蛋白质相对分子质量的测定(SDS法)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量解析
【实验步骤及操作方法】
1.安装垂直板电泳槽 将密封胶条放在平直玻璃板上，将凹形
玻璃板与 平直玻璃板重叠。 用手将两块玻璃板夹住，放入电泳槽内。 用蒸馏水检漏
2.电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3）：取 Tris6.0g，甘氨酸28.8g，SDS1.0g，用去离子水 溶解后定容至1L。
3.样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白 质）：取SDS0.1g，巯基乙醇0.1mL，甘油 1.0mL，溴酚蓝28.8g，0.2mol/L磷酸缓冲液 0.5mL，加重蒸馏水至10mL。
【试剂配制】
4. 染 色 液 ： 0.25g 考 马 斯 亮 蓝 R-250 ， 加 入 454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸。
5.脱色液：75mL冰乙酸，875mL水与50mL甲醇 6.10% 过 硫 酸 钠 、 10%SDS 、 1% 四 甲 基 乙 二 胺
（TEMED）
【实验材料及预处理】
蛋白质相对分子质量的测定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
【实验目的】
• 理解电泳法测定蛋白质分子量的原理。 • 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本操
作 • 学会绘制标准曲线。
【实验原理】
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）和N，N-甲叉双 丙烯酰胺（Bis）聚合而成，是一种具有交叉网状结构的 凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置 药品的浓度来控制，常用作电泳的载体。
因此，我们可以测定标准蛋白质的迁移率，通过标 准蛋白质相对迁移率的对数对相对分子量作图，得到标 准曲线，根据标准曲线计算出未知蛋白质的相对分子质 量。
sds凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量
sds凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量1. 引言蛋白质是生物体内功能的重要组成部分，研究蛋白质的相对分子质量对于理解其结构与功能至关重要。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种蛋白质分析方法，常用于测定蛋白质的相对分子量。
其原理是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电，使蛋白质在凝胶中按照相对分子量大小进行分离。
具体原理如下：
1. SDS：SDS是一种表面活性剂，它可以与蛋白质发生结合，使得所有蛋白质带有相同的电荷密度。
2. 蛋白质解不性：在SDS存在条件下，蛋白质发生解性，其中SDS会形成不溶解的复合物，使蛋白质具有均一负电荷。
3. 凝胶电泳：将SDS处理后的蛋白质样品加于聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上，施加电场使蛋白质迁移。
4. 分离：由于凝胶电泳胶阻力不同，蛋白质经过一段时间后在凝胶上分离成锥形区带。
5. 相对分子量测定：在同一凝胶中，已知相对分子量已知的标准蛋白质样品与待测蛋白质样品进行分析，通过对比标准蛋白质样品的迁移距离和待测蛋白质样品的迁移距离，可以推算出待测蛋白质样品的相对分子量。
需要注意的是，由于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是以相对分子量进行分析的，所以对于蛋白质的准确分子量测定，还需结合其他方法如质谱等进行综合分析。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。
下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。
SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。
相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。
蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。
通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。
这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。
SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。
（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。
这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。
（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。
随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。
（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。
目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。
SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。
其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。
通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。
二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。
通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。
2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。
3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。
4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。
5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。
打开电源，调整电流和电压，开始电泳。
6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。
7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。
通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。
此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。
测定蛋白质相对分子质量的方法
测定蛋白质相对分子质量的方法
蛋白质相对分子质量可用以下几种常见的实验测定：
1.同位素掺入法：能准确测定蛋白质相对分子质量的一种方法，它的原理是利用质谱方法，将蛋白质样品中的氢原子替换成同位素氢，如²H 或³⁷Cl，用质谱分析同位素掺入后的蛋白质的改变，从而推算出蛋白质的相对分子质量。
2.SDS-PAGE：蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中移动的速度与分子质量有关，可用此方法推算蛋白质的相对分子质量：根据蛋白质在凝胶上移动的时间确定其相对分子质量。
3. 光波谱法：可以通过紫外拉曼光谱（UV-Raman）或者红外谱（IR），计算结合能从而计算蛋白质分子的相对分子质量。
4.质谱分析法：利用质谱技术直接测定蛋白质的大小，包括电喷雾质谱（ESI-MS）、离子化质谱（FAIMS）和质谱分析（MS）等技术。
利用质谱技术，可以测定蛋白质的相对分子质量，从而帮助我们研究蛋白质的特性和作用。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。蛋白 质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中 的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复 合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的 大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁 移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒 的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下 端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配 制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶 模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并 结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质），形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
剥胶示意图
七、染色和脱色
倾出固定液，加入染色液。染色过夜。 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。数小时 换一次脱色液，直至背景清晰，约需一昼夜。
八、Mr的计算
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mr：
蛋白质样品迁移距离(cm) 相对迁移率mr = 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。
引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。
化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。
采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。
因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
三、实验器材及数据30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml四、注意事项1、acr和bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴口罩和手套，纯化应在通风处内进行。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白质相对分子质量的测定
(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)
一、实验原理
蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。
聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。
二、仪器及器材
垂直电泳槽及附件、直流稳压稳流电泳仪、移液器等。
三、试剂
1、凝胶贮备液：称取30g 丙烯酰胺（Acr）和0.8g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），蒸馏水溶解后定容至100mL，滤纸过滤贮存。
2、10% SDS：称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。
3、10%过硫酸胺（AP），用时现配。
4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）。
5、电极缓冲液：3.03g Tris、14.14g甘氨酸、1.0g SDS溶于水，混匀后用HCL调节pH至8.3，加蒸馏水至1 000ml。
6、样品溶解（缓冲）液：0.6gTris、5mL甘油（丙三醇）1.0g SDS溶于水，混匀后用HCL调节pH至8.0，再加0.1g溴酚蓝、2.5mL巯基乙醇，定容至100mL。
7、下层胶（分离胶）缓冲液：18.17g Tris、0.4gSDS溶于水，混匀后用1mol/L HCL 调节pH至8.8，加蒸馏水至100ml。
8、上层胶（浓缩胶）缓冲液：6.06g Tris、0.4gSDS溶于水，混匀后用1mol/L HCL 调节pH至6.8，加蒸馏水至100ml。
9、固定液：25%异丙醇，10%乙酸。
10、染色液：0.125g考马斯亮蓝R-250加固定液250ml。
11、脱色液：冰乙酸75ml、甲醇50ml，加水定容至1000ml。
12、1.5%琼脂：1.5g琼脂溶于100mL电极缓冲液中，加热溶解。
13、标准相对分子质量蛋白质。
四、操作步骤
1、电泳槽的安装
干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用1.5%的琼脂密封。
2、样品的制备
称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mL去离子水研磨成匀浆，转入离心管中，再加入2mL去离子水冲洗研钵，3500r/min离心20min，上清液备用。
将标准蛋白质和待测样品分别溶于样品溶解液，在沸水中加热3-4min，待冷却后作点样用。
3、制胶
选择合适的胶浓度（表1），配制分离胶，混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间（小心不要产生气泡），加到距短玻璃板上边缘3cm处，立即覆盖2-3mm水层，静止聚合约40min左右。
胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰的界面。
吸取分离胶的水分，将配好的浓缩胶（表1）注入分离胶之上，立即插上有机玻璃的点样槽模板，待浓缩胶聚合好备用。
表1 不同浓度凝胶体系
4、点样
用移液器分别吸取标准蛋白质5μL和样品液20μL，注入样品槽内的浓缩胶上面，同时在样品上小心地注入电极缓冲液。
5、电泳
加样完毕，电泳槽内注入适量电极缓冲液，接通电源（上负下正），调节电流为15mA，当指示剂进入分离胶后，电流需加大到30mA，电压恒定在80-100V，约3-4h后，指示剂达到距离前沿1-2cm时，可终止电泳。
6、固定
胶取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后将胶浸泡在25%异丙醇和10%乙酸的混合液中1h，蛋白质就会到固定。
7、染色
取出凝胶板，加入染色液染色2h。
8、脱色
将胶放在脱色液中脱色0.5h，每隔0.5h换一次脱色液，至少换3次，待蓝色基本脱掉，再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止。
9、照相。