凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
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• 一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。
三. 实验试剂和器材
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400
3. 实验器材
• 垂直板电泳装置 • 直流稳压电源 • 移液管
• 滤纸 • 微量注射器 • 大培养皿
各部分凝胶配制
分离胶(10%.5ml)
浓缩胶(5%.3ml)
H2O
2.6ml
Acr
30%, 1.7ml
0.7ml 10%, 1.5ml
Buffer 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml
根据说明书处理标准蛋白 样品：称3mg样品，加2 ml蒸馏水溶解。
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。
（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）测定蛋白质分子量
授课教师：周杰
一. 实验目的
• 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量
的原理。
• 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量
及染色鉴定。
二 .实验原理
• 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这
种现象称为电泳。
• 电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。 • 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄
胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?
注意事项
• 丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的
最大暴露量不超过0.5μg/kg，皮肤接触可 致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作 机能失调、四肢无力等。
• 丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤 • 不要接触皮肤，戴手套、口罩操作
注意事项
• 没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近 • 一定要催化充分，使之完全聚合 • 集中处理，实验中全部的胶由专门受过训
以每个蛋白标准的分子量对数对它的 相对迁移率作图得标准曲线，量出未 知蛋白的迁移率即可测出其分于量， 这样的标难曲线只对同一块凝胶上的 样品的分子量测定才具有可靠性。
六.思考题
• 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完
后,需在其上加一层水,为什么?
• 样品溶解液中各种试剂的作用是什么? • 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩
二. 实验原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
• 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰
凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成 亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基 或单条肽链的MW。
• 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常
或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白） 以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。
沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。 ※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下
沉时会发生扩散. ※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.
四. 实验过程
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒
定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边 缘约5mm时，停止电泳。
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
二. 实验原理
• SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别
是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个：
1) 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于
1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3
层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机 械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而 产生的对流。
• 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃
珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树 脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+
溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g， 加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
5. 在上槽内加入缓冲液后,拔出样梳。
※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.
6、加样（1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入
10µl 2倍样品缓冲液，上样量为10µl。 （2）取10µl样品溶液，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样
量分别为5µl和3µl。
7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在
四. 实验过程
※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝 空气
※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的 界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好 浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速 插入样梳,静置40分钟.
※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底 需水平.
四. 实验过程
2) 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液
离子强度较低，通常是10～100mmol/L
3) 二硫键是否完全被还原
二. 实验原理
• 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全
打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用 SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还 原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋 白质溶解而与SDS定量结合。
练的人收集到一起，在一个特殊标明的容 器中保存，并进一步催化使之反应完全， 最后送交学校危险品仓库，统一处理。
注意事项
• 聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心
操作，因为其中可能留下少量没有聚合的 单体。
• 保护实验仪器，不得损坏。
T a b 100 (％ m
C b 1001％ ab
做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。
10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱
色，直到蛋白质区带清晰。
※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.
.
11.实验结果分析。
五.分析计算
绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率：
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
10%SDS
0.05ml
0.03ml
10%Ap
0.05ml
0.03ml
TEMED
5µl
4µl
四. 实验过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的 锥形瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5 厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶 前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次 性Βιβλιοθήκη Baidu成,避免产生气泡.
加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏 水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水 定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定 容至100ml。
凝胶浓度的计算
• 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔
径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双 丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分 浓度。T与C的计算公式是：
C
b a＋b
10（0 ％）T
a b 100 (％）
m
• 上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，
二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中
引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分 子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负 电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量。
m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富 有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。
三. 实验试剂和器材
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400
3. 实验器材
• 垂直板电泳装置 • 直流稳压电源 • 移液管
• 滤纸 • 微量注射器 • 大培养皿
各部分凝胶配制
分离胶(10%.5ml)
浓缩胶(5%.3ml)
H2O
2.6ml
Acr
30%, 1.7ml
0.7ml 10%, 1.5ml
Buffer 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml
根据说明书处理标准蛋白 样品：称3mg样品，加2 ml蒸馏水溶解。
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。
（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）测定蛋白质分子量
授课教师：周杰
一. 实验目的
• 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量
的原理。
• 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量
及染色鉴定。
二 .实验原理
• 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这
种现象称为电泳。
• 电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。 • 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄
胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?
注意事项
• 丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的
最大暴露量不超过0.5μg/kg，皮肤接触可 致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作 机能失调、四肢无力等。
• 丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤 • 不要接触皮肤，戴手套、口罩操作
注意事项
• 没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近 • 一定要催化充分，使之完全聚合 • 集中处理，实验中全部的胶由专门受过训
以每个蛋白标准的分子量对数对它的 相对迁移率作图得标准曲线，量出未 知蛋白的迁移率即可测出其分于量， 这样的标难曲线只对同一块凝胶上的 样品的分子量测定才具有可靠性。
六.思考题
• 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完
后,需在其上加一层水,为什么?
• 样品溶解液中各种试剂的作用是什么? • 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩
二. 实验原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
• 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰
凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成 亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基 或单条肽链的MW。
• 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常
或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白） 以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。
沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。 ※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下
沉时会发生扩散. ※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.
四. 实验过程
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒
定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边 缘约5mm时，停止电泳。
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
二. 实验原理
• SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别
是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个：
1) 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于
1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3
层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机 械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而 产生的对流。
• 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃
珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树 脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+
溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g， 加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
5. 在上槽内加入缓冲液后,拔出样梳。
※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.
6、加样（1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入
10µl 2倍样品缓冲液，上样量为10µl。 （2）取10µl样品溶液，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样
量分别为5µl和3µl。
7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在
四. 实验过程
※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝 空气
※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的 界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好 浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速 插入样梳,静置40分钟.
※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底 需水平.
四. 实验过程
2) 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液
离子强度较低，通常是10～100mmol/L
3) 二硫键是否完全被还原
二. 实验原理
• 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全
打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用 SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还 原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋 白质溶解而与SDS定量结合。
练的人收集到一起，在一个特殊标明的容 器中保存，并进一步催化使之反应完全， 最后送交学校危险品仓库，统一处理。
注意事项
• 聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心
操作，因为其中可能留下少量没有聚合的 单体。
• 保护实验仪器，不得损坏。
T a b 100 (％ m
C b 1001％ ab
做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。
10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱
色，直到蛋白质区带清晰。
※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.
.
11.实验结果分析。
五.分析计算
绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率：
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
10%SDS
0.05ml
0.03ml
10%Ap
0.05ml
0.03ml
TEMED
5µl
4µl
四. 实验过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的 锥形瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5 厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶 前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次 性Βιβλιοθήκη Baidu成,避免产生气泡.
加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏 水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水 定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定 容至100ml。
凝胶浓度的计算
• 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔
径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双 丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分 浓度。T与C的计算公式是：
C
b a＋b
10（0 ％）T
a b 100 (％）
m
• 上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，
二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中
引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分 子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负 电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量。
m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富 有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。