大学课程遗传学实验实验七 DNA限制酶酶切图谱构建与分析 JC课件
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Ⅱ型也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核 苷酸对切割双链，但这几个核苷酸对wenku.baidu.com是特异性 的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的DNA 片段具有各种单链末端。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读” 都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式:粘性 末端和平末端
1) 寄主控制的限制与修饰现象
限制（restriction）和修饰（modification）
是细胞的一种防卫手段.各种细菌都能合成一种或几 种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来 限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶 的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合 成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限 制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
限制性核酸内切酶用量
反应体系 DNA
3μl (1μg)
buffer(10×) 2μl
ddH2O
14μl
E
1μl(5u)
总体积
20μl
厂家提供的反应缓冲液均是10倍浓度的液体，使用时 只需加反应总体积 的1/10。因为限制酶是保存于50%的甘 油中的，如加酶体积高于总体积的1/10，则反应液中甘油 浓度将大于5%，而此浓度将抑制内切酶活性。
实验原理
限制性核酸内切酶作用机制
• 在合适的反应条件下，识别一定的核苷酸 序列，使2条核糖链上特定位置的磷酸二酯 键断开，产生具有3’-OH基团和5’-P基团的 片段。
DNA的一段多聚脱氧核苷酸链
5’
磷酸二酯键
3’
• 1) 寄主控制的限制与修饰现象 • 2) 核酸限制性内切酶的类型与基本特性 • 3) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
３．Eppendorf管于３７℃金属浴中反应２ 小时。
大多数限制性核酸内切酶的最适反应温度是37℃。
• EcoR I 酶切位点：G'AATT_C • • BamHI 酶切位点：G’GATC_C
• HindⅢ 酶切位点: A’AGCT_T
分组
• 1、单酶切 HindIII • 2、双酶切选一组做
EcoRI+ HindIII 1*M buffer HindIII+ BamHI 1*K buffer EcoRI+ BamHI 1*K buffer
2) 核酸限制性内切酶的类型与基本特性
即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。这三种不同类型的限
制酶具有不同的特性。
Ⅰ型能识别专一的核苷酸顺序，但是切割的核苷酸 顺序没有专一性，是随机的。
Ⅱ型能识别专一的核苷酸顺序通常是一个回文对称 结构，并在固定位置上切割双链。由于识别和切 割的核苷酸都是专一的，因此这种限制性内切酶 是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
单酶切
HindIII切割λDNA后电泳得到8个片 段．分别为23130bp, 9416bp, 6557bp, 4361bp, 2322bp, 2027bp, 564bp, 125bp。
Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker
２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机 上短暂离心。
3) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
• (1) DNA的纯度； • (2) DNA的甲基化程度； • (3) 酶切消化反应的温度； • (4) DNA的分子结构； • (5) 缓冲液的 组分。
• 酶活性的定义：
• 一个活性单位（U)，是指在50l反应体系 中，37oC的条件下，经过1小时的反应时 间，将1g DNA 完全酶解所需要的酶量。
实验七 DNA限制酶酶切图谱 构建与分析
——酶切
实验目的
通过设计实验方案与实验步骤，完成 DNA片段扩增及限制酶酶切图谱构建，以 便进一步了解 DNA限制性内切酶的用途， 掌握酶切实验体系及运用限制性内切酶构 建大片段DNA图谱原理与技术。
实验原理
限制性核酸内切酶：可以识别DNA的特 异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA的一类内切酶，简称限制酶。是体外 剪切基因片段的重要工具，所以常常与核 酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起 称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于 基因组酶切图谱的鉴定。
3. 实验材料与仪器
• λDNA • 标准分子量片段 marker
• EcoRⅠ,HindⅢ, BamHⅠ 等核酸内切酶（Takara）
• 琼脂糖
• TBE或TAE缓冲液(10×) • 溴化乙啶染色液(10mg/ml) • 上样液(10×)：0.25% 溴酚兰，40％(W/V)
蔗糖 水溶液或30％的甘油。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读” 都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式:粘性 末端和平末端
1) 寄主控制的限制与修饰现象
限制（restriction）和修饰（modification）
是细胞的一种防卫手段.各种细菌都能合成一种或几 种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来 限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶 的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合 成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限 制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
限制性核酸内切酶用量
反应体系 DNA
3μl (1μg)
buffer(10×) 2μl
ddH2O
14μl
E
1μl(5u)
总体积
20μl
厂家提供的反应缓冲液均是10倍浓度的液体，使用时 只需加反应总体积 的1/10。因为限制酶是保存于50%的甘 油中的，如加酶体积高于总体积的1/10，则反应液中甘油 浓度将大于5%，而此浓度将抑制内切酶活性。
实验原理
限制性核酸内切酶作用机制
• 在合适的反应条件下，识别一定的核苷酸 序列，使2条核糖链上特定位置的磷酸二酯 键断开，产生具有3’-OH基团和5’-P基团的 片段。
DNA的一段多聚脱氧核苷酸链
5’
磷酸二酯键
3’
• 1) 寄主控制的限制与修饰现象 • 2) 核酸限制性内切酶的类型与基本特性 • 3) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
３．Eppendorf管于３７℃金属浴中反应２ 小时。
大多数限制性核酸内切酶的最适反应温度是37℃。
• EcoR I 酶切位点：G'AATT_C • • BamHI 酶切位点：G’GATC_C
• HindⅢ 酶切位点: A’AGCT_T
分组
• 1、单酶切 HindIII • 2、双酶切选一组做
EcoRI+ HindIII 1*M buffer HindIII+ BamHI 1*K buffer EcoRI+ BamHI 1*K buffer
2) 核酸限制性内切酶的类型与基本特性
即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。这三种不同类型的限
制酶具有不同的特性。
Ⅰ型能识别专一的核苷酸顺序，但是切割的核苷酸 顺序没有专一性，是随机的。
Ⅱ型能识别专一的核苷酸顺序通常是一个回文对称 结构，并在固定位置上切割双链。由于识别和切 割的核苷酸都是专一的，因此这种限制性内切酶 是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
单酶切
HindIII切割λDNA后电泳得到8个片 段．分别为23130bp, 9416bp, 6557bp, 4361bp, 2322bp, 2027bp, 564bp, 125bp。
Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker
２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机 上短暂离心。
3) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
• (1) DNA的纯度； • (2) DNA的甲基化程度； • (3) 酶切消化反应的温度； • (4) DNA的分子结构； • (5) 缓冲液的 组分。
• 酶活性的定义：
• 一个活性单位（U)，是指在50l反应体系 中，37oC的条件下，经过1小时的反应时 间，将1g DNA 完全酶解所需要的酶量。
实验七 DNA限制酶酶切图谱 构建与分析
——酶切
实验目的
通过设计实验方案与实验步骤，完成 DNA片段扩增及限制酶酶切图谱构建，以 便进一步了解 DNA限制性内切酶的用途， 掌握酶切实验体系及运用限制性内切酶构 建大片段DNA图谱原理与技术。
实验原理
限制性核酸内切酶：可以识别DNA的特 异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA的一类内切酶，简称限制酶。是体外 剪切基因片段的重要工具，所以常常与核 酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起 称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于 基因组酶切图谱的鉴定。
3. 实验材料与仪器
• λDNA • 标准分子量片段 marker
• EcoRⅠ,HindⅢ, BamHⅠ 等核酸内切酶（Takara）
• 琼脂糖
• TBE或TAE缓冲液(10×) • 溴化乙啶染色液(10mg/ml) • 上样液(10×)：0.25% 溴酚兰，40％(W/V)
蔗糖 水溶液或30％的甘油。