SDS-PAGE测量蛋白质分子量解析
SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定
SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定一、实验目的与原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。
1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。
本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。
二、仪器与试剂1、材料：硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。
2、试剂：（1）丙稀酰胺（Acr母液）：30%Acr （Acr/Bis）（2）10%的SDS溶液（3）10%的过硫酸铵溶液（4）四甲基乙二胺（TEMED）（5）分离胶缓冲液：1.5M Tris，PH8.8（6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris，PH6.8（7）电极缓冲液：10×30g Tris，125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3（8）样品缓冲液：0.2M Tris，PH6.8，1%SDS，30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰（9）染色液：0.15%考马斯亮蓝R250，溶于脱色液（10）脱色液：50%的甲醇，7%的冰醋酸的水溶液（11）标准分子量蛋白。
3、仪器设备：电泳仪、垂直电泳槽等。
三、操作步骤1、凝胶制备：用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。
将配制好的分离胶溶液倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量解析
• 5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小 对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影 响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之 则泳动速度慢。
电泳技术的分类
• 1. 根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳： ①自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。②区带 电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维 薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置 形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘 状电泳、毛细管电脉等。 • 2.根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：①高 压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快， 但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化 合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500 V以下， 电位梯度为2～10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，但 对电泳设备要求简单。
• 4．电渗：液体在电场中对于固体支持介质 的相对移动称为电渗。由于支持介质表面 存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基， 琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支 持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的 离子在电场作用下向电极方向移动，形成 介质表面溶液的流动。 • 当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳 速度；当电渗方向与电用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。 示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液， 蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增 加，以确保样品均匀沉入加样孔内。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质
【基本原理】 • 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清 蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在 pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电 场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电 点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速 率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后， 将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血 清蛋白质分成5条区带，从正极端起分别为白蛋白、 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。
实验一 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
3．浓缩胶的制备 按下表配制浓缩胶， 按下表配制浓缩胶，将浓缩胶混 匀后直接灌注在已聚合的分离胶 立即插入梳子， 上，立即插入梳子，将凝胶垂直 放于室温下聚合。 放于室温下聚合。
浓缩胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 4%(ml) 3.05 0.65 1.25 0.05 2小滴 小滴 0.05 5ml
4．样品预处理： 样品预处理： 取样品液与等体积样品缓冲液 混合，100℃加热1 分钟。 混合，100℃加热1～2分钟。 5．待浓缩胶聚合完全后，小心移出 待浓缩胶聚合完全后， 梳子， 梳子，然后将胶板固定于电泳装置 上下槽各加入电极缓冲液。 上，上下槽各加入电极缓冲液。 6．加样： 加样： 用微量进样器加样。 用微量进样器加样。 每个样品孔加入20ul样品 样品。 每个样品孔加入20ul样品。 同时加一个标准品。 同时加一个标准品。
分离胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 分离胶缓冲液(pH8.8) 分离胶缓冲液(pH8.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 10%(ml) 10 10 7.5 0.3 1滴 滴 0.1 30ml
将分离胶混匀后立即灌注于玻板间 隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。 隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。 将胶板垂直放于室温下， 将胶板垂直放于室温下，待分离胶 聚合完全后， 聚合完全后，倾去正丁醇并用滤纸 吸干。 吸干。
操作步骤 1．安装制胶模具 A 、要用琼脂进行封边，防止 要用琼脂进行封边， 凝胶泄露， 凝胶泄露，尤其注意边角的 地方。 地方。 B、安装时，要将螺丝拧紧， 安装时，要将螺丝拧紧， 也是为了防止泄露。 也是为了防止泄露。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
(4)聚丙烯胺凝胶的生成：
四、实验步骤：
1、贮液的配制：
2、凝胶的制备： 2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备：
3、蛋白样品的制备：
4、装槽、点样： 5、电泳： 6、剥胶、染色、脱色：
2.1 胶板的制备：
3、植物组织蛋白质提取：
称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加
第二、不连续系统中的三种物理效应：
①电荷效应：
②分子筛效应: ③浓缩效应:
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶)
2、仪器、器皿：
(1)垂直板电泳装置
（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (2)稳流稳压电泳仪； （4）电子天平； （6）瓷盘、微量进样器； （3）高速冷冻离心机； （5）电冰箱；
②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光
解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发 生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制 备大孔径的浓缩胶。
5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；
⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量
SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术学习SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术实验原理SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)：1. 在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。
2. 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS (阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。
此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3. 蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，其电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。
实验设备与试剂垂直板型电泳槽直流稳压电源微量注射器移液器水浴锅染色槽烧杯试管滴管分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl, pH8.8)：称取Tris 18.15g，加约80ml 无离子水，用1 mol/L HCl调pH至8.8，无离子水定容至100ml，4℃保存浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L Tris-HCl液, pH6.8)：称取Tris 6g，加约60ml 无离子水，用1 mol/L HCl调pH至6.8，无离子水定容至100ml，4℃保存凝胶贮液：称取丙烯酰胺(Acr) 29.2g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，重蒸水定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中并定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存10%SDS溶液：10g SDS加重蒸水定容至100ml，室温保存(低温下易析出结晶，用前微热，使其完全溶解)1%TEMED (四甲基二乙胺)10%过硫酸铵(AP)：配制后分装，-20℃保存电泳缓冲液(Tris-Gly缓冲液pH8.3)：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454ml 50%甲醇溶液和46ml冰乙酸即可脱色液：75ml冰乙酸，875ml重蒸水与50ml甲醇混匀实验步骤1. 安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。
下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。
SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。
相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。
蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。
通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。
这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。
SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。
（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。
这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。
（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。
随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。
（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。
目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。
SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。
其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。
通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。
5 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量一、目的了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。
二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。
本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。
三、试剂和器材（一）试剂1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。
2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。
18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。
3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。
6gTris,少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。
4. 10%SDS，室温保存。
5. 两类样品缓冲液：2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml甘油 2.0 ml质量浓度10%SDS 4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇 1.0 ml总体积10 ml6. 电极缓冲液，pH8.3。
Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。
sds-page测定蛋白质的相对分子量
03 SDS-PAGE测定蛋白质相 对分子量的原理
蛋白质的相对分子量与迁移率的关系
蛋白质在SDS-PAGE电泳中的迁移率 与其相对分子量成反比，即相对分子 量越大，迁移速度越慢。
在电场的作用下，SDS将蛋白质分子 包裹起来，消除了蛋白质分子间的电 荷差异，使相对分子量成为影响迁移 率的唯一因素。
电泳
加样
将准备好的样品用微量移液器加到加 样孔中。
开始电泳
接通电源，开始电泳，注意控制电流 和电压，确保电泳过程稳定。
染色和脱色
染色
电泳结束后，将凝胶取出，放入含有染色液的容器中，染色一定时间，以便观 察蛋白质条带。
脱色
染色完成后，将凝胶取出，放入含有脱色液的容器中，脱色一定时间，以便观 察清晰的蛋白质条带。
将SDS和β-巯基乙醇加入样品中，以促进蛋白 质变性并带上负电荷。
煮沸处理
通过煮沸处理使蛋白质变性，并使SDS充分结合到蛋白质上。
凝胶制备
01
制备分离胶
按照分离胶的配方，将各组分混 合均匀，并迅速注入到玻璃板中 的凹槽内。
聚合凝胶
02
03
制备浓缩胶
加入适量水，使分离胶聚合凝固。
按照浓缩胶的配方，将各组分混 合均匀，并迅速注入到分离胶上。
计算相对分子量时需考虑实验条件、电泳缓冲液、电压等因素的影响，以 确保结果的准确性。
04 SDS-PAGE实验注意事项
避免样品降解
确保样品储存于低温环境
01
在实验过程中，应将未使用的样品保存在低温环境中，以避免
蛋白质降解。
避免样品反复冻融
02
反复冻融会使蛋白质发生变性，影响实验结果，因此应尽量减
SDS-PAGE可用于测定各种相对分子 量范围的蛋白质，从低到高均可。
SDS-PAGE电泳法测蛋白质分子量
1.样品溶液中各种试剂的作用是什么?SDS：使蛋白质变性剂能与样品蛋白结合，使样品蛋白质都带负电荷显棒状，消除了电荷和分子形状对相对分子质量的测定的影响，从而可利用相对分子质量差来分离蛋白。
巯基乙醇：使蛋白质中的二硫键断裂，并保持不再被氧化，使聚合的蛋白分子分解成各亚基或单链，因此最后测出的结果只是各亚基或单链的相对分子质量，而不是整个蛋白分子的相对分子质量。
甘油：是加入的样品蛋白随甘油一起沉降到样品孔底部而不至于样品漂浮在缓冲液中。
盐酸：主要起缓冲作用，保持样品蛋白的电荷量即用来调节PH。
2.本实验是否需在低温下进行?不需要在低温下进行。
低温可能会使蛋白质变性。
3.简述聚丙烯酰胺凝胶电泳测定生物分子分子量的原理，如何调节凝胶的孔径？蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。
当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。
由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。
4.SDS-凝胶电泳中TEMD的作用是什么？在样品缓冲液中加入0.1%溴酚蓝有何作用？促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固可以让蛋白下沉到点样孔底部，防止漂样，还有指示剂的作用。
5.本实验中溴酚蓝和考马氏亮蓝的作用分别是什么？可以让蛋白下沉到点样孔底部，防止漂样，作为指示剂，因为溴酚蓝呈蓝色，而蛋白质是白色，在SDS-凝胶中不明显，且溴酚蓝的相对分子量比蛋白质(绝大部分)小，电泳时速度比蛋白质稍快，因此当溴酚蓝到达电泳槽底部(可看蓝色调带)，则电泳结束。
SDSPAGE测量蛋白质分子量解析
10%Ap
150µl
TEMED
500µl
浓缩胶(5% 5ml)
3.2ml
0.85ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.65ml
50µl
50µl
200µl
3.样品及MW标准参照物溶液的制备
样品溶液和上样缓冲液混匀，使用前在100℃水浴 1min，以除去可能出现的亚稳态聚合物。
Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最 后用蒸馏水容至100ml。
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+
溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘 氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加 蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
4.上样。 15μl/孔
5.电泳
上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪开关，开始时 将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，将电流调 至20-30mA。待指示剂染料靠迁移至下沿1～1.5cm 处停止电泳，需2～3h。
6.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，将凝胶放入0.05% 考马斯亮蓝R250（内含20％磺基水杨酸）染色液中，
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）测定蛋白质分子量，简便、快速且重复性好，是一种常用的蛋白质分子量测定方法。
百泰派克生物科技提供基于SDS-PAGE或质谱的蛋白质分子量测定服务。
SDS-PAGE
SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种间断的电泳系统，通常用于分离分子量在5—250kDa之间的蛋白质。
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate ，SDS）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel ，PAG）组合使用可以消除结构和电荷的影响，从而仅根据分子量的差异来分离蛋白质。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
蛋白质分子量即蛋白质相对分子质量，是蛋白质化学式中各个原子的相对原子质量的和。
蛋白质分子量正确与否往往预示着蛋白质的结构和功能正确与否。
测定蛋白质分子量的方法有很多，SDS-PAGE是主要方法之一，也是实验室使用最普遍的一种。
在SDS-PAGE中，已知分子量的标准蛋白质和未知样品同时电泳。
染色后，根据标准蛋白质的相对迁移率和分子量的对数，可得到一条标准曲线，利用未知样品的相对迁移率可在标准曲线上求得其分子量。
另外，SDS-PAGE法可分为还原电泳和非还原电泳，还原电泳中蛋白质二硫键被还原使得蛋白质可以充分伸展，因此使
测定结果更为准确。
生化实验3-蛋白质SDS-PAGE胶电泳分子量分析
生化實驗3－蛋白質SDS-PAGE膠電泳分子量分析1.原理：SDS-PAGE（Sodium dodecyl sulfate－polyacrylamide gelelectrophoresis）為變性（denature）的蛋白質電泳，可依分子量分離出不同大小的蛋白質成分，其後以CBR染色或銀染判讀結果。
2.藥劑：Acrylamide + bis-acrylamide ( 37.5 : 1 )、APS (ammoniumpersulfate)、TEMED、Running buffer及Sample buffer。
3.儀器：SDS-PAGE電泳槽套組、電源供應器。
4.實驗方法：a.下層製膠（Running gel）－組合置膠器後，於下層膠體溶液中迅速加入APS及TEMED混合均勻，注入玻璃板間空隙達孔梳下1 cm左右，再注入少量去離子水隔離空氣，靜置凝膠約30 min。
b.上層製膠（Stacking gel）－將下層膠上方的水分倒掉，同樣於上層膠體溶液中迅速加入APS及TEMED混合均勻，注入玻璃板間至上緣，並插入孔梳，靜製凝膠約30 min。
c.樣品前處理－取樣品與sample buffer等量混合，水浴100℃三分鐘後快速離心取上層液。
d.電泳操作－架設電泳裝置套組，將running buffer倒入電泳槽中，取下孔梳，分別將處理好的樣品各20μl注入well內。
蓋上電泳槽，連接電極線於電源供應器，調整電壓至80 V開始跑電泳約30 min，至上下膠體間集膠，後電壓調至120 V，由追蹤染劑觀察蛋白質泳動情形，接近膠體底部時停止電泳。
e.膠片暫存：小心取出玻璃板及膠片（夾著），以buffer潤濕紙巾後包覆，放入夾鍊袋中冷藏於4℃。
課程指導：林文風（5103）實驗協助：陳運源（5103）、楊喬筑（5123）。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
项目三SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量一实训目的1掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作步骤2学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理二实训原理用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。
再与标准样品对照即可确定各区带的成分。
要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。
SDS能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成SDS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在1.2X104～16.5X104之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。
LogMW＝K－bm(LogMW为分子量的对数，K、b为常数，m为迁移率)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量.三、实训器材配制方法1、浓缩胶缓冲液：1.5克Tris、12.0毫升1mol HCl，加水混匀定容至25毫升。
2、分离胶缓冲液：18.15克Tris、48.0毫升1 mol HCl，加水混匀定容至100毫升。
3、电极缓冲液：3克Tris，14.4克甘氨酸、1克SDS，加水混匀定容至1000毫升。
4、1％过硫酸铵：1克过硫酸铵溶于l00ml蒸馏水中，临用前配制。
5、样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8 I＝0.0625M)：取浓缩胶缓冲液(B液)1：7(v/v)稀释。
6、样本变性液(Tris-HCl pH6.8 I=0.01M，2％SDS，10％蔗糖，0.001％溴酚兰)；0.8克SDS，4克蔗糖溶于样本缓冲液定容至20毫升，再1滴0.1％溴酚兰。
测定蛋白质分子量的原理
测定蛋白质分子量的原理
测定蛋白质分子量的原理一般有以下几种：
1. SDS-PAGE：SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分子量测定方法。
首先，将蛋白质样品与SDS（阴离子表面活性剂）热处理使其具有带负电荷，然后在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。
由于SDS使蛋白质分子呈现均匀的线性形态，电泳时会根据蛋白质分子的大小形成不同的带。
通过与已知分子量的标准品比较，可以确定待测蛋白质分子量。
2. 基于质谱的方法：质谱测定蛋白质分子量的常用方法是质谱分析（如质谱摄谱法或飞行时间质谱法）。
该方法将蛋白质样品经过解析后，通过对产生的质谱图谱进行分析，可以得到蛋白质的质量/电荷比（m/z）信息。
通过与已知分子量的标准蛋白质比对，可以推断待测蛋白质的分子量。
3. 整体流动测定法：整体流动测定法是一种通过测量蛋白质在流体中的行为进行分析的方法。
其中，动态光散射与色散数据被用于推导一些与蛋白质分子量相关的参数。
这些参数可用于估算待测蛋白质的分子量。
4. 其他方法：还有一些其他的方法可以用于测定蛋白质分子量，如凝胶过滤法、凝胶渗析法、次级结构分析等。
这些方法根据蛋白质分子量对物质在某种条件下的行为差异进行分析和测定。
需要注意的是，不同的方法可能在操作步骤和条件上有所差异，因此在选择和应用方法时需要根据具体实验需求和条件选择适合的方法。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
实验十 SDS-PAGE测定蛋白质分子量一、实验目的1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2.掌握垂直板电泳的操作方法。
3.运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二、实验原理1.带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。
其中区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳早期使用不同的支持介质有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
2.PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS 能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMr=K-bX，式中：Mr为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
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①浓缩效应
1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径（稀） T＜5％，分离胶一般为小孔径（浓） T﹥7.5％。样品在较稀的凝胶上自由迁 移，直至浓凝胶时，便形成一道栅栏， 所有的样品分子在浓缩胶的界面堆积成 一窄带，得到浓缩，然后，再依据分子 量的大小进行电泳分离。 2.缓冲液的组成:图示。PH系统的不连续， 各种分子的电荷之间的差异进行分离。 3.缓冲体系的不连续，其中各组成的离 子、快慢离子迁移快慢的差别是影响样 品浓缩效应的重要因素。 4.离子的迁移速率及浓度的不连续又造 成电场强度与电导率的变化。
不连续凝胶电泳（disc）的分离原理
(一).原理
不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的① 电荷效应分 离外，还具有②浓缩效应与③分子筛效应，因而，能提 高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有 差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷 性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子 量大小相近，但构型不同时亦可分离。 不连续凝胶电泳洗脱 碱性不连续－分离酸性样品 酸性不连续－分离碱性样品 大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统 进行电泳分离。
加样 电泳
光吸收 检测 考玛斯亮篮染色
染色
银 染 色
SDS-PAGE测蛋白质分子量
SDS-PAGE是在PAG系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断 裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能 使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的 SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合 物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状 态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了 各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按 重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分 子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量 的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X 为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对 分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进 行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
标准蛋白质样品
标准蛋白质样品：是一组（5～7种） 已知的合适的分子量范围的、构形 相近的一套蛋白质，溶解在样品缓 冲液中备用。 样品的浓度 分析目的、检测方法和样品的组成 是关键； 未知样品浓度：0.1～20mg/ml 考玛斯亮篮染色：1～2mg/ml 银 染 色 :0.02～0.2mg/ml 高纯度样品： 0.5～2mg/ml
ab b 100(％ C 100 （％） T ） a＋b m
上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m 为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富有弹
性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。
分子量范围与凝胶浓度的关系
物 质
蛋白质
分子量范围
<104 1-4×104 4×104-1×105 1-5×105 >5×105
③电荷效应
操作
PH8.3 PH6.7 PH8.9 PH8.3
2. 1.
3.
4.
垂直柱状，板状的 不连续凝胶电泳系 统的组成和配制
5. 6. 7.
垂直柱状，板状的不连 续凝胶电泳系统的组成 和配制； 均一凝胶与梯度凝胶配 制； 电极缓冲液系统； 样品的准备； 加样要求 电泳 检测
缓冲液系统
浓缩凝胶缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 分离凝胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl,PH8.8 电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨酸) PH8.3 样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、0.05mg/ml溴酚蓝 样品缓冲液的要求： 选择合适的PH与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、 生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。
使丙烯酰胺 成为自由基，发动聚合反应
N，N，N，N-四甲基乙二胺 β－二甲基胺基丙晴
影响聚合因素
1.
2.
3. 4.
5.
大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程 中要使反应液与空气隔绝。 某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。 某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。 温度高聚合快，温度低聚合慢。 碱性条件下凝胶易聚合，其聚合速度与AP浓度的平方根成正 比。
适用的凝胶浓度（%）
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
核酸
<104 104-105 105-2×106
10-20 5-10 2-2.5
5%
200 97 66
10%
200 97 66
15%
200 97 66
45 45
29
29 45 29
迁 移 率
A B 5 7 9 11 13 15 T%
凝胶浓度T对样品迁移率的影响
例：混合蛋白质A,B，A分子量较小，B分子带电荷较多，T＝5％ 时，电泳行为主要以电荷起作用，B 迁移速度快。当 T 增加， 分子筛效应增加，B的迁移速度减慢；T＝ 9 ％时，A，B的迁移 率相同，不能分开，T 再增加，凝胶孔径更小，A分子比B分子小， 表现较高的迁移率。并且说明电泳只获得单一的带时，并不能证 明是单一的均一成分。
②分子筛效应
移动界面到达浓缩胶和分离胶 界面时，凝胶的PH变化明显， 缓冲液中甘氨酸的解离迅速增 加，直至完全解离出 gly-,其 分子量小，迁移超过蛋白质分 子。而丧失夹击的作用；同时， 凝胶的孔径变小，降低了蛋白 质的迁移率。故蛋白质分子在 均一的电压梯度和PH 值中泳 动，依其分子量的大小而分开。
支持介质－聚丙烯酰胺凝胶
聚合原理：
单体丙烯酰胺Acr 交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis 化学聚合 光聚合
引发剂 加速剂
注：（NH4)2S2O8 TEMED DMAPN
（NH4)2S2O8 TEMED
（NH4)2S2O8 DMAPN
核 黄 素 TEMED
过硫酸胺在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，
聚丙烯酰胺凝胶优点
化学性质稳定；凝胶孔径可调； 重复性好；分辨率高； 灵敏度高，可以测定10-6浓度的样品。
T
ab m
100(％
C
b ab
1001 ％
凝胶浓度的计算
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔
径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双
丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓 度。T与C的计算公式是：
EXPERIMENT 7
SDS-PAGE测量
蛋白质分子量
实验目的
学习聚丙烯酰胺凝胶聚合原理； 学习不连续聚丙烯酰胺凝胶分离原理； 掌握垂直板电泳的操作方法； 学习SDS-PAGE测蛋白分子量原理并测定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳—
PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis)