SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
(4)聚丙烯胺凝胶的生成：
四、实验步骤：
1、贮液的配制：
2、凝胶的制备： 2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备：
3、蛋白样品的制备：
4、装槽、点样： 5、电泳： 6、剥胶、染色、脱色：
2.1 胶板的制备：
3、植物组织蛋白质提取：
称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加
第二、不连续系统中的三种物理效应：
①电荷效应：
②分子筛效应: ③浓缩效应:
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶)
2、仪器、器皿：
(1)垂直板电泳装置
（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (2)稳流稳压电泳仪； （4）电子天平； （6）瓷盘、微量进样器； （3）高速冷冻离心机； （5）电冰箱；
②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光
解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发 生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制 备大孔径的浓缩胶。
5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；
⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
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5.“SDS — 聚丙稀酰胺凝胶电 泳法测定蛋白质分子量”一实验的开 设达到了与国内同类院校相当的较高 水平。
对本科生的实验教学、本科生的 论文设计、研究生的高级生化实验等 方面都充实了内容。
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（二）特点：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二 烷基磺酸钠）。
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蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。
蛋白质丧失了原有的电荷状态形成 仅保持原有分子大小为特征的负离子团 块，降低或消除了各种蛋白质分子之间 天然的电荷差异，因此在进行电泳时，
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。
区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。
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区带电泳使用不同的支持介质，有
滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀 粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和 琼脂糖凝胶。
球蛋白（去年完成的基金项目）
（三）纯化免疫球蛋白G DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G子量（ 连续四个单项实验）。
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（1）制胶（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度）
A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干 净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。
开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS的性质与作用
十二烷基磺酸钠(SDS) Sodium dodecyl sulphate CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+
SDS的性质与作用
Protein Strand
Denature
-
SDS Molecules
-
SDS的性质与作用
蛋白质变性
0.1-1% SDS 0.1 M 2-巯基乙醇 蛋白质变与SDS分子按比例结合 1 ：1.4
插入样品梳加入电极缓冲加入电极缓冲液液ph83ph83浓缩胶浓缩胶ph86ph86通电通电分离胶分离胶ph88ph88加入样品加入样品上样及电泳开始电流恒定在开始电流恒定在10ma10ma当进入分离胶后改为当进入分离胶后改为20ma20ma溴酚蓝距凝胶边缘约溴酚蓝距凝胶边缘约5mm5mm时停止电泳
SDS-聚丙烯酰胺
制备浓缩胶
加入浓缩胶溶 液 pH 8.6
分离胶 pH 8.8
通电
加入电极缓冲 液pH 8.3
上样及电泳
加入样品
浓缩胶 pH 8.6
开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA， 溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
分离胶
pH 8.8
凝胶板剥离与染色
电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
凝胶电泳
生化社团 吕炎
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
测定蛋白质分子量
一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 四、结果分析 五、注意事项
一、实验目的
学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测 定蛋白质分子量的原理。 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的 操作技术。
二、实验原理
SDS的性质与作用 聚丙烯酰胺凝胶的性质
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种蛋白质分析方法，常用于测定蛋白质的相对分子量。
其原理是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电，使蛋白质在凝胶中按照相对分子量大小进行分离。
具体原理如下：
1. SDS：SDS是一种表面活性剂，它可以与蛋白质发生结合，使得所有蛋白质带有相同的电荷密度。
2. 蛋白质解不性：在SDS存在条件下，蛋白质发生解性，其中SDS会形成不溶解的复合物，使蛋白质具有均一负电荷。
3. 凝胶电泳：将SDS处理后的蛋白质样品加于聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上，施加电场使蛋白质迁移。
4. 分离：由于凝胶电泳胶阻力不同，蛋白质经过一段时间后在凝胶上分离成锥形区带。
5. 相对分子量测定：在同一凝胶中，已知相对分子量已知的标准蛋白质样品与待测蛋白质样品进行分析，通过对比标准蛋白质样品的迁移距离和待测蛋白质样品的迁移距离，可以推算出待测蛋白质样品的相对分子量。
需要注意的是，由于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是以相对分子量进行分析的，所以对于蛋白质的准确分子量测定，还需结合其他方法如质谱等进行综合分析。
生物化学实验-SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
实验原理
电泳：是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即 向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据 各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷 多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 区带电泳是样品物质在一惰性支持物上上进行电 泳的过程。因电泳后，样品不同组分形成带状区 间，故称区带电泳。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质分子 的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳 迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在 15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关 系，符合下列方程式：
lg MW=-b·mR+K MW为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，k为截 距。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。未知蛋白质的相同条件下进行电泳，根 据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
实验步骤
凝胶的制备 蛋白质样品的处理 加样：用微量注射器依次在各个样品槽内加样，各加
10～15μl（含蛋白质10～15μg），稀溶液可加20～30μl
电泳凝胶配方：
30.8%Acr-Bis
1.5mol/l Tris(pH8.9)
0.5mol/l Tris(pH6.7) ddH2O水
10%SDS
10%过硫酸铵AP
3、样品处理与加样 ⑴样品制备
取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50μl，分别放入1.5ml离心管中， 12000r/min离心10分钟，上清即为电泳样品。 ⑵样品处理
将离心后的上清各取20ul，加入等体积“2×蛋白质样品溶解液”，100℃保温 3分钟，取出冷却后，12000r/min离心2min,取上清直接加样。 ⑶加样
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
四. 实验过程
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒
定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边 缘约5mm时，停止电泳。
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱 色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.
•
二. 实验原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH ， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
三.
实验试剂和器材
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融 化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏 水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水 定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定 容至100ml。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定【实验目的】1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。
2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。
【实验原理】SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。
2.实验试剂⑴ 2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
⑵ 1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量实验数据：标准蛋白质条带第一条第二条第三条第四条第五条溴酚蓝前沿距离/cm 4.70距离/cm 0.50 0.95 1.60 2.10 3.95 相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84 分子量Mr 97400 66200 43000 31000 14400LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16样品 1 2 3溴酚蓝前沿/cm 4.90 4.80 4.60样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70相对迁移率mr 0.86 0.25 0.37标准曲线：y=5.05-1.10x结果：样品 1 2 3Mr 12706 59566 43954mr 4.104 4.775 4.643一. 实验目的和要求1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2 掌握垂直板电泳的操作方法。
3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二 .实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
(生物化学)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
ml
4.0 2.5 0.1 0.1 3.3 0.006
灌注分离胶（水封，室温30分钟左右凝固） *丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性神经毒性 ——手套
3. 浓缩胶的制备和灌注
5%浓缩胶（10ml）-3ml/组
试剂
ml
Acr/Bis 30%
1.7
0.5mol/L Tris-HCl Ph 6.8
2.5
在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和 夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧
夹子。
玻璃夹放在制胶架上，薄玻璃朝向自己。按弹 簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内分别
灌制分离胶和浓缩胶，放上梳子，待胶凝固。2. 分离胶的制备和灌注
12%分离胶的制备（10ml）-5ml/组
试剂
Acr/Bis 30% 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8 10% SDS 10% AP H2O TEMED
• 电泳：80V，15-20min（浓缩胶）；100V（分 离胶）至指示剂距凝胶底边1cm。
6. 染色、脱色
染色：凝胶于0.25% 考马斯亮蓝染 色20min。
脱色：于脱色液 （7.5%冰乙酸， 5%甲醇）中脱 色至蛋白带清 晰。
蒸馏水煮沸5-10’
7. 照相、分析结果
➢凝胶成像系统照相 ➢绘制标准曲线 ➢计算样品蛋白的分子量
兔磷酸化酶B（97400） 牛血清白蛋白（66200）
兔肌动蛋白（43000） 牛碳酸酐酶（31000）
胰蛋白酶抑制剂（20100） 鸡蛋清溶菌酶（14400）
8. 思考题
➢ 浓缩胶与分离胶的作用机制各是什么? ➢ 分离胶灌注完毕，以蒸馏水封闭的作用是
什么? ➢ 根据实验结果，分析实验误差的可能原因。 ➢ 如何配置1L 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 缓
生化实验七 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验七 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量一、 实验原理了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量 二、实验原理带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下，移动的速度是根据此公式，在同一电场强度(v ／d)和电极缓冲液(η)条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6πr)。
若使各蛋白质成分的带电量(q)相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6πr)。
1967年Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate ，SDS)，不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。
加入SDS 之所以能获得如此的效应，是因为SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。
同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的SDS 相结合[溶液中的SDS 总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS 按1:1.4(W ／W)的比例结合]，形成SDS 一蛋白质复合物。
其结果： (1)由于SDS 解离后带有很强的负电荷，致使SDS 一蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
(2)SDS 与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。
不同SDS 一蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18nm ，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。
这样SDS 一蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。
需要注意的是：为使SDS 与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开。
因此，在用SDS 处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。
SDS-PAGE
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量一、原理天然蛋白质在电场中泳动的迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量的大小以及分子的形状等因素。
1967年Shapiro等人发现，在有阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）存在时，蛋白质的迁移率则主要取决于它的分子量的大小，而与其所带电荷的多少以及形态无关。
1969年Weber和Osborn用此法测定出了约40种蛋白质的迁移率，结果证明，蛋白质的迁移率和其分子量的对数呈直线关系：1gM W= -bm +k式中：M W为分子量；m为迁移率；b为斜率；k为常数实验证明，分子量在12 000~200 000之间的蛋白质，用此法测验得的分子量，与用其它方法测得的相比，误差一般在±10%以内，重复性高。
此方法还具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优点，现已成为测定某些蛋白质分子量的常用方法。
应用此法测分子量，是将几种已知分子量的标准蛋白混合物与待测样品同时进行SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得各样品的相对迁移率。
以标准蛋白质的分子量为纵坐标，相对迁移率为横坐标，在半对数坐标纸上绘出标准曲线（见图7-1）。
（若以普通坐标纸作图，则纵坐标应取蛋白分子量的对数值。
）然后根据待测样品的相对迁移率，即可从标准曲线上求得其分子量。
加入含有巯基乙醇的SDS后，巯基乙醇打开蛋白质分子中的二硫键，而SDS能打开蛋白质分子的氢键和疏水键，使蛋白质变性为松散的线状。
同时大多数蛋白质都能按每个氨基酸与固定量的SDS结合（当溶液中的SDS总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般是高达10倍以上时，大多数蛋白质与SDS按1：1.4（W/W）图7-1的比例结合，形成SDS—蛋白质复合物，其结果：①由于SDS带有很强的负电荷，所以使SDS—蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别；②SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质的原有的构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似长椭圆柱形。
06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 . 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。
2 . 熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动, 称为电泳。
不同蛋白质分子具有不同的大小、形状, 在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量, 因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同, 二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动, 经过一定的时间后得以分离, 这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时, 蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小, 形状和所带的电荷量有关, 为了使其只与蛋白质分子的大小有关, 从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量, 就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。
SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称, 它是一种阴离子表面活性剂, 加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上（在一定条件下, 大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质）, 使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷, 其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量, 从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别, 使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素, 于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线, 可求得未知物的分子量。
SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明, 它们在水溶液中的形状, 近似于雪茄烟形状的长椭园棒, 不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? , 即 1.8 nm ）, 而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
实验六报告：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量1.研究背景及目的根据自然界中普遍存在的电泳现象，以及实践应用的需求，科学家不断完善了电泳技术，从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。
电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。
蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义，比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病（肾小管损坏、多发性骨髓瘤等）。
这种需要促进了相关技术的发明。
具体过程见原理。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。
从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。
1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用[1]。
通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。
SDS与蛋白质分子结合，不仅使蛋白质分子带上大量的负电荷，而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。
因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率主要取决于其分子大小。
由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。
通过本次实验，学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法，进一步学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。
2.原理由于技术的发展，理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值，但是实际操作过于繁琐，且生物大分子的数量级是KDa，实际中往往不需要特别精确。
所以转向寻求其它方法，如果两种性质具有相关性，就会有相关理论基础和技术，发现分子量与迁移速率有关，于是寻找相关方面的技术。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
03 结果分析
CHAPTER
蛋白质分子量的计算
蛋白质分子量计算
根据已知标准蛋白的迁移率和分子量 ，通过线性回归分析，计算未知蛋白 的分子量。
校准曲线的建立
使用已知分子量的标准蛋白，在相同 条件下进行电泳，绘制迁移率与分是指凝胶能够区分相邻蛋白条带的能力，高分辨率的凝胶能够清晰区分 相近分子量的蛋白质。
电泳的原理
电场作用
01
在电场的作用下，带负电荷的SDS-蛋白质复合物向正极移动。
分离效果
02
不同分子量的蛋白质在电场中移动速度不同，从而实现分离。
检测方法
03
电泳结束后，可以通过染色、银染或荧光染色等方法检测分离
的蛋白质条带，并可根据染色深浅判断蛋白质含量。
02
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 的实验步骤
电泳
01
02
03
安装电极
将凝胶放置在电泳槽中， 确保电极与凝胶接触良好。
加样
将准备好的样品加入到凝 胶的样品孔中。
开始电泳
接通电源，开始电泳。确 保电流稳定，避免电流过 大或过小对实验结果的影 响。
染色和脱色
染色
在电泳结束后，将凝胶取出，放 入染色液中染色，使蛋白质条带 呈现可见的着色。
脱色
将染色后的凝胶放入脱色液中脱 色，去除背景颜色，使蛋白质条 带更加清晰可见。
分离度
分离度是指凝胶中各蛋白条带之间的分离程度，好的分离度能够使各蛋白条带 完全分开，便于准确分析。
实验误差和注意事项
实验误差来源
实验误差可能来源于电泳过程中电压、电流的波动、染色过程中染料的浓度和染 色时间等因素。
注意事项
为确保实验结果的准确性，应使用高质量的电泳试剂和设备，严格控制实验条件 ，并遵循标准化操作程序。同时，应定期对标准蛋白进行检测，以确保标准曲线 的准确性。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
. 样作为实验组来 同上项目三 SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）测定蛋白质分子量一实训目的1 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作步骤2 学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理 二实训原理用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein ），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。
再与标准样品对照即可确定各区带的成分。
要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。
SDS 能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成 S DS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在 1.2X104～16.5X104 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。
LogMW ＝K －bm(LogMW 为分子量的对数，K 、b 为常数，m 为迁移率)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋 白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量 三、实训器材序号 1 2 3 4 56 设备名称垂直板电泳槽及附件 直流稳压稳流电泳仪 微量进样器玻璃注射器玻璃平板电炉 规格，型号可变压数量1 12 1 41序 试剂纯度、浓度 作用配 制 需要工具 需要工具号 方法1低分子量标 准蛋白质样 2mg /ml以标准样品为 对照即可确定 见 表 格 下 水浴锅、小烧 杯，玻璃棒 本样品各区带的 方成分210~20mg/ml水浴锅、小烧品3浓缩胶缓冲 液测定蛋白质的 分子量呈弱酸性，使甘 同上 氨酸解离很少， 在电场作用下， 涌动效率低，二 氯离子含量高，杯，玻璃棒天平、容量 瓶、棕色试剂 瓶保 证 电 泳 的 作为催化剂，产去掉其电荷效SDS加速剂，可催化4分离胶缓冲 液形成较高的电 位梯度压着蛋 白质聚集在一 起，凝缩为一狭 小区带。
SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量
实验二十三SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量一、目的学习和掌握垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、方法, 并应用该方法测定蛋白质分子量。
二、原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时, 其迁移率取决于它所带净电荷、分子大小、形状等因素。
1967 年Shapiro 等人发现, 如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS) , 则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量, 而与其所带电荷多少和形状无关。
SDS 是一种很强的阴离子表面活性剂。
SDS 以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合,形成蛋白质- SDS 复合物。
SDS 与大多数蛋白质的结合是高密度的, 其重量比为l .4∶1 , 由于十二烷基硫酸根带负电, 使各种蛋白质的SDS 复合物都带上相同密度的负电荷, 而且带电量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量, 从而消除或降低了不同蛋白质分子之间所带净电荷对电泳迁移率的影响。
SDS 与蛋白质结合后, 还引起了蛋白质构象的改变。
根据流体力学的研究, SDS - 蛋白质复合物具有扁平而紧密的椭圆形棒状结构, 不同蛋白质的SDS 复合物的短轴长度都一样, 约为1 . 8 nm, 而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。
这说明, SDS - 蛋白质复合物的形成也消除了天然蛋白质构象不同对迁移率的影响。
影响带电化合物电泳迁移率的内在因素有三: 即带净电荷的多少、分子量的大小和分子的形状。
从以上的分析不难看出, 由于SDS 和蛋白质的结合, 消除了净电荷和分子形状二因素对电泳迁移率的影响。
那么在外界条件固定的情况下, 凝胶电泳的迁移率只取决于蛋白质分子量大小。
因此, 我们只要测出4～6 个已知分子量的标准蛋白质的迁移率, 作出标准曲线, 即可得到待测蛋白质分子的分子量。
只是每次测定样品必须同时做标准曲线, 而不得利用另一次电泳的标准曲线。
SDS - 凝胶电泳具有分辨率高、重复性好、设备简单、操作容易等优点。
实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量
实验四 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量姓名：mangogolaSDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理是：蛋白质在电泳中的迁移速率取决于其所带电荷、分子大小以及形状等因素，而大多数蛋白质与SDS 按一定比例结合（1:1.4/g:g ），这样使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，而且形状为短轴相同的雪茄烟形。
由此蛋白质分子的电泳迁移率仅取决于其分子量，在特定凝胶浓度下，一定范围内的蛋白质分子量对数与迁移率呈直线关系，选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白，与样品同时电泳计算得到标准曲线，并根据待测样品的相对迁移率在标准曲线上查出其分子量。
一．实验过程1.凝胶工作液的配制2.灌制分离胶将制胶玻璃板清洗安装紧密后，插入制孔器，在距制孔器下端1cm 处做一标记，取下制孔器将分离胶溶液加入两块玻璃板之间至标记处。
然后立即用注射器向凝胶液面轻轻铺上一层厚约0.5cm 的dd 水，目的是使凝胶面平整，放置待其聚合凝固。
3.灌制浓缩胶将分离胶上的双蒸水用注射器取出并用滤纸吸干，放入制孔器，用滴管灌入浓缩胶至玻璃板顶端待其聚合凝固。
4.待测样品的制备取0.1ml 透析除盐后的样品稀释液（浓度在0.2mg/ml 左右），加入0.1ml 样品溶解液，混匀后沸水浴5min ，冷却。
（沸水浴的目的是使蛋白质变性成肽链，便于与SDS 结合，甘油可以增加蛋白质的比重，便于沉降到加样孔底部，不易飘散） 5.加样和电泳将电极缓冲液注入缓冲液槽，然后轻轻拔出制孔器，加样后连接电泳仪，记录每个加样孔的样品类型及上样量。
浓缩胶使用50V 恒压，分离胶使用100V 恒压。
浓缩胶浓度4%，交联度2.7%[Acr （30%）：Bis （0.8%）]溶液0.67ml dd 水3.05ml0.5M pH6.8 Tris-Hcl （0.4%SDS ）溶液 1.25mlTEMED （原液）6ul将以上成分加入小烧杯中轻轻摇匀，加入10%的硫代硫酸铵0.026ml ，摇匀后灌胶。
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实验六报告：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量1.研究背景及目的根据自然界中普遍存在的电泳现象，以及实践应用的需求，科学家不断完善了电泳技术，从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。
电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。
蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义，比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病（肾小管损坏、多发性骨髓瘤等）。
这种需要促进了相关技术的发明。
具体过程见原理。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。
从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。
1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用[1] 。
通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。
SDS与蛋白质分子结合，不仅使蛋白质分子带上大量的负电荷，而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。
因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率主要取于其分子大小。
由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。
通过本次实验，学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法，进一步学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。
2.原理由于技术的发展，理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值，但是实际操作过于繁琐，且生物大分子的数量级是KDa，实际中往往不需要特别精确。
所以转向寻求其它方法，如果两种性质具有相关性，就会有相关理论基础和技术，发现分子量与迁移速率有关，于是寻找相关方面的技术。
通过沉降平衡法测定分子量，但是需要很大的转速，且要考虑安全性和造价，于是舍弃；分子筛层析主要以分子量差异进行分离，可以用来测定分子量，但是需要很长的分离柱，分离速度较慢，还要测定OD值，操作麻烦，浪费时间，而且带来的经济效益也不是很大；与此同时，电泳技术也发展起来，电泳相对时间较短，造价低，可操作性强。
电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关，其中含有分子量，理论上就可行了，于是用电泳测定分子量。
首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异，从数学上彻底消除电荷效应是不可能的，使带电量相同也不可能实现，只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。
想到通过引入外来物形成复合物，定量引入，定量结合，且结合后分子间差异并未发生改变。
关于引入负电还是引入正电的问题，蛋白大多为球状，若结合后仍未球状，静电结合不稳定；双亲性物质彻底结合后破坏空间结构，所以引入负电，结合稳定。
于是开始筛选阴离子去污剂，在众多的物质试验中，发现十二烷基硫酸钠（SDS）具有很好的效果。
SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合，所引入净电荷量约为蛋白质本身静电荷10倍的静电荷，从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物，该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。
SDS-蛋白质复合物具有扁平而紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴在18Å的数量级，保持恒定，而长轴的变化正比于蛋白质的分子量。
因此SDS-蛋白质复合物消除了蛋白质天然形状不同对电泳迁移率的影响。
综上，SDS-蛋白质复合物的迁移率只与蛋白质分子量有关，研究表明蛋白质分子的电泳迁移率与其分子量对数呈线性关系，因此能够根据电泳迁移率的比对获得未知蛋白质分子量大小。
3.仪器与试剂3.1仪器设备DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）、100μl微量进样器（上海医用激光仪器厂）、HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；3.2主要实验器皿烧杯（50ml ×3）、大培养皿一套、100ml量筒、玻璃漏斗；3.3实验材料实验四麦清蛋白脱盐样品；3.4实验试剂实验试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、十二烷基硫酸钠（SDS）、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵、甘油、巯基乙醇、异丙醇溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、盐酸、乙酸、冰乙酸；试剂的配制：⑴分离胶贮备液：称取Tris 18.17克，SDS 0.4克，溶于水，用3N HCl调pH到8.8，水定至100毫升，其中Tris为1.5M，SDS为0.4%。
⑵浓缩胶贮备液：称取Tris 6.06克，SDS 0.4克，溶于水，用3N HCl调pH到6.8，水定容至100毫升，其中Tris为0.5M，SDS为0.4%。
⑶Acr/Bis储备液：称Acr 30克，Bis 0.8克，加蒸馏水到毫升。
⑷10%过硫酸铵：过硫酸铵1克，加蒸馏水至10毫升，用时现配。
⑸TEMED：冰箱保存。
⑹Tris-HCl样品缓冲液（pH 8.0）：称Tris 6.05克，甘油50毫升，巯基乙醇25毫升，溴酚蓝0.5克，SDS 10克，溶于水，用HCl调pH为8.0，水定容至500毫升。
⑺电极缓冲液：称取Tris 3.03克，甘氨酸14.41克，SDS 1.0克，溶于水，定容至1000毫升。
4.操作步骤4.1电泳槽的安装玻璃板要先用洗液浸泡，然后用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥，洗净的玻璃板装入硅胶夹套中，垂直的固定在两槽中间。
在固定时，要四个螺旋对角线拧紧。
电泳槽装好后，用溶化的电极缓冲液配配制的2%的琼脂注入高玻板一侧电泳槽的下方，从而封堵形成夹胶室，以防漏胶，备下一步应用。
4.2制胶分离胶的配制（T%=12.5%）试剂名称：分离胶缓冲液Acr/Bis储备液dH2O TEMED 过硫（AP）用量(ml) 2.7 4.5 3.7 0.005 0.2 混匀，沿高玻璃板中央定点灌胶至距离矮玻璃板2-2.5厘米处，放正，立即沉稳轻缓封水层，静置聚合；聚合后倒去水层，以滤纸条吸干残余水层，灌注浓缩胶。
浓缩胶制备: 试剂名称浓缩胶缓冲液Acr/Bis 储备液dH2O TEMED 过硫酸铵（AP ）用量(ml) 1.25 0.75 3.0 0.005 0.020浓缩胶灌至与矮玻璃板顶端相齐，立即插入梳子，静置聚合。
浓缩胶聚合后，灌注电极缓冲液，再拔出梳子，准备上样。
4.3样品的处理Marker ：市售标准样品按要求制备待测样品：麦清蛋白初步提取的凝胶过滤脱盐实验所获得的峰值管制备的SDS-PAGE 样品所有样品于沸水浴中加热5分钟，冷却后上样。
上样量：marker20ul ，待测样品：4ul 、10ul 、20ul 、30ul 、50ul 。
4.4电泳 样品加入后，准备电泳，本次实验：取稳流状态，浓缩胶15mA ，分离胶25mA 。
本次试验的溴酚蓝前沿指示剂不能跑丢！4.5检测（1）染色液：0.4%考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，7%乙酸 （2）脱色液：20%甲醇，7%乙酸 （3）步骤电泳后，取出胶板，先在自来水中浸泡10min ，以浸出部分SDS ，（加热2h 应该在通风橱中操作），然后用脱色液脱至条带清楚，观察记录结果。
4.6测量蛋白质样品的迁移率和未知样品的分子量用卡尺或坐标精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移的距离，把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质迁移的距离定位d2，根据下面的公式计算各种蛋白质的迁移率Rm ：Rm= d2/ d1 以标准蛋白的迁移率为横坐标，以其对应的分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，可得到一条直线。
然后根据未知样品的迁移率，在半对数坐标图上查出其对应的分子量。
并由所得结果分析实验四麦清蛋白的初步提取的实验的效果及后续进一步纯化的方案。
5.数据整理溴酚蓝迁移距离d1=10.10cm 表1 Marker 的迁移距离 Marker 1 2 3 4 5 6 7 d2 1.00 2.05 3.004.60 6.30 8.05 8.95 MW(KDa) 116.0 66.2 45.0 35.0 25.0 18.414.4 表2 部分麦清蛋白的迁移距离 麦清蛋白 1 2 3 4 5 d2 2.10 2.40 2.50（目标蛋白）3.6 3.76.结果计算与讨论及分析表3 Marker 的迁移率及对数分子量Marker 1 2 3 4 5 6 7 迁移率Rm 0.099 0.203 0.297 0.455 0.624 0.797 0.886 对数分子量 2.064 1.821 1.653 1.544 1.3981.2651.158图1 Marker的标准曲线结果计算：目标蛋白的迁移率Rm=0.248，代入标准曲线的公式中得到：MW(目标蛋白)=62.78 KDa。
麦清蛋白的分子量为相对分子质量为60kDa左右，结果相近，说明实验结果是可信的。
讨论及分析：在电泳图谱中，Marker有6条清楚的谱带，第7条位于蛋白前沿，迁移不充分。
在绘制标准曲线的时候，发现不忽略Marker1，R2为0.9583，忽略Marker1，R2为0.9869。
忽略后的拟合程度更好，不知道本次实验中是否可忽略Marker1。
样品采取梯度上样是为了使含量高的蛋白低上样量，含量低的蛋白高上样量，使谱带更加清晰。
目标蛋白含量较高，说明该蛋白在小麦种子休眠中起重要作用。
根据电泳谱带信息，可见能够分析的谱带有10条，本次实验一共分离得到10种蛋白，其中带较粗含量较高的有三种蛋白，说明在小麦种子休眠过程中起着重要作用。
若要对目标蛋白进行分离纯化，可以根据目标蛋白与杂蛋白的分子量差异，分子量大小排在什么位置，进行试验设计，再上样进行一次层析。
由于目标蛋白的上一条谱带迁移距离为2.4cm，与其2.5cm非常接近，层析中可以通过控制洗脱液流速，最终实现分离。
7.结论与展望本实验以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定麦清蛋白分子量，通过目标条带相对迁移率与Marker蛋白质标准曲线的比对，计算得到目标蛋白分子量大小。
实验结果从数值上而言与标准值相近，可见以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量准确度相当可观。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离样品，结果易于鉴定、比较、分析和计算，广泛应用于未知蛋白质分子量的测定，但其易受环境和人为等诸多因素的影响，有待进一步的改进和完善。
8.思考题与质疑⑴对照比较一下活性电泳与本次变性电泳中各自的电极缓冲液的成分和离子浓度，是否相同？相关设计的可能原因会是什么？答：不相同，比较如下：pH Tris(g) 甘氨酸(g) SDS(g) 体系(ml) 活性电泳8.3 6 28.8 10000 变性电泳8.33.0314.411.01000离子浓度加大是因为在SDS-PAGE中要使蛋白质与SDS结合生成SDS-蛋白质复合物，从而使蛋白质带上强负电，因此必须在整个电泳缓冲体系中加入高浓度的SDS及保持高离子强度环境，可以适当增大电流，使电泳速度提高。