染色，观察酶切产物在紫 外灯下的荧光条带。
生物发光检测
利用荧光素酶标记DNA片 段，通过生物发光技术检 测酶切产物的荧光信号。
酶切位点分析已知序列进行比对， 确定酶切位点的位置。
生物工程与基因治疗
生物工程
限制性酶切与连接PPT课件
实验步骤与试剂
反应体系 • 质粒pUC18 DNA
2μ l
• PCR产物
2μ l
• HindⅢ内切酶
2μ l
• Hind Ⅲ 10 X buffer 2μ l
• ddH2O
12μ l
保存
DNA电泳常见问题分析 问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
原 因
• DNA上结合有蛋白质
• 内切酶中含有DNA外 对
切酶
策
• 减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶
• 减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶
DNA电泳常见问题分析
问题七：酶切后的DNA片段连接效率低
原 因
• 含磷酸盐的浓度高
成都医学院-生化与分子生物实验
注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常
1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－ ３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。
第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
实验7 DNA的酶切与连接
实验七、DNA的酶切、连接限制性核酸内切酶可以识别并附着特定的DNA序列，并对每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割，使DNA双链产生平末端或黏性末端。
DNA连接酶能连接DNA链中3’-OH末端和5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。
DNA连接酶的催化作用需要消耗能量。
1、酶切反应DNA样品：PCR纯化产物、空载体pQE30； 内切酶：Bam HⅠ、Hin dⅢ；反应体系：50μL。
酶活性1 μl Bam HⅠ（QuickCut）限制酶在50μl的反应体系中，在30℃条件下，经过5 min反应，可将1μgλDNA 完全消化。
37℃反应也表现出相同的酶活性，但不如30℃时稳定。
1 μl Hin dⅢ（QuickCut）限制酶在50μl的反应体系中，在37℃条件下，经过5 min反应，可将1μgλDNA 完全消化。
50μL反应体系ddH2O补至50μl10×QuickCut Green5uLBufferDNA（pQE30、EGFP）200ngQuickCut Bam H I1uLQuickCut Hin dⅢ1uL注：本实验消化约5μg DNA样品，按实际浓度计算所用的体积。
分别对空质粒、EGFP进行酶切。
操作步骤1.按上表组分配制酶切反应液；2.用枪头轻轻混匀；3.在37℃保湿孵育30min；4. 1.2%琼脂糖凝胶电泳20min，使用QuickCut GreenBuffer可直接上样；5.进行胶回收，回收产物置于-20℃冰箱保存，用于连接反应。
2、连接反应DNA样品：目的基因片段、空载体pQE30；（经双酶切并回收纯化）连接酶：T4 DNA连接酶；反应体系：20μL。
20μL反应体系ddH2O补至20μL 10×ligation buffer2uL载体DNA（pQE30）50ng目的DNA片段（EGFP）33ngT4 DNA Ligase (350U/μl)1uL注：载体和目的基因的摩尔比为1:3，50ng/3.4kb : 33ng/0.72kb = 14.7 : 45.8 ≈ 1:3操作步骤1.按上表组分配制酶切反应液；2.用枪头轻轻混匀；3.在16℃保湿孵育3h；（可在PCR仪里进行）4.连接产物由值日生放置于-20℃冰箱保存，用于转化实验。
质粒DNA限制性酶切图谱分析
实验结果：分析D酶NA切M图ar谱ker (2ul，6X点样液2 ul，电极缓冲液
五、注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常
1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－ ３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。
六、限制性内切酶酶切常见问题分析 问题一：DNA完全没有被内切酶切割
原 因
1. 内切酶失活
2. DNA不纯，含有SDS，酚， EDTA等内切酶抑制因子
3. 条件不适（试剂、温度） 对
4.
DNA酶切位点上的碱基被甲 基化
策
5. DNA酶切位点上没有甲基化 （如Dpn I）
6. DNA位点上存在其它修饰 7. DNA不存在该酶识别顺序
6. 将DNA底物与λDAN混匀进行切割验 证
7. 换用其它的酶切割DNA或过量酶消 化进行验证
六、限制性内切酶酶切常见问题分析
问题二：DNA切割不完全
原
因
1. 内切酶活性下降
2. 内切酶稀释不正确
3. DNA不纯，反应条件不佳
4. 内切酶识别的DNA位点上的碱 基被甲基化或存在其它修饰
DNA的限制性内切酶酶切分析
DNA的限制性内切酶酶切分析DNA限制性内切酶酶切分析（restriction enzyme digestion analysis）是一种常用的实验方法，用于分析DNA片段的长度及其在不同DNA样本中的存在与否。
本文将介绍DNA限制性内切酶的定义和分类、酶切分析的原理、实验步骤和结果的分析等内容。
DNA限制性内切酶（restriction enzyme）是一种能够识别特定的DNA序列并酶切它们的酶类。
它的发现和应用让分子生物学和遗传学研究取得了重要的突破。
限制性内切酶按照它们识别的DNA序列和酶切的方式可以分为以下几类：1. 四切酶（Type I）：这类酶不仅有切割DNA的酶活性，还有甲基转移酶活性。
它们通常是多亚基复合物，需同时与子基的甲基转移酶活性合作。
2. 六切酶（Type II）：这类酶是最常用的限制性内切酶，它们能够识别特定的DNA序列，并在识别序列中特定的位置切割DNA链。
这类酶可以以精确的方式酶切DNA，生成具有粘性末端或平滑末端的DNA片段。
3. 四切酶（Type III）：这类酶也是多亚基复合物，通常需要其中一种辅助因子才能发挥酶切活性。
4. 五切酶（Type IV）：这类酶的酶切方式和高度特异性尚不清楚。
在酶切分析实验中，我们通常选用能够产生可检测到的DNA片段的限制性内切酶进行反应。
实验步骤如下：1.提取DNA样本：从要分析的细胞或组织中提取总DNA。
2. 选择限制性内切酶：根据需求选择一种适合的限制性内切酶。
常用的限制性内切酶有EcoRI、HindIII、BamHI等。
3.DNA酶切反应体系的设置：配置适当的酶切反应缓冲液，加入所选的限制性内切酶和总DNA，进行适当的搅拌反应。
4.酶切反应的条件调整：根据所选酶切酶的最佳工作条件进行反应温度、反应时间等参数的调整。
5.停止酶切反应：加入适当的制动剂（如酶切反应停止缓冲液）终止酶切反应。
6.扩增和可视化：对酶切后的DNA样品进行聚合酶链反应（PCR）扩增或直接进行凝胶电泳检测，以确定DNA片段的长度和存在与否。
DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制课件 (一)
DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制课件 (一)DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制课件是高中生物教育中的必修内容，旨在让学生了解DNA限制酶是如何起作用的，以及如何使用限制酶谱绘制技术来区分和比较DNA分子之间的差异。
以下是详细讲解：一、DNA限制酶切反应1.1 什么是DNA限制酶DNA限制酶是一类天然存在于细菌和其他微生物中的酶。
它们可以识别特定的DNA序列，并在这些序列的两侧切断DNA分子，形成一系列自然的“限制性片段”。
1.2 DNA限制酶如何切割DNA分子DNA限制酶可以识别并切割DNA分子中的双链DNA，主要有以下几个步骤：（1）DNA限制酶通过“扫描”DNA分子，找到需要切断的目标序列。
（2）通过与DNA分子中的靶标序列特异性配对，DNA限制酶在靶标序列两侧同时切割，形成两个粘性末端或平滑末端。
（3）粘性末端的特点是其中一条链比另一条链长出几个碱基，这样就使其容易与相同限制酶切割产生的其他粘性末端进行连接。
1.3DNA限制酶的分类和应用DNA限制酶可以根据它们切割的靶标DNA序列进行分类。
这些靶标序列通常是在酶名称后面标注的第一个字母缩写。
不同的限制酶会切割不同的DNA序列，因此它们具有不同的识别和切割模式。
这种特异性可以使DNA限制酶被用于许多生物学应用中，例如：DNA序列分析，DNA重组，基因克隆等。
二、限制酶谱绘制课件2.1什么是限制酶谱？限制酶谱是对于单个DNA分子进行DNA限制酶切割反应，产生的一系列限制性片段进行分析的过程。
限制酶谱可以用来鉴定和区分不同的DNA分子，例如：同源染色体，嵌合体，插入序列，基因家族等。
2.2 如何绘制限制酶谱？绘制限制酶谱需要识别出DNA限制酶在目标DNA中产生的限制性片段，并构建一个分子量标准库，将每个片段的长度与相应的分子量进行对应。
限制酶谱可以使用凝胶电泳技术进行分析，并通过可见光或放射性同位素的荧光成像来观察分子量标准库中的各个DNA片段。
限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用 ppt课件
大的灵活性。
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通过 使 用 (15 种 )限 制 性 内 切 酶 酶 切 重 组质 粒，说明限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶
切图谱分析的方法o
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方法：
1.质粒的构建 采用聚合酶链反应chainreaction，PCR)方法扩增出 MLCKcDNA
片段，插入质粒 pBKrsv中，构建成 pBKrsv-MLCK 重组质粒
ppt课件
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解决方法
1.标准底物检测酶活性
2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3.检查反应系统是否最佳
4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重 新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌 株
5. 换 用 不 同 切 割 非 甲 基 化 位 点 的 同 类 酶 消 化 DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增
6.将DNA底物与λDNA混匀进行切割验证
7.换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验
证ppt课件
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二.如果DNA切割不完全？ 1.内切酶活性下降 2.内切酶稀释方法不正确 3.DNA不纯，反应条件不佳 4.内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其 它修饰 5.部分DNA溶液粘在管壁上 6.内切酶溶液粘度大，取样不准 7.酶切后DNA粘性末端退火 8.由于反应溶液、温度使内切酶变性 9.过度稀释使酶活性降低 10.反应条件不适
限制性核酸内切酶切割原理、 方法、结果分析及应用
PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓
ppt课件
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课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特
定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶。
大学课程遗传学实验实验七 DNA限制酶酶切图谱构建与分析 JC课件
2) 核酸限制性内切酶的类型与基本特性
即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。这三种不同类型的限
制酶具有不同的特性。
Ⅰ型能识别专一的核苷酸顺序，但是切割的核苷酸 顺序没有专一性，是随机的。
Ⅱ型能识别专一的核苷酸顺序通常是一个回文对称 结构，并在固定位置上切割双链。由于识别和切 割的核苷酸都是专一的，因此这种限制性内切酶 是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
1) 寄主控制的限制与修饰现象
限制（restriction）和修饰（modification）
是细胞的一种防卫手段.各种细菌都能合成一种或几 种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来 限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶 的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合 成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限 制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
Ⅱ型也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核 苷酸对切割双链，但这几个核苷酸对不是特异性 的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的DNA 片段具有各种单链末端。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读” 都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式:粘性 末端和平末端
３．Eppendorf管于３７℃金属浴中反应２ 小时。
3. 实验材料与仪器
• λDNA • 标准分子量片段 marker
• EcoRⅠ,HindⅢ, BamHⅠ 等核酸内切酶（Takara）
• 琼脂糖
• TBE或TAE缓冲液(10×) • 溴化乙啶染色液(10mg/ml) • 上样液(10×)：0.25% 溴酚兰，40％(W/V)
蔗糖 水溶液或30％的甘油。
单酶切
HindIII切割λDNA后电泳得到8个片 段．分别为23130bp, 9416bp, 6557bp, 4361bp, 2322bp, 2027bp, 564bp, 125bp。
最新第四节DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制PPT
第四节DNA限制酶切反应和限制酶 谱绘制
ii. 限制酶的纯度和稳定性 i) 纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件 ii) 稳定性：保存和反应
iii. 反应缓冲液：常用三种核心缓冲液，即高（H），中（M）， 低（L）盐缓冲液，不同温度下的pH值
iv. 反应温度：大多数为37℃ v. 双酶切和多酶切反应
ii. II型限制酶
人基因组有45,000个CpG岛,一个长度约为1.5 kb富含GC的
DNA片段,其中只有25%的CpG岛未被甲基化,这些CpG岛常位于基
因的5’-端,未被甲基化的CpG岛平均长约270 kb
CH3
CH3 CH3 CH3
CH3 CH3
可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别8或6
单端标记方法1
人工合成单端标记法
第四节DNA限制酶切反应和限制酶 谱绘制
单端标记方法2
限制酶切单端标记法
第四节DNA限制酶切反应和限制酶 谱绘制
3. 末端标记双相作图法
方法2仍存在两个不足之处： ①酶1的选择不能靠近DNA 中央；②需先分离DNA片段， 该法可克服上述缺点。
现假设有一片段长10 Kb， 其中RE1有三个切点，RE2 有一个切点，其图谱可能是:
1) 同种限制酶作用不同DNA片段产生的相同粘性末端 重组DNA可用同种酶再切开,但识别简并序列的限制酶除外
(如AraI) 2) 不同种限制酶作用不同DNA片段产生的相容性末端
i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglII ii.重组DNA分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用 的可能性较小,如MboI/BamHI 3) PCR产物与特定载体的连接 4) 限制酶和其他方式产生的平整末端.
DNA 的限制性内切酶酶切分析
4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer +5ul酶切产物
或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示剂) 移动至胶前沿2cm处停止电泳(约30min)。 （不超过5V/cm胶长度）
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
质粒DNA
5ul
10U/ul EcoRI 2ul
掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h
2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中， 加入1×TAE缓冲液60ml，微波炉加热至沸腾分析
实验原理
限制性内切酶(Restriction Endonuclease,RE):
由细菌自身产生，能识别双链DNA分子中特 定的碱基顺序，以内切方式水解核酸中的磷 酸二酯键，产生粘性末端或平头末端
EcoR I的作用模式图:
5 **********GAATTC******** 3 3 **********CTTAAG******** 5
EcoR I
5
3
5 ********G－OH
P－AATTC*******
3 ********CTTAA－ P 5
OH－G******* 5
产生5 突出粘性末端
Bcl-2重组质粒 的酶切模式图
pBS-Bcl-2 (4.86kb)
pBS (2.96kb)
EcoR I
Bcl-2 (1.9kb)
操作步骤（改动）
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水 汽进入管内，使反应体积大大增加，造成酶切 失败
DNA限制性内切酶酶切与电泳pptppt
EcoRⅠ的识别序列
5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’
HaeⅠ的识别序列
5’- GTTAAC-3’
3’- CAATTG -5’
5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’
3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’
5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAp
pAATTCNNNNNN3' GNNNNNN5’
光复合物，在紫外线254 ～365nm照射下呈桔
红色荧光。电泳时所需DNA样品量仅0.5～
1μg.
线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝 胶浓度的关系
琼脂糖凝胶的百分浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 分离线性DNA片段分离的有效 范围(kb) 60 ～5 20 ～1 10 ～0.8 7 ～0.5 6 ～0.4 4 ～0.2 3 ～0.1
二、电泳
⒈琼脂糖溶液的制备 溴化乙锭浓度0.5μg/mL ⒉凝胶板的制备 ⒊上样 ⒋电泳 电压10v/cm,溴酚蓝移出2/3的距离时，取 出凝胶紫外灯下观察结果
电泳检测示例
的侵袭。
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序（回文序列），
并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；
Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助
因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复
顺序；
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－ －５’端突出；３’端突出和平末端。
二、DNA琼脂糖凝胶电泳
原理：
琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子 筛效应分离不同分子量大小的DNA，相同分 子量的DNA分子若构型不同电泳速度亦不同。 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA片段的典型方法，特点是制备简单、快 捷，灵敏。
限制性核酸内切酶与DNA物理图谱构建
取 出 转
印 纸 以 探
针 杂 交 呈
色
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.499
Northern blotting（印迹法）
2、 Northern Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 3、 Western Blotting 抗原与抗体的杂交 研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。
复性机制：10-20bp成拉链 热变性DNA在缓慢冷却时可以
复性，快速冷却不能复性。 复性速度可用Co·t衡量。 Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，
t为时间，以秒表示。
核酸复性的速度与其基因组复杂度有关 p510
基因组大小 1 0
10 102 103 104 105 106 107 108 109 1010
Tm值与介质中离子强度的关系
③介质中离子强度 离子强度高，Tm高。
阳离子中和核酸的负电荷而使 Tm 增大
100 0.01 M phosphate
0.001 M EDTA 80
5’ 3’
G + C (%)
60
40
20
0.15 M NaCl 0.015 M Na citrate
0
5’
3’
60 70 80 90 100 110
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
EcoRI
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
G CTTAA EcoRI sticky end
G AATTC CTTAA G
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3. 实验材料与仪器
• λDNA • 标准分子量片段 marker
• EcoRⅠ,HindⅢ, BamHⅠ 等核酸内切酶（Takara）
• 琼脂糖
• TBE或TAE缓冲液(10×) • 溴化乙啶染色液(10mg/ml) • 上样液(10×)：0.25% 溴酚兰，40％(W/V)
蔗糖 水溶液或30％的甘油。
限制性核酸内切酶用量
反应体系 DNA
3μl (1μg)
buffer(10×) 2μl
ddH2O
14μl
E
1μl(5u)
总体积
20μl
厂家提供的反应缓冲液均是10倍浓度的液体，使用时 只需加反应总体积 的1/10。因为限制酶是保存于50%的甘 油中的，如加酶体积高于总体积的1/10，则反应液中甘油 浓度将大于5%，而此浓度将抑制内切酶活性。Biblioteka 验原理限制性核酸内切酶作用机制
• 在合适的反应条件下，识别一定的核苷酸 序列，使2条核糖链上特定位置的磷酸二酯 键断开，产生具有3’-OH基团和5’-P基团的 片段。
DNA的一段多聚脱氧核苷酸链
5’
磷酸二酯键
3’
• 1) 寄主控制的限制与修饰现象 • 2) 核酸限制性内切酶的类型与基本特性 • 3) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
Ⅱ型也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核 苷酸对切割双链，但这几个核苷酸对不是特异性 的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的DNA 片段具有各种单链末端。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读” 都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式:粘性 末端和平末端
大多数限制性核酸内切酶的最适反应温度是37℃。
• EcoR I 酶切位点：G'AATT_C • • BamHI 酶切位点：G’GATC_C
• HindⅢ 酶切位点: A’AGCT_T
分组
• 1、单酶切 HindIII • 2、双酶切选一组做
EcoRI+ HindIII 1*M buffer HindIII+ BamHI 1*K buffer EcoRI+ BamHI 1*K buffer
实验七 DNA限制酶酶切图谱 构建与分析
——酶切
实验目的
通过设计实验方案与实验步骤，完成 DNA片段扩增及限制酶酶切图谱构建，以 便进一步了解 DNA限制性内切酶的用途， 掌握酶切实验体系及运用限制性内切酶构 建大片段DNA图谱原理与技术。
实验原理
限制性核酸内切酶：可以识别DNA的特 异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA的一类内切酶，简称限制酶。是体外 剪切基因片段的重要工具，所以常常与核 酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起 称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于 基因组酶切图谱的鉴定。
2) 核酸限制性内切酶的类型与基本特性
即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。这三种不同类型的限
制酶具有不同的特性。
Ⅰ型能识别专一的核苷酸顺序，但是切割的核苷酸 顺序没有专一性，是随机的。
Ⅱ型能识别专一的核苷酸顺序通常是一个回文对称 结构，并在固定位置上切割双链。由于识别和切 割的核苷酸都是专一的，因此这种限制性内切酶 是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
3) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
• (1) DNA的纯度； • (2) DNA的甲基化程度； • (3) 酶切消化反应的温度； • (4) DNA的分子结构； • (5) 缓冲液的 组分。
• 酶活性的定义：
• 一个活性单位（U)，是指在50l反应体系 中，37oC的条件下，经过1小时的反应时 间，将1g DNA 完全酶解所需要的酶量。
单酶切
HindIII切割λDNA后电泳得到8个片 段．分别为23130bp, 9416bp, 6557bp, 4361bp, 2322bp, 2027bp, 564bp, 125bp。
Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker
２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机 上短暂离心。
1) 寄主控制的限制与修饰现象
限制（restriction）和修饰（modification）
是细胞的一种防卫手段.各种细菌都能合成一种或几 种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来 限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶 的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合 成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限 制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
３．Eppendorf管于３７℃金属浴中反应２ 小时。