UPLC色谱柱技术介绍
色谱分析(中国药科大学)超高效液相色谱(UPLC)
超高效液相色谱(UPLC)超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。
在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。
基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。
它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达1.7µm），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。
这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。
世界第一个商品化UPLC产品是Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，它于2004年3月投入市场。
图1：填料技术的沿革1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。
颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。
由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。
事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。
Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。
Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。
由Van Deemeter方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。
还应该注意到1.7 µm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。
小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。
然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。
小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统的死体积要更小，以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。
(沃特世)UPLC超高效液相色谱介绍
UPLC超高效液相色谱（沃特世）主要特点超高速度1.小颗粒填料色谱柱能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度2.显著增加样品的通量，提高工作效率，降低分析成本3.节省以往一向耗时的方法开发与认证的时间超高灵敏度1.小颗粒技术和整体化的仪器设计，UPLC®能在改善分离度的同时提高灵敏度2.更高的柱效和更窄的色谱峰，意味着更高的色谱峰高和更高的灵敏度3.在得到超高分离度和超高速度的同时能够得到超高灵敏度超高分离度1.利用高效创新小颗粒填料（1.7μL），获得超强分离能力2.超低扩散体积，充分发挥小颗粒填料分离能力3.超高分离度，适合复杂混合物的分离分析超级创新为满足色谱实验室对历史追踪不断增长的需求，每根ACQUITY UPLC®色谱柱出售时均带一个永久性的eCord，它能记录进样次数，最高的反压和柱温，其中还含有由沃特世公司提供的该色谱柱的分析测试合格证书。
色谱柱安装后，智能化的芯片会自动地把关键参数采集进入色谱柱的历史文档，并记录色谱柱整个寿命周期的历史。
该记录不能被删除。
技术参数最大操作压力：15000psi（1mL/min）溶剂输送精度：0.075%RSD或0.02minSD流速范围：0.010-2.000mL/min，增量0.001mL/min梯度曲线：11种。
包括线性、凹线、凸线和两种步进梯度变化有效系统体积:<140μL，与系统反压无关。
带标准混合器溶剂选择:最多四种。
可在A1与A2和B1和B2之间选择交叉污染:0.005%或2nL进样范围:0.5-50μL进样精度:<0.3%RSD进样线性:>0.999样品室温度控制:4 - 40℃色谱柱历史追踪:使用eCord技术检测器配置:紫外可见检测器、光电二极管矩阵检测器、蒸发光散射检测器以及所有质谱检测器超高速度,超高灵敏度,超高分离度,超级创新为满足色谱实验室对历史追踪不断增长的需求，每根ACQUITY UPLC®色谱柱出售时均带一个永久性的eCord，它能记录进样次数，最高的反压和柱温，其中还含有由Waters公司提供的该色谱柱的分析测试合格证书。
waters_uplc_超高液相色谱仪使用方法_概述及解释说明
waters uplc 超高液相色谱仪使用方法概述及解释说明1. 引言1.1 概述本文旨在介绍和解释Waters UPLC超高液相色谱仪的使用方法。
超高液相色谱技术作为一种快速、高效、灵敏的分析方法，已广泛应用于生命科学、环境监测、药物研发等领域。
而Waters UPLC超高液相色谱仪则作为当前市场上领先的仪器之一，拥有先进的特点和优势。
1.2 文章结构本文将按照如下结构来进行介绍和说明：首先，在第2部分中，我们将对Waters UPLC超高液相色谱仪进行详细的介绍，包括其工作原理、构成和组件以及特点和优势。
然后，在第3部分中，我们将概述超高液相色谱分析方法的基本步骤，并重点讨论样品准备工作、色谱柱和流动相选择与优化以及仪器参数设置与调节等方面的内容。
接着，在第4部分中，我们将详细解释使用Waters UPLC超高液相色谱仪的具体步骤和操作说明，包括开机与准备工作、样品处理与注射操作以及方法运行与数据分析等方面。
最后，在第5部分中，我们将总结使用过程中的经验和解决技巧，并展望超高液相色谱在分析领域中的发展方向和应用前景。
1.3 目的本文旨在帮助读者全面了解Waters UPLC超高液相色谱仪的使用方法，包括仪器介绍、分析方法概述以及具体操作步骤。
通过阅读本文，读者将能够熟练运用该仪器进行高效、准确的样品分析，并对超高液相色谱技术在各个领域中的应用前景有更深入的了解。
同时，我们也希望通过分享使用经验和问题解决技巧，能够为相关科研人员提供一些实用的参考和指导。
2. Waters UPLC超高液相色谱仪介绍2.1 原理Waters UPLC（Ultra Performance Liquid Chromatography）超高液相色谱仪是一种高效的色谱分析技术。
其原理基于传统液相色谱，通过使用减小粒径和增强填充剂的方式，实现更高的分离效率和分辨率。
UPLC仪器利用高压泵将样品溶液加速通过色谱柱，在极短的时间内完成分离、富集和检测。
色谱分析(中国药科大学)超高效液相色谱(UPLC)
超高效液相色谱(UPLC)超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。
在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。
基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。
它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达1.7µm），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。
这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。
世界第一个商品化UPLC产品是Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，它于2004年3月投入市场。
图1：填料技术的沿革1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。
颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。
由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。
事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。
Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。
Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。
由Van Deemeter方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。
还应该注意到1.7 µm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。
小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。
然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。
小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统的死体积要更小，以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。
UPLC色谱柱技术介绍
• AAA, OST, PST, PrST and Glycan
Transferability between HPLC and UPLC
HSS T3 HSS C18
HSS C18 SB HSS PFP HSS Cyano
XBridge HPLC and ACQUITY UPLC BEH columns
• BEH 130Å C18, C8, Shield RP18, Phenyl, HILIC and Amide • BEH 300Å C18 and C4 • BEH 200Å SEC
BEH HILIC BEH Amide
• HSS C18, T3, C18 SB,PFP,Cyano • CSH C18, Fluoro-Phenyl and Phenyl-Hexyl
3x107 2x107 1x107
Without VanGuard™ Pre-column
H3C O
H
H
S
HO
ON
With VanGuard™
Pre-column
N H3C
CH3
0
0.60
0.80
1.00
Diltiazem
2.0x106 SIR m/z 415.2
1.20
1.40
Minutes
1.5x106
色谱柱使用维护
©2014 Waters Corporation
23
ACQUITY UPLC 颗粒平台
BEH 亚乙基桥杂化颗粒
130Å, 200Å, 300Å
HSS 高强度硅胶颗粒
100Å
CSH 表面带电杂化颗粒
最新UPLC色谱柱介绍
©2011 Waters Corporation
6
新式可追溯性的eCord 技术
系绳
支架
eCord 永久附在色谱柱上 智能芯片自动下载关键参数到色谱柱历 史文件 提供色谱柱全程使用历史 信息不可删除 存在芯片上的信息可减少记录纸张
包嵌式16 mm微芯片
©2011 Waters Corporation
©2011 Waters Corporation
硅胶的pH应用范围 杂化颗粒的pH应用范围
Neue et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39.
17
增加化合物的保留并提高灵敏度： High pH Mobile phase
2
0.1% NH4OH
5
%
HIGH pH
Primary Manufacturer
Better traceability & control of entire process
Waters
Silica (Hybrid) Bonding Column Packer
Bonder
Column Packers
Distributors
Source & control of particle greatly influences chromatography
0
1
Nortriptyline
Minutes
2
3
Amitriptyline
pH 8
20
pH control critical
8
10
0
1
Minutes
2
3
Nortriptyline
最新UPLC色谱柱技术介绍
UPLC色谱柱沃特世科技（上海）有限公司赵嘉胤Jiayin_zhao@ACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介—UPLC色谱柱技术—VanGuard™ 保护柱如何选择ACQUITY UPLC色谱柱—ACQUITY UPLC BEH色谱柱—ACQUITY UPLC HSS色谱柱—ACQUITY UPLC CSH色谱柱色谱柱使用维护ACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介—UPLC色谱柱技术—VanGuard™ 保护柱如何选择ACQUITY UPLC色谱柱—ACQUITY UPLC BEH色谱柱—ACQUITY UPLC HSS色谱柱—ACQUITY UPLC CSH色谱柱色谱柱使用维护原产厂家化学键合厂柱填充厂分销商硅胶颗粒和杂化颗粒合成填料键合Source & control of silica gel can make a big difference in your chromatography填料键合Waters分拨与销售柱填充分拨与销售柱填充分拨与销售分拨与销售柱填充•Manufactures under cGMP , ISO 9001 and ISO 13485 guidelines •Registered with FDA as a medical device manufacturer填料颗粒的合成坚固高效的1.7 µm BEH 、CSH 和1.8 µm HSS 颗粒迄今为止技术最先进的全多孔颗粒柱效最高，PH 使用范围最宽和卓越的机械强度设计特点全新硬件设计低谱带展宽新型过滤片色谱柱装填柱床稳定，耐受UPLC 工作压力沃特世专有的新型装填技术新的测试仪器软件采用eCord TM 技术无纸追踪色谱柱使用历史支架系绳包嵌式16 mm 微芯片eCord 永久附在色谱柱上智能芯片自动下载关键参数到色谱柱历史文件提供色谱柱全程使用历史 信息不可删除存在芯片上的信息可减少记录纸张色谱柱无纸使用记录VanGuard™ 保护柱特为UPLC®使用而设计ACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介—UPLC色谱柱技术—VanGuard™ 保护柱如何选择ACQUITY UPLC色谱柱—ACQUITY UPLC BEH色谱柱—ACQUITY UPLC HSS色谱柱—ACQUITY UPLC CSH色谱柱色谱柱使用维护BEH亚乙基桥杂化颗粒130Å, 200Å, 300ÅHSS高强度硅胶颗粒100ÅCSH表面带电杂化颗粒130Å行业领先的化学稳定性•宽pH范围，耐受性最强•通用性极佳•固定相种类与柱规格丰富•除通用于小分子化合物，还有专用于生物制药行业的BEH柱产品提高选择与保留•T3 ：增强对极性分子的反相保留能力•C18：提供常规硅胶C18选择性•C18SB:高硅醇活性以增强对碱性分析物的保留，而同时维持好的峰形•Cyano，PFP：提供不同的选择性同时保证色谱峰形使选择性最大化•独特的选择性•低离子强度酸性条件下，对碱性化合物的高载量与优异峰形•较宽pH范围，高低pH条件切换时平衡迅速BEH C 18BEH C 8BEH Phenyl BEH Shield RP18BEH HILICFive particle substrates•130Å, 200Å and 300Å BEH [Ethylene Bridged Hybrid], HSS [HighStrength Silica] and CSH [Charged Surface Hybrid]•All are available in HPLC and UPLC particle sizes Wide and growing selection of column chemistries•15 stationary phases•BEH 130Å C 18, C 8, Shield RP 18, Phenyl, HILIC and Amide •BEH 300Å C and C BEH Amide CSH C 18CSH Fluoro-Phenyl 184•BEH 200Å SEC•HSS C 18, T3, C 18SB,PFP ,Cyano•CSH C 18, Fluoro-Phenyl and Phenyl-HexylProven application-based solutions•AAA, OST, PST, PrST and GlycanTransferability between HPLC and UPLCXBridge HPLC and ACQUITY UPLC BEH columns HSS HPLC and ACQUITY UPLC HSS columnsXSelect HPLC and ACQUITY CSH columnsVanGuard Pre-columns CSH Phenyl-HexylHSS T3HSS C 18HSS C 18SB HSS PFP HSS CyanoACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介—UPLC色谱柱技术—3.0mm ID UPLC色谱柱—VanGuard™ 保护柱如何选择ACQUITY UPLC色谱柱—ACQUITY UPLC BEH色谱柱—ACQUITY UPLC HSS色谱柱—ACQUITY UPLC CSH色谱柱UPLC-HPLC方法无缝转换UPLC生物分子分析方案New 2.5 µm eXtended Performance Columns 介绍U.S. Patent No. 6,686,035 B2Bridged Ethanes within a silica matrixWide pH range (1-12)High pressure toleranceEnhanced efficiency (1.7 µm)XTerra ®MS C 18BEH C 18测试终止(估计>250 h)测试终止(估计>250 h)BEH HILIC 050100150200250300在50mM TEA 中实验时数(pH 10, 50°C)Symmetry ® C 18Silica C 18–品牌A Silica C 18–品牌BOH -OH -•仅需打断四个硅氧键即可腐蚀一个硅单位•表面腐蚀所产生的硅酸离子在流动相中溶解度大,使硅胶基体溶解的反应向右移动, 从而加快了溶解速度•pH >7时上述腐蚀过程容易发生•须同时断裂六个键才可以去除经乙基桥键连接的两个硅单位(该过程极难发生)•填料基体溶解所产生的有机硅离子在流动相中的溶解度较低, 因此容易累积在填料微孔表面, 有时可能会重新连接回颗粒表面, 形成所谓的‘自我修复’机制。
UPLC超高效液相色谱入门指南沃特世
首先，导入采集到的色谱数据；其次，进行基线校正以消除背景干扰；接着，进行峰识 别与积分以确定各色谱峰的保留时间和峰面积；最后，根据标准曲线进行定量分析，得
到各组分的浓度信息。
结果解读与报告生成
结果解读
根据处理后的色谱数据和定量分析结果， 可以解读出样品中各组分的含量和相关信 息。需注意检查数据的合理性和准确性。
妥善处理。
核实实验室是否遵守环保法规 和相关标准，如废水、废气、 噪声等排放是否符合环保要求。
个人防护措施和应急处理能力培训
对实验人员进行个人防护知识培训，包括如何正确佩戴和使用个人防护装备，如防护服、护目镜、手 套等。
提供应急处理能力培训，包括如何应对实验过程中可能出现的突发情况，如化学品泄漏、火灾等。
避免污染和交叉污染措施
使用高质量的试剂和溶剂， 减少杂质和污染物的引入。
对于不同性质的样品，要 采用不同的进样器和色谱 柱，避免交叉污染的发生。
ABCD
定期清洗进样器、色谱柱 和检测器等部件，避免残 留物对后续分析的影响。
在更换样品或溶剂时，要 彻底清洗相关部件，确保 无残留物对后续分析造成 干扰。
生物分析
要点二
食品分析
UPLC可用于生物样品（如血液、尿液等）中生物标志物的检 测和分析。
UPLC可用于食品添加剂、营养成分等的检测和分析。
沃特世UPLC技术特点
高品质色谱柱
先进的仪器设计
沃特世提供多种类型的高品质色谱柱，满足 不同分离需求，确保分析结果的准确性和可 靠性。
沃特世UPLC仪器设计先进，操作简便，具有 高度的稳定性和可靠性，确保长时间运行的 稳定性和准确性。
分离系统
即色谱柱，是实现样品中各组分分离的关 键部分。
超高压液相色谱
用一强一弱的双溶剂进样）和自动进样三种方式；
降低样品在检测池内的驻留时间）。
应用
超高压液相色谱（UPLC）是一种新型的色 谱分析技术，可以单独使用，也可以和其他 色谱如质谱联用（UPLC／MS）。主要应用 有：
中药复杂成分的分析，环境监测，农药残留
物的检测及蛋谢组学等领域，且具有很好的 推广价值。
不足
一、压力高，溶剂的粘度会上升，流量降低（可根
据设定的流量与实际流量进行流量补偿）
二、流动相以较高速度流过固定相时，因摩擦可产生
热量，加之流动相和固定相的导热性能较差，可导
致温度梯度的出现，造成峰展宽和柱效的下降（流 动相预冷）。 三、在超高压下运行的色谱柱可能发生液体喷射和管 壁迸裂。（不常发生）
A、B、C均为常数，其中： A—涡流扩散项系数 B—分子扩散项系数 C—传质阻力项系数 各项均与固定相粒度(dp)相关 如仅考虑dp对H的影响，(1)式可表示为： H=a(dp)+b／v+c(dp) 2v (2)
由（2） H=a(dp)+b／v+c(dp) 2v 可知： 在相同线速度下，填料粒径（dp）越小，理 论塔板高度越小，柱效越高。 小颗粒填料的另一个重要特征是：当增加流 量(线速度)时塔板高度没有明显的增大，且 维持在一定范围内，即在较大流量范围内保 持较高的柱效。因此，可以通过增加流量来 加快分离速度，同时维持较高的柱效和良好 的分离效果。
特点
与其他液相色谱相比较，UPLC具有以下几个特点： 1、填料粒径小，压力大 UPLC 粒径 <2um HPLC 5~10um
超高效液相色谱(uplc)
超高效液相色谱(UPLC TM)：重新定义液相色谱分离科学的能力随着首次成功地使用小颗粒得到惊人的分离能力而进入了一个新的时空。
这个新的色谱领域，所谓超高效液相色谱（UPLC TM），与传统的HPLC技术相比提供了更高的效率，因而具有更强的分离能力。
作为世界第一个商品化UPLC TM产品的Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，利用创新技术进行整体设计，大幅度地改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度。
UPLC TM的商品化，是分离科学和技术的巨大进步，液相色谱亦由此进入了全新的时代。
基于1.7 μm小颗粒技术的UPLC TM，与人们熟知的HPLC技术具有相同的分离原理。
不同的是：UPLC TM不仅比传统HPLC具有更高的分离能力，而且结束了人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史。
使用UPLC TM可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果。
小颗粒分离的理论与科学基础图1：填料技术的沿革液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。
颗粒度的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产品直接影响。
由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。
事实上，上述规律的理论基础是著名的范德米特(van Deemeter)方程――这是全世界所有从事色谱研究的科学家熟知的理论。
由此得到的范德米特(van Deemeter)曲线，亦是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。
该曲线预测最佳柱效与相应的流动相流速。
由曲线得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。
还应该注意到1.7 μm颗粒的HETP最小值区域扩大了，这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来优化流速（分析速度）。
小颗粒为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。
然而HPLC系统的设计，一直苦于难于发挥出最小颗粒的优点。
什么是UPLC？和HPLC有什么区别？
什么是UPLC？和HPLC有什么区别？UPLC是一个新兴的领域，今日就跟大家共享一些干货。
UPLC：超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography）色谱理论认为提高色谱柱的效能（efficiency）就能增加仪器的解析度（resolution），而运用粒径低于2m的小颗粒无疑是增加效能的好方法。
但减小固定相的粒度以增加色谱柱效能始终的色谱仪器科学的瓶颈，由于小颗粒不仅要求系统能承受高于目前极限压力（比如9000psi），需要更小的系统体积（死体积），并且需要能适应可能只有几秒峰宽的高速检测器。
UHPLC：超高效液相色谱(Ultra-High Performance Liquid Chromatography)特点是工作压力超过6000 psi或工作温度超过环境温度的应用。
由于 UHPLC 应用中使用的硬件通常可以承受 9000 psi或更高的系统压力，因此色谱工作人员可以使用由更高级固相（其颗粒远远小于传统的5 m直径硅胶）填充的色谱柱。
采纳颗粒更小的固相不仅可以实现更高的辨别率，同时还能缩短整体分析时间。
HPLC：高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography）又称"高压液相色谱'、"高速液相色谱'等。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流淌相，采纳高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流淌相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分别后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分别分析技术。
UPLC和HPLC的区分与传统的高效液相色谱(HPLC)相比，UPLC具有高分别度(ultra resolution)、高速度(ultra speed)、高灵敏度(sensitivity)等优势。
ACQUITYUPLC系统央速入门指南
ACQUITYUPLC系统央速入门指南ACQUITYUPLC系统是一种高效液相色谱（UPLC）系统，可以在较短的时间内实现高分辨率、高灵敏度的分析。
本文将为你介绍ACQUITYUPLC系统的基本原理、操作流程以及常见的故障处理方法，帮助你快速入门。
一、基本原理1.更小的粒径：UPLC柱的颗粒粒径通常为1.7-2.5μm，而传统液相色谱柱的颗粒粒径通常为5-10μm。
这样可以获得更高的分离效率和灵敏度。
2.更高的线性范围：UPLC系统的线性范围通常为几个数量级，可以扩展到更广泛的浓度范围内进行分析。
3.较短的分析时间：由于颗粒粒径更小，流速可以提高，从而减少分析时间。
二、操作流程1.样品准备：根据需要选择适当的样品处理方法，如固相萃取、气相萃取、液液萃取等，将样品准备成可注射的样品溶液。
2.系统准备：开机前，检查系统的电源、液相泵、进样器及检测器等设备是否工作正常。
根据分析需要设置分析方法。
3.柱的安装：选择合适的柱，将柱连接至液相流动系统，并确保连接紧固。
4.进样：将准备好的样品溶液使用自动进样器自动注入进样环中，或手动使用微量注射器进行注射。
5.运行分析：启动分析方法，进行样品的分离与检测。
分析过程中可以监控色谱峰的形状、信号强度等参数进行实时调整。
6.数据处理：分析结束后，根据需要导出、处理数据，并进行结果分析。
三、常见故障处理方法1.泵压不稳定：检查泵的连接管路是否松脱或堵塞，或检查是否有气泡进入系统中。
2.色谱峰形状不对称：检查柱温度是否稳定，柱是否受损，或检查是否有杂质污染样品溶液。
3.信号强度低：检查检测器的灵敏度设置是否正确，检查样品进样量是否足够，或检查柱是否老化需要更换。
4.样品丢失：检查进样针是否堵塞，或检查进样器的封口情况。
5.系统噪声大：检查所有连接部位，确保紧固连接，检查结果是否被电磁干扰。
以上是ACQUITYUPLC系统央速入门指南的简要介绍，希望能够帮助你快速了解ACQUITYUPLC系统的基本原理、操作流程以及常见的故障处理方法。
UPLC色谱柱技术介绍
UPLC色谱柱技术介绍UPLC（Ultra Performance Liquid Chromatography）是高效液相色谱技术的一种改进版本，它采用更小的颗粒尺寸和更高的流速，以提高分离效率和样品分析速度。
UPLC色谱柱是UPLC系统中的核心组成部分，起着关键的作用。
本文将介绍UPLC色谱柱的技术原理、分类，以及在各个领域的应用。
一、UPLC色谱柱的技术原理UPLC色谱柱的技术原理与传统的液相色谱柱类似，都是利用样品分子在固定相上的相互作用，使其在流动相中发生分离。
但是UPLC色谱柱使用更小的超高压液相色谱柱，颗粒尺寸通常在1.7-2.5微米之间，而传统的液相色谱柱颗粒尺寸通常在5-10微米之间。
此外，UPLC系统使用更高的流速，通常在0.2-1.0mL/min，而传统的液相色谱系统流速通常在1-2mL/min。
二、UPLC色谱柱的分类根据不同的色谱柱填充材料，UPLC色谱柱可分为以下几种类型。
1.反相色谱柱（RP）反相色谱柱使用疏水性纯化填料，如C18，C8或C4等，常用于生物、药物等复杂样品的分离。
其原理是通过样品分子与填料上的疏水性相互作用，实现分离。
2.正相色谱柱（NP）正相色谱柱使用亲水性纯化填料，如二氧化硅或硅胶等，常用于分析极性化合物，如氨基酸、酸碱中草药等。
3.离子交换色谱柱（IEC）离子交换色谱柱根据样品中的带电物质与填充材料的离子交换作用分离物质。
这种色谱柱常用于对有机酸、无机阳离子和阴离子的分析。
4.大孔色谱柱（SEC）大孔色谱柱用于分离较大的生物分子，如蛋白质、多肽等。
大孔色谱柱具有较大的孔径和相应的填充材料，以便样品分子可以在孔道中快速穿透。
三、UPLC色谱柱的应用1.制药领域在药物开发和质量控制中，UPLC色谱柱能够快速高效地分离和分析药物成分。
同时，UPLC系统还可与质谱联用，实现对复杂样品的同时定性和定量分析。
2.食品安全领域3.环境监测领域4.生物医学研究领域总结：。
色谱分析(中国药科大学) 超高效液相色谱(UPLC)
色谱分析（中国药科大学）超高效液相色谱(UPLC)超高效液相色谱(UPLC)超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。
在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。
基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。
它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达 1.7µm），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。
这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。
世界第一个商品化UPLC产品是Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，它于2004年3月投入市场。
图1：填料技术的沿革1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。
颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。
由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。
事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。
Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。
Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。
由Van Deemeter 方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。
还应该注意到1.7 µm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这2表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。
小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。
然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。
超高效液相色谱(UPLC)
高通量实验室始终要求在单位时间内提供更 多的信息和处理更多的样品并保证提供高质 量的数据。 较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。
L N∝ dp
颗粒度减小后，柱长可以按 比例缩短而保持柱效不变
1 颗粒度越小，最佳流速也越 最佳流速∝ —— 大，进而可以通过提高流速 dp
来进一步加快分离速度
如果仅考虑如果只关心理论塔板高度（H）与流速 （线速度；u）及填料颗粒度（dp）之间的关系， 其简化方程式可表达为：
在相同线速度下，填料粒径（dp）越小，理论塔板 高度越小，柱效越高。
超高分离度
k2 N 1 α பைடு நூலகம் Rs = ( ) ( ) ( ) k2 + 1 α 4 1 L
N∝
dp
随着dp的降低，N值会增加；而 N值增加，则Rs值增加
理论基础
UPLC保持了传统HPLC的基本原理，但其分离效能和分 析速度却得到了全面提升，这归功于其独特的小颗粒色 谱填料技术。
在高效液相色谱速率理论中， Van Deemter方程式的简 化表达式：
A、B、C均为常数，其中： A—涡流扩散项系数 B—分子扩散项系数 C—传质阻力项系数 各项均与固定相粒度(dp)相关
ACQUITY UPLCTM 系统： 1.7 μm 颗粒提供 的柱效比5 μm颗粒提高了3倍。1.7 μm颗粒 的分离度比5 μm颗粒提高了70％。
UPLCTM用1.7 μm颗粒提高了分离能力，可以分离 出更多的色谱峰，从而对样品提供的信息达到了一 个新的水平。
UPLCTM与HPLC：分离度比较
超高速度
超高效液相色谱(UPLCR)简介
超高效液相色谱(UPLC®)简介UPLC原理基础随着科学技术的进步，液相色谱用户对液相色谱技术的要求也不断提高，他们需要“更快地得到更好的结果”。
因此超高效液相色谱（UltraPerformance LC®）概念的提出也就十分自然；简单的说：UPLC是用HPLC的极限作为自己的起点，把分离科学推向一个新领域。
沃特世公司引入UPLC的概念是由研究著名的vanDeemter 方程式及其曲线开始。
由van Deemter曲线可以得到以下几点启示:首先,颗粒度越小柱效越高；其次,不同的颗粒度有各自最佳柱效的流速；最后，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围。
所以降低颗粒度不但能提高柱效，同时还能提高分析速度。
使用更高的流速会受到色谱柱填料耐压及仪器耐压的限制。
反之；如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高柱效就无法体现。
此外；更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测速度等一系列条件的支持，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。
因此；要真正创建一个全新的分离科学领域－UPLC，必须解决以下几个问题：1. 大幅度提高色谱柱的性能:第一要解决小颗粒填料的耐压问题，第二要解决小颗粒填料的装填问题，包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构。
2. 高压溶剂输送单元（超过15,000psi）3. 完善的系统整体性设计，降低整个系统的体积，特别是死体积,并解决超高压下的耐压及渗漏问题。
4. 快速自动进样器，降低进样的交叉污染5. 高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问题6. 系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器的控制问题新型的色谱填料及装填技术UPLC分离只有在新型的、耐压而且颗粒度分布范围很窄的1.7µm颗粒填料合成出来之后才有可能实现。
色谱柱技术应该涵盖几个方面的内容：首先是填料的合成，以得到高质量的填料颗粒，包括：耐高压、耐酸碱等等。
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包嵌式16 mm微芯片
20
UPLC色谱柱使用历史
色谱柱无纸使用记录
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21
VanGuard™ 保护柱 特为 UPLC® 使用而设计
第一个也是唯一能在高达 15,000 psi (1,000 bar)下 日常使用的保护柱
培训教程 (UPLC色谱柱)
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1
内容提要
ACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介
– 色谱柱基础知识介绍 – UPLC色谱柱技术 – VanGuard™ 保护柱
如何选择ACQUITY UPLC色谱柱
– ACQUITY UPLC BEH色谱柱 – ACQUITY UPLC HSS色谱柱 – ACQUITY UPLC CSH色谱柱 – NEW CORTECS色谱柱
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提高选择与保留
•T3 ：增强对极性分子的反 相保留能力 •C18：提供常规硅胶C18选 择性 •C18SB:高硅醇活性以增强 对碱性分析物的保留，而 同时维持好的峰形 •Cyano， PFP：提供不同的 选择性同时保证色谱峰形
使选择性最大化
•独特的选择性 •低离子强度酸性条件下，对 碱性化合物的高载量与优异 峰形 •较宽pH范围，高低pH条件 切换时平衡迅速
Si-OH = 硅羟基(Silanol)
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130Å and 300Å 1.7 um BEH Particles （电镜照片）
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填料的合成 —2.键合配体（键合相）
填料的内孔表面 流动相
色谱填料是多孔颗粒（“海绵” ），99％发生色谱分离的表面
是在内孔表面
被测物分子 量( MW)
推荐使用的 填料孔径
< 3,000
3,000 – 10,000 >10,000
非常大
60 -130 Å (6 -13 nm)
125-200 Å (12.5-20 nm)
300 – 1,000 Å (30 -100 nm)
无孔填料
注意：孔径是分布值
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HSS HPLC and ACQUITY UPLC HSS columns XSelect HPLC and ACQUITY CSH columns
VanGuard Pre-columns
CSH C18 CSH Fluoro-Phenyl
eCord Technology
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色谱柱装填 柱床稳定，耐受UPLC工作压力 沃特世专有的新型装填技术 新的测试仪器
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软件 采用 eCordTM 技术无纸 追踪色谱柱使用历史
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新式可追溯性的eCord 技术
系绳
支架
eCord 永久附在色谱柱上 智能芯片自动下载关键参数到色谱柱历 史文件 提供色谱柱全程使用历史 信息不可删除 存在芯片上的信息可减少记录纸张
• BEH 130Å C18, C8, Shield RP18, Phenyl, HILIC and Amide • BEH 300Å C18 and C4 • BEH 200Å SEC
BEH HILIC BEH Amide
• HSS C18, T3, C18 SB,PFP,Cyano • CSH C18, Fluoro-Phenyl and Phenyl-Hexyl
Analyte
必须允许流动相进入内孔以 保证待分析和分离的化合物 能够和色谱填料有保留
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9
C18 填料的合成 —3.端基封尾
端基封口基团
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键合相(配体)：C18
残留硅羟基 硅胶基质
10
对色谱柱填料的了解(一)
o 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差)
– 颗粒分布 o 颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差)
– 颗粒形状 o 球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀 o 无定型：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均 匀谱带扩展
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15
对色谱柱填料的了解(五)
1.80
2.00
Minutes
22
内容提要
ACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介
– 色谱柱基础知识介绍 – UPLC色谱柱技术 – VanGuard™ 保护柱
如何选择ACQUITY UPLC色谱柱 – ACQUITY UPLC BEH色谱柱 – ACQUITY UPLC HSS色谱柱 – ACQUITY UPLC CSH色谱柱 – 1.6um Cortecs solid-core particles色谱柱
色谱柱使用维护
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ACQUITY UPLC 颗粒平台
BEH 亚乙基桥杂化颗粒
130Å, 200Å, 300Å
HSS 高强度硅胶颗粒
100Å
CSH 表面带电杂化颗粒
130Å
行业领先的化学稳定性
• 宽pH范围，耐受性最强 • 通用性极佳 • 固定相种类与柱规格丰富 • 除通用于小分子化合物， 还有专用于生物制药行业 的BEH柱产品
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3
沃特世质量控制体系
以可靠的柱性能使长期项目和分析方法的风险最小化
沃特世自主研发和生产高纯硅胶与杂化颗粒， 从起始的单体材料开始，直至成品
按每批1 - 2 Kg 的较小规模生产，以便严格 准确地控制影响工艺变化的参数
制造工厂经认证依从cGMP规范、 ISO9001 以及ISO13485
专利的超低扩散设计
有效地防护和保持 UPLC® 色 谱柱的粒、过滤片；每种色谱柱都 有相应的保护柱
规格：2.1 mm ID x 5 mm
intens
intens
6x107 Desacetyl Diltiazem
SIR m/z 373.2
5x107
4x107
硅胶的活性 – 主要影响碱性化合物的保留行为：k' – 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 – 是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 – 重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 – 是色谱柱质量好坏的重要标志
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对色谱柱填料的了解(六)
填料的pH稳定性 – 硅胶填料 pH：2-8 – 聚合物填料 pH：2-12 – 杂化硅胶填料 pH：2-12 pH值小于2时键合相水解 pH值大于8时硅胶溶解
色谱柱使用维护
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18
9术上的突破:
UPLC® 色谱柱技术
填料颗粒的合成 坚固高效的 1.7 µm BEH 、CSH和 1.8 µm HSS 颗粒 迄今为止技术最先进的全多孔颗粒 柱效最高，PH使用范围最宽和卓越的机械强度
设计特点 全新硬件设计 低谱带展宽 新型过滤片
o 单键键合,双键键合,三键键合 o 配体覆盖率(疏水性不同)
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对色谱柱填料的了解(二)
填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）
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对色谱柱填料的了解(三)
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The Widest UPLC Offerings 最广泛的UPLC产品供给！-沃特世
Five particle substrates
BEH C18
• 130Å, 200Å and 300Å BEH [Ethylene Bridged Hybrid], HSS [High
Strength Silica] and CSH [Charged Surface Hybrid]
色谱柱使用维护
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5
C18 填料的合成 —1.硅胶基质的合成（多孔）
硅胶颗粒基质
硅羟基
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Polyethoxysilane (PEOS)
Tetraethoxysilane (TEOS)
6
硅胶的孔结构
孔占据大于99%填料表面
1.0x106 5.0x105
Without VanGuard™ Pre-column
1.60
1.80
2.00
O CH3
S
O
N
O
O H3C
H3C
N CH3
With VanGuard™ Pre-column
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0.0
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
硅胶的溶解曲线
123456789 pH
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内容提要
ACQUITY UPLC色谱柱背景知识简介
– 色谱柱基础知识介绍 – UPLC色谱柱技术 – VanGuard™ 保护柱
如何选择ACQUITY UPLC色谱柱
– ACQUITY UPLC BEH色谱柱 – ACQUITY UPLC HSS色谱柱 – ACQUITY UPLC CSH色谱柱 – NEW CORTECS色谱柱
填料键合
柱填充