SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS-PAGE测定蛋白质分子质量
3、电泳条件：电压150-180伏（时间50分钟左右） 4、剥胶染色：15分钟 5、脱色：20-30分钟换一次脱色液，换4次，再用 蒸馏水浸泡10-15分钟。 6、凝胶成像进行分析（生化仪器室465室） 复习与思考： 电泳技术的流程，根据本实验分析实验技术的关 键点？
相对迁移率和分子量计算 LogM=a-bRf
相对迁移率(Rf)＝蛋白移动的距离/染料移动的前沿距离
以Rf为横坐标,已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标,在半对数坐标纸上 绘图,由标准曲线中查出样品分子量。
SDS-PAGE
实验流程（SDS-PAGE)
电泳技术流程： 制备载体（制胶）→加样→电泳→剥胶→染色→ 脱色→测定结果(凝胶成像） 常用载体制备： 丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺→（催化剂） →聚丙 烯酰胺凝胶 SDS的作用：球形蛋白+ SDS →长棒形蛋白 （线状） 样品处理液（巯基乙醇）-S-S- →-HS,SH聚丙烯酰胺凝胶作用：分子筛
二、实验方法
实验方法： 样品处理：100uL样品+100uL处理液混匀(沸水浴加热5分 钟) 1、灌制分离胶 ： 加入试剂如下：两块14％ 的分离胶，需12mL液体（一组） 一份） A液 5.6mL B液 3.0mL 蒸馏水 3.4mL（超纯水） 10％ 过硫酸铵 0.1ml（最后加）（通风柜） TEMED 0.01mL（通风柜） 混合后，用小滴管加入制胶室中，加入高度距短玻板 1.5cm左右，缓慢加入蒸馏水压平，聚合约30分钟。
实验设计思路
SDS-PAGE实验设计： 1、浓缩胶（堆积胶）浓缩效应5% 由三个不连续组成： 凝胶浓度不连续 凝胶缓冲液pH不连续（pH6.8;pH8.8) 凝胶缓冲液负离子不连续：氯离子，甘氨酸 根负离子 2、分离胶（14%）
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。
下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。
SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。
相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。
蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。
通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。
这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。
SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。
（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。
这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。
（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。
随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。
（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。
目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。
SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。
其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。
通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。
二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。
通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。
2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。
3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。
4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。
5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。
打开电源，调整电流和电压，开始电泳。
6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。
7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。
通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。
此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。
5 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量一、目的了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。
二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。
本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。
三、试剂和器材（一）试剂1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。
2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。
18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。
3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。
6gTris,少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。
4. 10%SDS，室温保存。
5. 两类样品缓冲液：2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml甘油 2.0 ml质量浓度10%SDS 4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇 1.0 ml总体积10 ml6. 电极缓冲液，pH8.3。
Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。
SDS-PAGE实验报告
生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。
2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。
最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。
实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。
实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。蛋白 质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中 的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复 合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的 大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁 移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒 的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下 端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配 制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶 模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并 结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质），形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
剥胶示意图
七、染色和脱色
倾出固定液，加入染色液。染色过夜。 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。数小时 换一次脱色液，直至背景清晰，约需一昼夜。
八、Mr的计算
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mr：
蛋白质样品迁移距离(cm) 相对迁移率mr = 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
四、实验操作流程
1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 (2) 将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿 用手接触灌胶面的玻璃。 (3) 将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面 对上贮槽。 (4) 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对 角线的方式旋紧螺丝帽。 (5) 竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加 入已融化的 1% 琼脂 ( 糖 ) 。其目的是封住空隙，凝固后的琼 脂(糖)中应避免有气泡。
三、实验用品
仪器：垂直电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水 浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。 材料：人血清；原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg· ml-1样 品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。 试剂： （1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH8.9）：取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g，用无离子水溶解后定容至100mL。 （2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）：取1mol/L盐酸48mL， Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100mL。 （3）30%分离胶贮液：丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中， 4℃保存。
4．样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓 度为0.5~1mg/mL，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻 盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100℃沸水浴 中加热3min，取出冷却后加样。 一般加样体积为10－15μL（即2－10μg蛋白质）。 如样品较稀，可增加加样体积至25 L。用微量注射器小 心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有 凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。
SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量
实验 6 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的学习并掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法；掌握垂直板电泳的操作方法；运用SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。
实验原理1、在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。
根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。
2、在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质-SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3、当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：㏒10Mr = －b·m R+ K（式中：Mr为蛋白质分子量，m R为相对迁移率，b为斜率，K为截距。
在条件一定时，b 和K均为常数。
）若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
实验步骤1.装板：将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。
将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上。
（夹子离梳子底边约2mm）2. 制备分离胶：在烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。
项目分离胶的配制（10ml）30% 丙烯酰胺（ml） 3.4分离胶缓冲液，pH8.8（ml） 2.4H2O （ml） 4.110% 过硫酸铵（ml）0.1TEMED（μl）10凝胶液的灌注和聚合：将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，然后加乙醇。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
• 聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种： • （1）化学聚合：通常采用过硫酸铵(AP)为催化剂， 四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在TEMED 催化下，过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、 活化形成自由基丙烯酰胺，从而引发聚合作用。 • （2）光聚合：通常采用核黄素作催化剂，核黄素 在光照下光解成无色基，后者再被氧化成自由基 而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大，而且 随时间延长而逐渐变小，不太稳定。化学聚合的 凝胶孔径较小，且各次制备的重复性好。故一般 采用化学聚合。
四 电泳
• 将上槽接负极，下槽接正极，打开电源， 开始时将电流控制在15～20 mA,待样品进 入分离胶后，改为30～50 mA。待蓝色染 料迁移至下端约1～1.5 cm时，停止电泳， 约需1～2小时。
五 剥胶
取下凝胶模子，将凝胶片取出，滑入一白 瓷盘或大培养皿内，在染料区带的中心插 入细铜丝作为标志。
六 染色和脱色
染色 用一块胶，另一块胶用于转膜。 加入染色液，染色45分钟。 脱色 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。 20～30min换一次脱色液，2～3次后可初步 观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景 清晰。
七 Mr的计算
• 通常以相对迁移率(mr)来表示迁移率。相对迁 移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带 中心及铜丝与凝胶顶端的距离，按下式计算： • 相对迁移率(mr) = 样品迁移距离(cm)／染料 迁移距离(cm)。 • 以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率 作图，得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移 率，从标准曲线上查出其相对分子质量
牛血清 样品2 样品1 蛋白 样品1 marker 样品2 牛血清
第一组加样
第二组加样
第二块胶加样顺序与第一块胶相同
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的：通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。
二、实验原理：SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。
在该技术中，蛋白质样品与SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂混合后，加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合，形成具有负电荷的复合物。
这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。
蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶，即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散，形成连续的蛋白质稜。
然后，电泳阶段开始，电场通过凝胶，带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。
三、实验步骤：1.准备SDS-电泳胶液：根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液，即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。
2. 准备样品：取相应的蛋白质样品，如细胞裂解液，将其与试剂R （含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺）和Laemmli试剂混合，以加热破坏蛋白质的二级结构。
3.堆胶：将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中，留出足够的空间来注入分离胶液。
4.加载样品：在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。
5.电泳：将电泳槽连接到电源，调节电压，使电流保持稳定。
首先进行堆胶阶段，然后切换到电泳阶段，直至蛋白质移动到凝胶底部。
6. 凝胶染色：取下凝胶，用凝胶染色剂对凝胶进行染色。
一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。
四、实验结果：根据实验步骤描述的方法进行实验后，我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带，每条条带代表一个蛋白质。
条带的颜色越深，表示其含量越多。
通过与分子量标记的对照，可以确定蛋白质的相对分子质量。
五、实验讨论与分析：根据实验结果，我们可以推断蛋白质的相对分子质量。
相对分子质量可以通过标准曲线法来计算，即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。
通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点：能够同时分离多个蛋白质；能够对蛋白质进行集中分析；精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
实验十 SDS-PAGE测定蛋白质分子量一、实验目的1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2.掌握垂直板电泳的操作方法。
3.运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二、实验原理1.带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。
其中区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳早期使用不同的支持介质有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
2.PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS 能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMr=K-bX，式中：Mr为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并 结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质），形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
7.5
10% SDS
0.3
TEMED 10%过硫酸铵
总体积
0.03 0.1 30ml
二、凝胶的制备
1、分离胶的制备 将所配制的凝胶溶液沿着凝胶的长玻璃片的内 面用细长头的滴管加至长、短玻璃片的窄缝内， 加胶高度距样品槽模板下缘约2 cm。用滴管沿玻 璃片内壁加一层蒸馏水（用于隔绝空气，使胶面 平整），约30-60 min凝胶完全聚合，用滴管吸去 分离胶胶面的水封层，并用无毛边的滤纸片吸去 残留的水液。
五、电泳
将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开 始时将电流调为20 mA，待样品进入分离胶后，改 为50 mA。待蓝色染料迁移至下端约2 cm时，停止 电泳，约需3-4 h。
浓缩胶浓缩 示意图
六、剥胶和固定
取下凝胶模子，将凝胶片取出，滑入一大培 养皿内，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在 两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿 标记。加入固定液（应没过凝胶片），固定2 h或 过夜。
以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图， 得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线 上查出其相对分子质量。标准蛋白质相对分子质量从大到 小依次为116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4 KDa。
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SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。
二、实验目的1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2.掌握垂直板电泳的操作方法。
3.运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
三、实验原理1.电泳带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。
在一定的电场强度下，分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大小、构型和带电量的大小。
2.PAGE聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。
PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。
PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。
PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。
连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
3.SDS-PAGE基本原理SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。
使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。
解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。
蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。
而与其所带电荷的性质无关。
当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW = K - bm将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。
只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。
四、实验器材和材料试剂仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。
原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5-1mgml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
试剂:(1)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 PH8.9):取 1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至 100mL；(2)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液 PH6.7):取 1mol/L盐酸48mL,Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至 100mL；(3)30%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺(Acr) 30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4保存；(4)10%浓缩胶贮液:称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存；(5)10%SDS溶液:SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解；(6)1%TEMED;(7)10%过硫酸铵(AP):现用现配；(8)电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3):称取Tris6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L；(9)样品溶解液:取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL(遇液体样品浓度增加一倍配制)。
用来溶解标准蛋白质及待测固体；(10)染色液:0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可；(11)脱色液:75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。
五、实验操作1.制胶玻板的清洗用海绵和洗涤剂轻柔地清洗，严禁使用刷子和颗粒状的去污粉与洗衣粉，完全冲洗干净后烘干。
2.垂直板电泳槽3.凝胶的制备①分离胶的制备配制12%分离胶。
在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl,pH8.8）2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶储备液4.0ml，10% 过硫酸铵50ul和TEMED 10ul。
由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝，留出梳齿的齿高加1cm的空间停止灌胶，小心覆盖一层蒸馏水，37℃烘箱下聚合（约30 min）。
待分离胶聚合完全后，除去覆盖的蒸馏水。
②浓缩胶的制备配制5%浓缩胶。
在烧杯中依次加入重蒸水2.92ml,浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml,凝胶储备液0.8ml，10% 过硫酸铵25ul和TEMED 10ul。
由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝，灌满后小心插入梳齿，避免混入气泡，37℃烘箱下聚合（约30 min）。
4.蛋白质样品的处理①标准蛋白质样品的处理低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400牛血清白蛋白 MW=66,200牛碳酸酐酶 MW=31,000胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400后，沸水浴中加热3-5min后上样。
②样液的准备用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml的离心管中，再加入50ul上样缓冲液，混匀后沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。
5.加样用移液器分别取5 ml样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。
6.电泳将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，打开电泳仪开关，设置电压为200V，电泳60mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电泳，关闭电源。
7.染色与脱色电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。
加入染色液染色60 mins，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。
8.结果处理量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR：六、实验结果及数据处理1.实验现象：脱色结束后，经观察可知，点有maker的孔跑出来的有5个清晰笔直的条带，迁移率由低到高排列这5个条带分别是分别是兔磷酸化酶B、牛血清白蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制剂、鸡蛋清溶菌酶。
点有血清蛋白的点样孔跑出的结果在分离胶与浓缩胶交界处出现一大团成分未知着色团，经老师讲解并且上网查阅资料得知这种现象可能是所谓的“鬼带”现象。
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀。
出现这种现象主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。