分子标记在水稻育种中的应用

水稻是我国最主要的粮食作物，水稻生产在未来几十年内要保持稳定的增长，这一增长是在更少的土地和水资源的条件下完成的，培育高产、优质、抗病虫性及抗逆性强的品种是水稻生产可持续发展的最佳途径。

传统育种主要是在不甚明了基因背景的条件下，通过杂交和各种育种技术，根据植株在田间的表现进行评价与选择。

表型性状不仅取决于遗传组成也受控于环境条件，而环境效应较易掩盖基因效应，因此，仅从表型进行选择显然是不理想的，特别是对受多个基因控制的数量性状选择，更难做到准确。

随着近二十年来现代分子生物学技术的应用与发展，特别是遗传标记的出现与应用，为作物育种提供了强有力的工具。

在遗传学实验中，通常将可识别的等位基因差异或遗传多态性称为遗传标记。

在遗传学的发展过程中，先后出现了以下四种遗传标记：形态标记、细胞标记、生理生化标记、分子标记。

其中以分子标记最为理想，因为ＤＮＡ水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，甚至是单个核苷酸的变异，因而其数量几乎是无限的。

与以往的遗传标记相比，ＤＮＡ标记还有许多特殊的优点，如无表型效应、不受环境限制和影响等。

１ＤＮＡ分子标记的分类自１９７４年Ｇｒｏｄｚｉｃｋｅｒ创立了限制性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒ－ｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）标记技术以来，分子标记得到最广泛的应用。

ＤＮＡ分子标记是ＤＮＡ水平的直接反映。

依据对ＤＮＡ检测手段，ＤＮＡ分子标记可以分为四类（方宣钧，２００１）：第一类为基于ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交的ＤＮＡ分子标记，该技术通过限制性酶切、凝胶分离、探针杂交、显色技术来揭示ＤＮＡ的多态性。

其中最具代表性的是发现最早、应用广泛的分子标记在水稻育种中的应用李春光，刘华招（黑龙江省农垦科学院水稻研究所，黑龙江佳木斯１５４０２５）摘要：分子标记技术的应用日趋广泛，对水稻育种研究有重要的价值。

通过重点介绍近年来分子标记在水稻分子遗传图谱的构建、遗传资源保存和遗传多样性分析、基因的标记及克隆、分子标记辅助育种等方面研究的应用情况，探讨了分子标记的应用在水稻育种上的优势。

关键词：分子标记；水稻；育种收稿日期：２００７－０３－０９作者简介：李春光（１９７８－），男，研究实习员。

综述２００７年第５期中图分类号：Ｓ５１１．０３５．３文献标志码：Ａ文章编号：１６７３－６７３７（２００７）０５－００１９－０６ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭａｋｅｒｓｔｏＲｉｃｅＢｒｅｅｄｉｎｇＬＩＣｈｕｎ－ｇｕａｎｇ，ＬＩＵＨｕａ－ｚｈａｏ（ＲｉｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＪｉａｍｕｓｉＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５４０２５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｗｉｄｅｕｓｅｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｈａｓｐｌａｙｅｄａｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｓｉｔｕａｔｉｏｎｓｏｆａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｉｎｖｏｌｖｉｎｇｒｉｃｅｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｔｉｃｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓ，ｇｅｎｅｔａｇｇｉｎｇａｎｄｃｌｏｎｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄａｎｄａｄｖａｎ－ｔａｇｅｓｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｏｎｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ；ｒｉｃｅ；ｂｒｅｅｄｉｎｇ１９－－ＲＦＬＰ标记。

第二类为基于ＰＣＲ技术的分子标记。

ＰＣＲ技术以其简便、快速、高效的特点迅速成为分子生物学的有力工具，尤其是在分子标记技术的发展中更是起到了巨大作用。

这类标记中随机引物ＰＣＲ标记包括ＲＡＰＤ、ＩＳＳＲ等，特异引物ＰＣＲ标记包括ＳＳＲ、ＳＴＳ、ＳＣＡＲ等。

第三类为基于ＰＣＲ与限制性酶切技术结合的ＤＮＡ分子标记，包括ＡＦＬＰ、ＣＡＰＳ等。

第四类为基于单核苷酸多态性的ＤＮＡ分子标记，如ＳＮＰ等。

２分子标记技术在水稻育种上的应用数十种以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交ＰＣＲ扩增为技术特征的ＤＮＡ分子标记技术已陆续建立和应用于生物遗传育种的研究工作中。

分子标记技术广泛用于水稻育种工作各个方面，目前，分子标记主要应用于构建分子标记图谱、重要农艺性状的基因定位及克隆、种质资源的保存与利用、分子标记辅助选择等。

２．１水稻分子遗传图谱的构建高密度分子标记遗传连锁图谱的构建，可为基因定位、物理图谱构建和以图谱为基础的目的基因克隆奠定基础，还可为分子标记辅助选择创造条件。

遗传图谱是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图。

经典的遗传图谱是根据形态、生理和生化标记构建的，由于这些遗传标记在作图群体的两亲本上极为有限，发展很缓慢，且图谱分辨率、饱和度不高，所以应用价值有限。

而将分子标记应用于遗传图谱的构建是遗传界的又一重大进展。

１９８８年，ＭｃＣＯＵＣＨ等利用ＩＲ３４５８３（籼）／ＢｕｌｕＤａｌａｍ（爪哇）杂交产生的Ｆ２群体构建了第一张水稻ＲＦＬＰ分子连锁图谱，该图包括１３５个标记（包括同工酶标记），全长１３８９ｃｍ。

日本和美国将构建的分子图谱整合后获得更致密、更精细的图谱。

１９９４年，ＣＡＵＳＳＥ等构建了包含８１６个标记的连锁图。

陈洪等构建的水稻分子标记图谱有５２个ＲＡＰＤ标记，覆盖基因组总长度为８９８．４ｃｍ，标记间的平均间距为１７．３ｃｍ。

现在，在ＲＧＰ网站上，ＹＡＮＯ等构建的连锁图上有３２６７个标记，其中绝大多数为限制性片段长度多态性标记，并且几乎都被转换成了切割长度多态性标记（ｃｌｅａｖｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙ－ｍｏｒｐｈｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＣＡＰＳ）。

水稻基因组测序计划已经完成，这将为水稻基因组研究提供更多的标记。

目前的数据表明，水稻遗传图谱上的分子标记数已超过６０００个，平均间距为７５～１００ｋｂ，基本覆盖了水稻基因组的所有区域。

另外，美国康乃尔大学构建了水稻微卫星标记连锁图，图上的微卫星标记已达２７４０多个。

据估计，在水稻基因组中大约有５７００～１００００个微卫星。

最近一个包括３１２个ＳＳＲ标记和１４５个ＲＦＬＰ标记的水稻分子连锁图已在康乃尔大学构建。

这些图谱的构建大大加速了基因定位和基于图谱的基因克隆，同时也可对控制数量性状的基因位点进行遗传剖析，为构建完整的物理图谱提供了线性框架。

２．２基因定位及克隆基因定位就是确定基因在染色体上的位置及与之相连锁的标记。

由分子标记定位的控制水稻重要性状的基因已超过１００个，作物的许多重要经济性状属于微效多基因控制的数量性状。

传统的数量遗传学研究方法对于鉴别单个数量基因及与之有关的染色体片段和确定ＱＴＬ在染色体上的位置等显得无能为力。

ＤＮＡ分子标记的建立和发展，使作物ＱＴＬ作图及其定位方法的研究进展很快。

从１９９４年以来有关水稻数量性状ＱＴＬ定位的研究不断被提出，而其中以产量及抽穗期有关的ＱＴＬ报道最多。

在被定位的基因中以抗病虫的基因定位最多，特别是抗稻瘟病和白叶枯病的基因，这有利于将抗同一疾病的不同基因聚合到同一品种中，以增强该品种对这一疾病的抗谱，获得持续抗性。

此外，已定位的主要基因还包括恢复基因、广亲和基因、高秆隐性基因、显性核不育基因和光敏雄性核不育基因等。

首批稻瘟病抗性基因被ＧＯＴＯ、ＹＡＭＡＳＡＫＩ和ＫＩＹＯＳＡＷＡ等定位。

它们是Ｐｉａ、Ｐｉｉ、Ｐｉｋ、Ｐｉｋｓ、Ｐｉｋｈ、Ｐｉｋｍ、Ｐｉｋｐ、Ｐｉｚ、Ｐｉｚｔ、Ｐｉｔａ、Ｐｉｔａ２、Ｐｉｂ、Ｐｉｔ和Ｐｉｓｈ。

到目前为止，已鉴定出３０个抗稻瘟病位点，其中约２０个为主效基因，其余为数量性状位点。

有些位点上已经鉴定出不止一个等位基因如Ｐｉ２ｋ位点有５个，Ｐｉ２ｚ有２个，有些则属于非等位性的。

近年来，应用ＰＣＲ技术对其中一些抗瘟性基因也找到了ＲＡＰＤ或ＰＣＲ衍生标记，包括Ｐｉ２ｈ２１（ｔ）、Ｐｉ２ｔａ、Ｐｉ２ｂ、Ｐｉ２１、Ｐｉ２２（ｔ）、Ｐｉ２６（ｔ）、Ｐｉ２１１（ｔ）、Ｐｉ２１０（ｔ）和Ｐｉ２１２（ｔ）。

到目前为止，在水稻中克隆到的５个抗性基因包括３个抗白叶枯病基因（Ｘａ－１、Ｘａ－２１和Ｘａ－２１Ｄ）和２个抗稻瘟病基因（Ｐｉ－ｂ和Ｐｉ－ｔａ）。

Ｐｉ－ｂ基因是首个２０－－在水稻中被克隆的抗稻瘟病基因，它是ＷＡＮＧ等利用图位策略克隆出来的。

其表达产物含有一个核苷酸结合位点（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ，ＮＢＳ）和亮氨酸重复序（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔ，ＬＲＲ）。

Ｐｉ－ｔａ基因位于水稻第１２染色体靠近着丝点附近的区域，编码是由９２８个氨基酸残基组成的富含亮氨酸重复序列的细胞质膜受体蛋白。

截至２００５年６月，经国际注册确认和期刊报道的水稻白叶枯病抗性基因共３０个，其中Ｘａ２２（ｔ）、Ｘａ２６（ｔ）、ｘａ２６（ｔ）、Ｘａ２７（ｔ）、ｘａ２８（ｔ）、Ｘａ２９（ｔ）和３个Ｘａ２５（ｔ）为暂定名基因。

已被定位的抗性基因有１７个，即第１１染色体上有７个，Ｘａ３、Ｘａ４、Ｘａ１０、Ｘａ２１、Ｘａ２２（ｔ）、Ｘａ２３和Ｘａ２６；第４染色体上有４个，Ｘａ１、Ｘａ２、Ｘａ１２和Ｘａ１４；第５染色体上有２个，ｘａ５和ｘａ１３；第６染色体上有Ｘａ７和Ｘａ２７；第１２染色体上有Ｘａ２５（ｔ）；第１染色体上有Ｘａ２９（ｔ）。

从水稻品种资源中发现了至少２６个抗白叶枯病基因。

迄今为止，利用这些标记在水稻中已克隆了３个抗白叶枯病基因即Ｘａ－２１、Ｘａ－１和Ｘａ－５。

科学家们发现了水稻对白背飞虱的抗性基因主要有６对，分别定名Ｗｂｐｈ２１、２、３、４、５、６。

利用分子标记进一步定位发现Ｗｂｐｈ２１与ＲＦＬＰ标记ＲＧ１４６、ＲＧ４４５共分离，但ＲＧ１４６、ＲＧ４４５在水稻基因组内为多拷贝标记，故未能进行染色体定位。

水稻对褐飞虱的抗性基因至少有９个位点，其中４个为显性抗性基因（Ｂｐｈ－２１、３、４、７），５个为隐性基因。

通过分子标记分析已经将来自野生稻Ｏｒｙｚａａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ的Ｂｐｈ抗性基因定位在第１２染色体；将汕桂占的Ｂｐｈ抗性基因定位于第９染色体，位于ＲＺ４０４与ＵＣＨ１７０之间；发现来源野生稻Ｏ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ的Ｂｐｈ抗性基因与位于第４染色体上的ＲＧ２１４相关；发现Ｂｐｈ－２１位于第１２染色体上的分子标记Ｃ１８５与ＸＮｐｈ２４８之间。

此外，我国学者王布哪等发现了两个抗褐飞虱基因新位点，并将它们定位于第３染色体的Ｇ１３１８和Ｒ１９２５及第４染色体的Ｃ８２０和Ｓ１１１８２之间。