分子标记技术及其应用_ISSR

代表的4个柑桔品种。
基于ISSR分析的14份南丰蜜桔UPGMA聚类图
种质资源鉴定与亲缘关系
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果树生命周期长，并长期通过无性方式繁殖，加上不 同地域间的相互引种，使同名异物和同物异名现象十分普 遍，如何准确地对现有果树品种鉴定和亲缘关系分析，是 进一步科学、有效地利用果树资源的基础。借助ISSR分子 标记技术，可以在大范围内对果树的遗传物质进行较全面 的比较，从而对果树种质资源鉴定和亲缘关系分析。 吴兴恩等对富民枳、枳、枳橙和甜橙等22份柑桔资源 进行了ISSR分析,并对所得结果进行了讨论，发现采用 ISSR技术可作为品种鉴别、亲缘关系和分类的手段之一。
ISSR分子标记的基本原理和特点
• 基本原理
• 特点
基本原理
在真核生物基因组中均存在着由1～4个核苷酸组成的简单 重复序，如(A)n、(AG)n、(AGC)n、(AATT)n等。植物基因组
中最多的SSR 是(AT)n、(TA)n、( GA)n、(CT)n等二核苷酸重
复序列。ISSR技术的基本原理就是在用锚定的微卫星DNA为引 物，即在SSR序列的3ˊ端或5ˊ端加上2～4个随机核苷酸，在 PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引 物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。
问题与展望
• ISSR标记因其引物容易设计，实验重复性强，操作过程 简单，不须使用同位素，可以揭示更高程度的DNA多态性， 从而在果树遗传研究中具有广阔的应用前景，但任何一种 分子标记都不能解决所有问题，在今后的研究工作中，我 们应根据自己的研究目的，选择合适的分子标记，或将不 同标记结合起来进行综合研究。ISSR标记存在一些缺点, 限制了其在某些方面的应用。 • ISSR标记以其多态性高、可重复性强、简便快速等优势, 必将使其在果树种质鉴定、系统发育研究、育种材料早期 选择等方面发挥更大的作用。
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3′锚定引物的PCR产物
5′锚定引物 NNNN(CA)n
5′锚定引物的PCR产物 用重复序列(CA)n作单引物，在引物的5′端或3′锚定1至数个碱基。
ISSR的特点
优点： 实验操作简单、快速、高效，DNA用量少,引 物设计容易,实验成本低廉。 ISSR遗传多态性高，重复性好。 符合孟德尔遗传规律。 无需知道任何靶标序列的SSR背景信息。
ISSR分子标记技术在果树遗传学的应用
• 遗传多样性和居群遗传结构
• 种质资源鉴定与亲缘关系 • 遗传指纹图谱的构建
遗传多样性
• 彭瑜等利用ISSR分子标记方法对20个柚类 品种进行遗传多样性研究，揭示了柚类品 种间丰富的遗传多样性。 • 邹游等利用ISSR技术对采自四川省猕猴桃 科研基地的14个猕猴桃品种进行了遗传多 样性分析。ISSR标记说明猕猴桃品种间遗 传距离与地理分布有一定关系, 地理位置 较近的品种能聚在一起。
5′锚定引物 NNNN(CA)n
3′锚定引物 NN(CA)n
锚定ISSR-PCR示意图
CACACACACACACACA
GTGTGT GTGTGT GTGTGTGT GTGTGTGT
GTGTGT GTGTGTGTGT
CACACACACACACACACACACACACACA
3′锚定引物 NN(CA)n
遗传指纹图谱的构建
• 果树遗传指纹图谱研究技术是在现代仪器分 析技术基础上发展起来的, 进而对果树进行鉴定 和质量控制。研究方法也有多种, 分别从不同的 角度反映了果树的遗传信息。ISSR标记容易发现 多态性，敏感性高，通过ISSR分析可以找出与靶 基因连锁的ISSR标记。ISSR标记在杂交群体中呈 孟德尔式分离，ISSR遍布基因组，多态性高，因 此可用于遗传作图。
ISSR分子标记及其在果树遗传 学的应用
果树学 刘志发
主要内容
• ISSR分子标记 • ISSR分子标记的基本原理和特点
• ISSR分子标记实验操作
• ISSR分子标记在果树遗传学的应用 • 问题与展望
ISSR分子标记
ISSR分子标记是在SSR分子标记基础上发展起来的
来自百度文库
一种DNA多态性检测技术。即锚定简单重复序列
• Sankar等对用ISSR在柑橘作图中效果评价，认为 ISSR 标记符合孟德尔式分离，标记是显性标记，少 部分标记呈共显性分离， 可以同RFLP、RAPD、同工 酶的遗传图谱相互补充，构建新的遗传图谱，因此 ISSR适合柑橘的遗传图谱构建。 • 雷天刚等利用SSR标记和ISSR 标记对102个柑橘栽培 品种进行DNA指纹分析，筛选适合的特征引物，构建 柑橘栽培品种的指纹图谱数据库。
• SDS法
• CTAB法
引物设计
• 引物设计是ISSR技术中最关键、最重要的一步。 用于ISSR的引物常为5＇端或3＇端加锚的二核苷 酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列，重复次数一 般为4～8次，使引物的总长度达到20bp左右。5＇ 端或3＇端用于锚定的碱基数目一般为1～4个，锚 定的目的是引起特定位点退火，使引物与相匹配 SSR的一端结合，而不是中间，从而对基因组中特 定片段进行扩增、检测。
PCR扩增反应
反应体系 • 模板DNA • dNTP • 引物 • Taq DNA聚合酶 • PCR反应缓冲液
扩增步骤
• 变性（denaturation） • 退火（anealing） • 延伸(extension)
PCR产物的电泳与数据分析
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PCR产物需经电泳分离、染色显示后才能进行 条带观察、统计。
（anchored simple sequence repeat，ASSR），也称作 简单重复间序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)标 记技术或以微卫星为引物的PCR(microsatellite primed PCR,MP-PCR) 。 它是由加拿大蒙特里尔大学的Zietkiewicz等1994年提 出的 。
• 徐志祥等ISSR分子标记对南丰柑桔品种的遗传多样 性进行研究。从100个ISSR引物中筛选出17个多态引
物，对14份柑桔样品进行ISSR-PCR分析。UPGMA聚类
分析结果表明，以遗传相似系数为0.67为分界线， 可以将14份供试柑桔样品分成三类：第一类包含以 ss-28为代表的7个柑桔品种；第二类包含以杨小2,6 为代表的3个柑桔品种；第三类包括以早系97-1 为
目前可用于ISSR扩增产物分离的电泳有：浓度 为1.5%～2.0%琼脂糖凝胶电泳或浓度为6%聚丙 烯酰胺凝胶电泳，后者的分离效果通常更好。用 溴化乙锭(EB)或硝酸银染色后，在紫外光或可见 光下进行观察，统计带纹的有(计为1)或无(计为O) 及相对位置，然后即可根据研究目的，应用 UPGMA、SPSS等聚类分析软件进行分析。
缺点
PCR扩增反应的最适条件需要一定时间摸
索。 ISSR标记大多是显性标记，不能区分显 性纯合基因型和杂合基因型。
ISSR分子标记实验操作
• DNA样品的提取
• 引物设计
• PCR扩增反应
• PCR产物的电泳及数据分析
DNA样品的提取
提取植物DNA的方法有很多，用于ISSR分子标
记的DNA样品的提取方法有：