SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量解析
• 5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小 对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影 响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之 则泳动速度慢。
电泳技术的分类
• 1. 根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳： ①自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。②区带 电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维 薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置 形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘 状电泳、毛细管电脉等。 • 2.根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：①高 压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快， 但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化 合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500 V以下， 电位梯度为2～10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，但 对电泳设备要求简单。
• 4．电渗：液体在电场中对于固体支持介质 的相对移动称为电渗。由于支持介质表面 存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基， 琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支 持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的 离子在电场作用下向电极方向移动，形成 介质表面溶液的流动。 • 当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳 速度；当电渗方向与电用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。 示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液， 蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增 加，以确保样品均匀沉入加样孔内。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质
【基本原理】 • 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清 蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在 pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电 场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电 点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速 率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后， 将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血 清蛋白质分成5条区带，从正极端起分别为白蛋白、 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。
下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。
SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。
相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。
蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。
通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。
这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。
SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。
（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。
这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。
（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。
随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。
（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。
目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。
SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。
其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。
通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。
二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。
通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。
2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。
3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。
4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。
5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。
打开电源，调整电流和电压，开始电泳。
6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。
7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。
通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。
此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量
实验教学教案首页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量（设计性）相关知识1.电泳？2.影响电泳速率的因素？3.SDS 的作用？4.β－乙醇的作用？ 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）：3.分类：自然胶电泳、变性胶电泳、等电聚焦电泳、梯度胶电泳、双向电泳、印迹转移电泳。
4.不连续缓冲系统：SDS －PAGE 电泳体系为不连续电泳体系。
5．分离胶浓度的选择和配制方法SDS *双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。
常用的标准蛋白质的Mr丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺TEMED过硫酸铵聚丙烯酰胺凝胶 ＋pH 6.8pH8.8Tris-GlyTris-Gly pH8.3不同分离胶的配制方法5%注意：根据实验目的、实验要求、实验条件在实验前写出实验设计方案一、实验目的、实验要求、实验条件实验目的1．用SDS－PAGE法测定样品中蛋白质相对分子质量；2．熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。
实验要求1.能够根据实验目的进行整个实验过程的设计与操作，注意几个设计点:①如标准蛋白质的选择依据；②分离胶的确定与制备：浓度大小的依据是？分离胶配制量多少的依据是？③灌胶方法的选择？④上样量的确定：依据蛋白质浓度大小确定上样量，一般是样品在含1~6种蛋白且各占比例相当的情况下浓度在1~2mg/ml时、对凝胶大小在8×8.2时，上样量为10~20ul；⑤电泳时电压控制多大的选择；⑥能够对实验过程中出现的问题加能解决，能够独立思考分析电泳结果，总结本实验成功与失败的原因。
2．利用标准曲线计算出待测蛋白质样品的Mr。
实验条件1．实验所需的实验试剂和材料。
2.实验所需的主要实验仪器。
二、实验原理带电颗粒在单位电场中泳动的速度称为迁移率或泳动度（mobility）。
泳动度与带电颗粒所带静电荷的数量、颗粒大小和形状有关。
一般来说，颗粒所带静电荷的数量越多，颗粒越小，越接近球形，则泳动度越大。
SDS即十二烷基硫酸钠（sodium dodycyl sulfate），是一种阴离子去污剂。
SDS-PAGE实验报告
生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。
2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。
最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。
实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。
实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。蛋白 质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中 的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复 合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的 大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁 移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒 的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下 端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配 制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶 模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并 结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质），形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
剥胶示意图
七、染色和脱色
倾出固定液，加入染色液。染色过夜。 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。数小时 换一次脱色液，直至背景清晰，约需一昼夜。
八、Mr的计算
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mr：
蛋白质样品迁移距离(cm) 相对迁移率mr = 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
测定蛋白质相对分子质量的方法
测定蛋白质相对分子质量的方法
测定蛋白质相对分子质量的方法有多种，以下列举几种常用的方法：
1. SDS-PAGE：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质按照分子量大小分离出来。
蛋白质在胁迫条件下与SDS形成复合物，其电荷密度相对一致，所以主要根据蛋白质在凝胶中的迁移距离来估算其分子量。
2. SDS-PAGE-Western blotting：在SDS-PAGE的基础上，将分离出的蛋白质转移到聚合物膜上，并使用特异性抗体检测靶蛋白。
通过与已知分子量的标准品比较，可以推断目标蛋白质的相对分子质量。
3. 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）：该方法通过将蛋白质与基质结合后，利用激光辐射将其离子化，并通过不同质荷比（m/z）的飞行时间分析获得蛋白质的质量/电荷比。
结合已知质量的标准品，可计算得到蛋白质的分子量。
4. 高效液相色谱-多角度光散射（HPLC-MALS）：通过高效液相色谱分离蛋白质，并结合多角度光散射检测器，测量蛋白质溶液中散射光强的变化。
根据多角度光散射理论，计算出蛋白质颗粒的质量和大小分布，从而推断其相对分子质量。
需要注意的是，不同的方法可能有其适用范围和准确性上的差异，因此选择合适的方法需要根据具体实验目的和条件进行评估。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
当蛋白质的分子量在15,000～200,000之间时， 蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质相对分子 质量的对数呈线性关系：
lgMr = K - bm 将已知相对分子质量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳迁移率对Mr的对数作图，即可得到一条标 准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件 下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下 端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配 制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶 模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图， 得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线 上查出其相对分子质量。标准蛋白质相对分子质量从大到 小依次为116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4 KDa。
【注意事项】
1、再用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子 质量时，每次测定样品必须同时作标准曲线， 而不能用上一次电泳的标准曲线；
浓缩胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 浓缩胶缓冲液(pH6.8)
10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 总体积
4%(ml) 3.05 0.65 1.25 0.05 0.03 0.05 5ml
二、凝胶的制备
2、浓缩胶的制备 按表配制浓缩胶，混匀后用细长头的滴管将凝 胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至距短玻璃 片上缘1 cm处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内 （插入“梳子” 的目的是使胶液聚合后，在凝胶 顶部形成数个相互隔开的凹槽）。约30 min后凝 胶聚合，再放置30 min。小心拔去“梳子”，用 窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的：通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。
二、实验原理：SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。
在该技术中，蛋白质样品与SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂混合后，加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合，形成具有负电荷的复合物。
这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。
蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶，即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散，形成连续的蛋白质稜。
然后，电泳阶段开始，电场通过凝胶，带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。
三、实验步骤：1.准备SDS-电泳胶液：根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液，即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。
2. 准备样品：取相应的蛋白质样品，如细胞裂解液，将其与试剂R （含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺）和Laemmli试剂混合，以加热破坏蛋白质的二级结构。
3.堆胶：将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中，留出足够的空间来注入分离胶液。
4.加载样品：在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。
5.电泳：将电泳槽连接到电源，调节电压，使电流保持稳定。
首先进行堆胶阶段，然后切换到电泳阶段，直至蛋白质移动到凝胶底部。
6. 凝胶染色：取下凝胶，用凝胶染色剂对凝胶进行染色。
一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。
四、实验结果：根据实验步骤描述的方法进行实验后，我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带，每条条带代表一个蛋白质。
条带的颜色越深，表示其含量越多。
通过与分子量标记的对照，可以确定蛋白质的相对分子质量。
五、实验讨论与分析：根据实验结果，我们可以推断蛋白质的相对分子质量。
相对分子质量可以通过标准曲线法来计算，即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。
通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点：能够同时分离多个蛋白质；能够对蛋白质进行集中分析；精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析技术，用于测定蛋白质的相对分子质量。
SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤：
1. 蛋白样品的准备：将待测蛋白样品与SDS（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质表面被负电荷包裹。
2. 样品加载和电泳过程：将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）中的孔洞中。
通常采用垂直电泳方式进行，将正电极和负电极连接至凝胶两端，通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。
3. 分子分离：在电泳过程中，由于SDS的存在，样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷，使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。
较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移，较大的蛋白质则移动速率较慢。
4. 染色和可视化：电泳结束后，使用染色剂（如Coomassie蓝染色剂）将蛋白质染色，使其可见。
通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以估计蛋白质的相对分子质量。
总结：SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷，在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质，通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。
引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。
化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。
采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。
因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
三、实验器材及数据30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml四、注意事项1、acr和bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴口罩和手套，纯化应在通风处内进行。
sds-page
一、实验目的：1.1理解SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的基本原理。
1.2掌握分子电泳的基本步骤，掌握计算蛋白质相对分子质量的方法。
二、实验内容和原理：2.1电泳（electrophoresis）：是指带电颗粒在电场中向着与它电性相反的电极移动的现象。
许多重要的生物分子都含有可电离基团（如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等），在非等电点条件下可解离成带有电荷分子，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。
电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。
可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。
2.2影响带电粒子在电场中泳动的因素：①生物分子的性质：待分离生物大分子所带电荷的多少、性质、分子大小和形状都会对电泳产生明显影响。
②缓冲液：缓冲液pH值直接影响生物分子的解离程度和带电性质。
溶液pH值距离等电点愈远，生物分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越快。
当缓冲液pH大于等电点时，生物分子带负电荷，电泳时向正极移动；当缓冲液pH小于等电点时，生物分子带正电荷，电泳时向负极移动。
③电场强度：电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。
一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。
但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最终导致介质温度升高。
降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间，引起生物分子扩散增加，同样影响分离效果。
所以电泳实验中要选择适当的电场强度。
④电渗：液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。
由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。
这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。
当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。
SDS-PAGE测定蛋白质
浓缩效应
样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋” 极移动，从浓缩胶进入分离 胶，速度变慢，堆积浓缩。
缓冲液 样品 浓缩胶
分离胶
浓缩效应
样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋” 极移动，从浓缩胶进入分离 胶，速度变慢，堆积浓缩。
6 、染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药 铲撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记， 在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。 加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质 区带清晰，即可计算相对迁移率。
7、 结果处理
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR：
【思考题】
1、在样品溶解液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴酚兰的作 用分别是什么？
2、电极缓冲液中甘氨酸的作用? 3、在SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和
AP,试述其作用? 4、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
SDS-PAGE过程有浓缩效应和分子筛效 应浓缩效应
浓缩胶（大孔胶）
浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl, 电极缓冲液pH8.3 Tris-Gly
解离度 ：Cl> 蛋> Gly mcl cl>m蛋 蛋>mGly Gly
凝胶中Cl－为快离子， Gly－为 慢离子，蛋白质样品被夹在中 间。
缓冲液 样品 浓缩胶
3、蛋白质样品的处理
1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400
牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200µl样品溶解液中，沸水浴中加热35min后上样。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量实验目的了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
实验原理SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。
1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：1gMr =K―bm R式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。
在条件一定时，b和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
仪器、原料和试剂仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。
原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
试剂：（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量数据处理(Excel教程)
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量数据处理（Excel教程）(免手工计算，免手工绘图，精确度高)
1.建立excel表格，并将实验数据输入
2.用f（x）=C4/4.5公式，计算出D5值，利用自动填充功能计算出
D列
3.相同方法，用LOG10（）公式计算出F列
4.按住Ctrl键，选中D列、F列，选择插入-散点图并用鼠标选中坐
标点，右击，选择添加趋势线，并显示公式(默认情况下，左列为x轴，右列为y轴)
5.用POWER()公式求得Mr
6.用单元格格式调整每一列的小数点后位数
7.打印即可
1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白溶液/ml 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 蒸馏水/ml 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 蛋白质浓度（mg/ml）0 0.125 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1.0 A280 0 0.125 0.189 0.267 0.351 0.408 0.557 0.631
2．样品蛋白质浓度测定
1)蛋白质（mg/ml）=1.167*30*100/90=38.9mg/ml
2)蛋白质（mg/ml）=1.127*30*100/90=56.35mg/ml
3)蛋白质（mg/ml）=1.167*30*100/90=110.23mg/ml
4)蛋白质（mg/ml）=1.167*30*100/90=312.4mg/ml
5)表3--SOD的分离纯化结果表。
测定蛋白质相对分子质量的方法
测定蛋白质相对分子质量的方法
蛋白质相对分子质量可用以下几种常见的实验测定：
1.同位素掺入法：能准确测定蛋白质相对分子质量的一种方法，它的原理是利用质谱方法，将蛋白质样品中的氢原子替换成同位素氢，如²H 或³⁷Cl，用质谱分析同位素掺入后的蛋白质的改变，从而推算出蛋白质的相对分子质量。
2.SDS-PAGE：蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中移动的速度与分子质量有关，可用此方法推算蛋白质的相对分子质量：根据蛋白质在凝胶上移动的时间确定其相对分子质量。
3. 光波谱法：可以通过紫外拉曼光谱（UV-Raman）或者红外谱（IR），计算结合能从而计算蛋白质分子的相对分子质量。
4.质谱分析法：利用质谱技术直接测定蛋白质的大小，包括电喷雾质谱（ESI-MS）、离子化质谱（FAIMS）和质谱分析（MS）等技术。
利用质谱技术，可以测定蛋白质的相对分子质量，从而帮助我们研究蛋白质的特性和作用。
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【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙 醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂， 它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的 二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
4、加样
用移液器分别取10 l样品液，小心将样品加 到凝胶凹形样品槽底部。
5、电泳 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接， 打开电泳仪开关，设置电压为110V，电泳 80mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止 电泳，关闭电源。
6 、染色与脱色 电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开短 玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴 酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染 色液染色60 mins，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带 清晰，即可计算相对迁移率。
2、凝胶的制备
2）浓缩胶的制备
配 制 3% 浓 缩 胶 。 在 烧 杯 中 依 次 加 入 重 蒸 水 3.12ml,浓缩胶缓冲液1.25ml,10%SDS 0.05ml,凝 胶储备液0.6ml，10% 过硫酸铵 25ul和TEMED 5ul（两块胶的量？？？）。混匀后用注射器加到已 聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约 0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。
【操作方法】 １、垂直板电泳槽
2、凝胶的制备
1）分离胶的制备
配 制 12% 分 离 胶 。 在 烧 杯 中 依 次 加 入 重 蒸 水 3.35ml,分离胶缓冲液2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶 储备液4.0ml，10% 过硫酸铵50ul和TEMED 10ul （两块胶的量？？？）。由于AP和TEMED相遇后 凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液 枪抽取3.2~3.5ml凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝 内.再用注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一 层重蒸水,用于隔绝空气，使胶面平整。37℃烘箱下 聚合（约30 -60min）。待凝胶完全聚合.将贮槽的 蒸馏水倒去 ，用细条滤纸吸去残留的水液。
7、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR：
相对迁移率mR=
蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
【思考题】
1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴 酚兰的作用分别是什么？
2、在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的 作用是什么?
有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在 SDS和巯基乙醇作用下ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ解离成亚基或单条肽链，因此 这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的MW。
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。
3、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量
【目的要求】 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色 鉴定。
PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。
PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电 泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场 作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电 颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具 有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者 佳。
当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋 白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 数呈线性关系：
lgMW = K - bm
将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳迁 移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。 只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁 移率，就能根据标准曲线求得其分子量。
轻轻插入梳齿至浓缩胶内，避免带入气泡。约 30min后凝胶聚合。
3、蛋白质样品的处理
1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400
牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后，沸水浴中加热3-5min后上样。