相差显微镜
实验二特殊显微镜的使用——相差显微镜
实验⼆特殊显微镜的使⽤——相差显微镜实验⼆特殊显微镜的使⽤实验2.1相差显微镜⼀、实验⽬的掌握相差显微镜的原理、构造及其使⽤⽅法。
⼆、实验原理相差显微镜（phase-contrast microscope ）是由P. Zernike 于1932年发明的，P. Zernike于1953年获诺贝尔物理奖。
相差显微镜最⼤的特点就是可以⽤于观察未经染⾊的标本和活细胞。
⼈们在光学显微镜下观察被检标本时，只有在反射光的波长（颜⾊）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，⽅能看到被检样品的结构。
活细胞近于⽆⾊透明，光波通过时，透过或反射光的波长和振幅都不发⽣改变，所以⽤普通光学显微镜难以辨清活体的结构。
⼀般对于明暗对⽐很⼩的样品，多借助于固定和染⾊等理化⽅法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发⽣变化，即在颜⾊和亮度上有所差异，才能识别。
但有些样品⼀经染⾊就会引起变形，染⾊也可使有⽣命的样品死亡。
我们可以利⽤相差显微镜来进⾏观察。
相差显微镜利⽤了光的⼲涉现象，将⼈眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此它是⼀种应⽤在染⾊困难或不能染⾊的新鲜标本上获得⾼对⽐图像的新型显微镜。
相差⽅法应⽤于⽣物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进⾏直接观察，⽆需采⽤使细胞致死的固定和染⾊的⽅法。
染⾊给活体以有害的影响，甚⾄失真。
由此，才使相差法显得异常重要。
相差是指同⼀光线经过折射率不同的介质其相位发⽣变化并产⽣的差异。
相位是指在某⼀时间上，光的波动所达到的位置。
相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差），介质越厚或折射率越⼤，光波减速也越⼤。
为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板（phase plate ）。
在圆形相扳平⾯上，有⼀圈与周围（⾥外）相扳厚度不同的或凸或凹的圆环。
相板分两部分：共轭⾯（conjugate area ）：通常为环状，是通过直射光的部分。
相差显微镜的原理及应用
相差显微镜的原理及应用1. 基本原理相差显微镜是一种常用的显微镜，利用光束经过不同厚度或不同折射率的样品时会发生相位差，通过调节相差环以及使用相差镜头来使这种相位差可见化的显微镜。
相差显微镜的基本原理包括：• 1.1 偏光• 1.2 可调节相差环• 1.3 分束镜• 1.4 相差镜片• 1.5 物镜2. 应用领域相差显微镜广泛用于生物学、医学、材料科学等领域，具有以下优势：• 2.1 细胞观察• 2.2 纳米颗粒分析• 2.3 病理学研究• 2.4 材料表征2.1 细胞观察相差显微镜在生物学领域中，常用于观察细胞结构、形态和运动等。
通过相差显微镜，可以更清晰地观察细胞内部的亚细胞结构，如细胞核、线粒体等，从而帮助科研人员研究细胞生理、病理以及疾病的发生机制。
2.2 纳米颗粒分析相差显微镜还可用于纳米颗粒的观察和分析。
由于纳米颗粒的尺寸非常小，普通光学显微镜很难观察到其细节。
而相差显微镜具有高分辨率和对比度强的特点，能够清晰地观察和测量纳米颗粒的形状、大小以及分布等特征，从而有助于纳米材料的研究和应用。
2.3 病理学研究在医学领域中，相差显微镜常用于病理学研究。
医生通过相差显微镜观察组织切片，可以更准确地判断细胞形态的变化，如细胞核的大小、核固缩、胞浆的变性等，从而帮助诊断疾病和制定治疗方案。
2.4 材料表征在材料科学中，相差显微镜可用于材料的表征和分析。
通过相差显微镜观察材料的表面形貌和内部结构，可以获取材料的微观形貌信息、相位对比度等数据，从而对材料的性能进行评估和研究。
3. 使用技巧在使用相差显微镜时，有一些技巧可以帮助获得更好的观察效果：• 3.1 合理调节相差环• 3.2 注意光源的均匀性和亮度• 3.3 注意样品准备和处理3.1 合理调节相差环相差环是相差显微镜中的一个重要部件，调节得当可以帮助产生清晰的相差图像。
在调节相差环时，应根据样品的性质和所需观察的结构特点，进行适当的调节，以获得最佳的解析度和对比度。
相差显微镜与普通光学显微镜的不同构造
相差显微镜与普通光学显微镜的不同构造光学显微镜是一种广泛应用于各个领域的显微镜。
相差显微镜是一种常见的变种，它比普通光学显微镜的分辨率更高。
虽然这两种显微镜都是用来观察小样品的，但它们的构造差异很大。
普通光学显微镜的构造普通光学显微镜是由三个主要部分组成：光源、物镜和眼镜。
光源是灯泡，通常使用白炽灯或荧光灯。
光源发出的光线通过凸面镜或反射镜进行反射，并穿过透镜集束成束。
透过样品后，光线将进入物镜 - 放在显微镜下方的透镜 - 并通过其到达眼镜。
眼镜将放大的图像反向，并将其放在观察者的眼睛前。
相差显微镜的构造相差显微镜基于光的物理性质，通过用不同的速度传递光的特殊样品来制造视差。
相差显微镜通常包含一个波分束器、一个锥形电介质和一个探测器。
波分束器是一种方式，将入射光束部分分离成不同的光线，每条光线具有不同的相位和振幅。
锥形电介质是一种特殊的样品，它会重定向和干涉光线。
探测器是用来检测光线中的差异，并将这些信息转换为图像。
相差显微镜与普通光学显微镜的不同之处普通光学显微镜通过聚焦透镜将光线聚焦在样品上，观察者通过眼镜放大图像。
相差显微镜则利用光线干涉和重定向的特性来改变样品入射光线的相位和振幅。
这种差异意味着相差显微镜具有更高的分辨率和更好的图像质量。
此外，相差显微镜需要使用特殊的锥形电介质和波分束器来改变光线的传播方向。
这些部件也使相差显微镜比普通光学显微镜更昂贵和复杂。
结论相差显微镜和普通光学显微镜在正确使用时都可以提供有用的信息。
虽然相差显微镜具有更高的分辨率和更好的图像质量，但其构造也更为复杂和昂贵。
选择哪种显微镜应该依据用户的需求和实验目的来确定。
暗视场和相差显微镜
暗视场显微镜
（一 ）实验原理 暗视野显微镜是以丁达尔效应为基础，通过特殊的聚光器，使照 射样品的直射光不能进入物镜，只有被照样品表面反射或衍射的 散射光进入物镜，因而在黑暗的视野中形成物体明亮的像。
图1 暗视野聚光器工作原理
结构特点
丁达尔效应：光通 过浑浊媒质时 ,浑 浊媒质所呈现的光 的强烈散射现象,通 常称为丁达尔效应
暗视场显微镜及相差 显微镜的使用
BRAND
PLANING
1
实验目的
2
掌握暗视场显微镜及相差显微镜的原理、构造及使用方
法。
实验内容
01
暗视场显微镜 1. 实验原理 2. 使用方法
2 结构特点 4 注意事项
02
相差显微镜 1. 实验原理 2. 使用方法
2 结构特点
03 观察动植物细胞的胞质运动和胞质环流
薄则亮环小。 如果染色必须浅，而且是淡染。
思考题
B
简述相差显微镜的使用方法及注意事项
A 试述相差显微镜的成像原理及结构特点
相位: 是指在某一时间上，光 的波动所能达到的位置 .
光程: 是指媒质的折射率和媒 质厚度的乘积。
干涉: 直射光和衍射光相遇会 发生迭加现象造成振幅的变化， 或明或暗。
相差: 是指相同波长的光线经 过折射率不同的介质，其相位 发生变化而产生的位差，相差 一般不为肉眼所分辨，而相位 的变化是由光程的差别造成的。
中分出来。 2. 用相差物镜(内含相板)代替普通物镜 相板结构 共轭面:环状，通过直射光 补偿面:非环状，通过衍射光 相板作用:将直射光和衍射光分别加以相位调整 及强度削弱 . 相板类型:明相差或负相差 ,暗相差或 正相差 . 3. 用中心望远镜合轴调中 4. 光源和滤色镜：强光低热和绿色滤色镜
相差显微镜的工作原理
相差显微镜以较强的可见光作光源,当光线到达标本面时,标本内部的小粒、小孔或其他结构均可产生衍射光 ,衍射光比直接入射的光线相位迟约l/4,而且发生偏转、发散。
相差显微镜通过环状光阑和相差板改变直射光和衍射光的相位差而产生亮反差或暗反差。
① 环状光阑位于光源与聚光器之间。
作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,聚焦到标本上,最后在物镜后面聚集形成一个光环;而标本面上发散的衍射光在到达物镜后焦面时不能聚焦成光环,而分散在光环之外,从而将直射光与衍射光在后焦面分开。
② 在相差显微镜后焦面装有一个相差板,相差板分为环状的共轭区和环两侧的并协区,直射光通过共轭区,衍射光通过并协区。
如果在并协区涂上延迟相位的物质,使衍射光的相位再延迟1/4l ,使直射光与衍射光的相位差达1/2 l ,当这些产生衍射的颗粒或其他结构成像时,合成波的振幅为二波振幅之差,因而合成波的振幅比背景直射光的振幅小,物象显得很黑而背景明亮,这种效果叫暗反差;
如果在共轭区涂上延迟相位的物质,直射光与被延迟1/4 l的衍射光同相位,从而发生相长干涉,合成波振幅比直射光振幅大,物象比背景亮 ,这种效果叫明反差。
相差显微镜原理
相差显微镜原理
相差显微镜是一种常用的生物学和医学领域的显微镜，它利用了光的相位差来
增强细胞和组织的对比度，从而使得细小的结构和细胞器可以更加清晰地观察到。
相差显微镜原理的理解对于正确使用和维护显微镜具有重要意义，下面我们将详细介绍相差显微镜的原理。
首先，相差显微镜利用了光的相位差来增强细胞和组织的对比度。
在普通的光
学显微镜中，我们观察到的图像是由光线的透射和反射产生的，而这些光线经过样本后，会产生相位差，导致图像的对比度不高。
而相差显微镜通过在光路中加入相差补偿装置，可以使得光线的相位差得到补偿，从而增强了图像的对比度，使得细小的结构和细胞器可以更加清晰地观察到。
其次，相差显微镜的原理基于光的波动性。
光是一种电磁波，它具有波动性，
因此在光通过样本后会产生干涉和衍射现象，这些现象会导致图像的对比度降低。
而相差显微镜利用了光的波动性，通过在光路中加入相差补偿装置，可以使得光线的波动得到补偿，从而增强了图像的对比度。
最后，相差显微镜原理的理解对于正确使用和维护显微镜具有重要意义。
只有
深刻理解了相差显微镜的原理，我们才能够正确地调节显微镜的参数，获得清晰的图像。
此外，正确使用和维护显微镜也可以延长显微镜的使用寿命，保证观察结果的准确性。
总之，相差显微镜原理的理解对于正确使用和维护显微镜具有重要意义。
相差
显微镜利用了光的相位差来增强细胞和组织的对比度，基于光的波动性，通过在光路中加入相差补偿装置，可以使得光线的波动得到补偿，从而增强了图像的对比度。
希望本文对您理解相差显微镜原理有所帮助。
相差显微镜的工作原理
相差显微镜的工作原理
相差显微镜是一种常用的光学显微镜，它利用了光波在不同介质中传播速度不同的原理，通过相差干涉效应增强了显微镜的分辨能力。
相差显微镜的工作原理可以简单地分为以下几个步骤：
1. 光源发出光线：相差显微镜通常使用准直光源，例如汞灯或钠灯等。
这些光线经过准直器产生平行光束。
2. 光线通过物镜：平行光束进入物镜系统，物镜是相差显微镜的关键部件之一。
物镜由多个透镜组成，并具有特殊的设计，以便产生相差。
3. 形成相差：进入物镜的光线会经过样品，样品会改变光线的相位和振幅。
不同的部分会对光线产生不同的相位差，形成相差。
4. 再现映像：经过样品后的光线进入目镜，目镜会将光线再次聚焦在目视者的眼睛上，形成放大的映像。
在此过程中，由于相差产生的相位差，样品的细小细节会呈现出明暗差别。
相差显微镜的分辨能力较高，可以观察到常规光学显微镜无法解析的细节。
然而，相差显微镜也有一些局限性，例如对不透明或厚样品的观察存在困难。
总的来说，相差显微镜利用相差干涉原理增强了显微镜的分辨能力，使得我们能够更清晰地观察微小样品的细节。
相差显微镜
什么是相差显微镜?活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。
而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。
相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。
相差显微镜具有两个其它显微镜所不具有的功能:①将直射的光(视野中背景光)与经物体衍射的光分开;②将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。
相差显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。
相差显微镜的基本原理是，利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅（光强度）的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。
主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。
把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。
光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。
在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：1.环形光阑（annular diaphragm）位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。
2.相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
分为两种：1.A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。
2.B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。
相差显微镜的原理
相差显微镜的原理、结构和应用曾晓飞相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。
活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。
而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。
相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜1相差显微镜的基本原理当一束平行光通过被检测标本,遇到一种物点时,由于各物点对光的吸收程度不同,在显微镜视场中可见到灰度(即明暗度)不同的各物点图像,这是由于光的振幅不同所致。
如果标本中的物体近乎透明,视场中就看不出明显的灰度差别。
但由于各种物点对光波产生了衍射和折射,使得通过的光波因延迟而发生了偏离,其光程就有了一定的差别,即产生了所谓“位相差”。
人眼不能分辨这种位相差,但可以设法将这种位相差转换成振幅差。
相差显微镜就是利用光的干涉原理,将位相差转换成振幅差(即明暗差)的显微镜装置.2相差显微镜的基本构成1）与聚光镜装在一起的可转换的环状光栏它是一套在黑色的玻璃片中,有一个无色透光圈的装置,分别适配低、中、高倍接物镜和油镜。
由光源进入的光,只能通过透光环进入光路中。
2）带位相板的物镜是在物镜透镜聚焦平面上加了一圈灰黑色涂层“板”的接物镜(肉眼可以看到黑色的圈)。
3)调焦(对光)目镜原理类似一种望远镜,用于在显微镜中对上述两种装置的焦点调节,其长度可以通过手工改变。
4)一种绿(或青)色的滤光片。
以上4部分均由厂家配套供应,通常在使用前临时装于与之匹配的显微镜上,见图2。
目前,国内外销售的高档显微镜,一般都备有相差装置。
3相差显微镜的使用1）安装相差装置将普通显微镜的聚光镜卸下,将带环状光栏的聚光镜装到相匹配的显微镜上;将显微镜的普通物镜卸下,换上带位相板的物镜;将目镜换成相差显微镜专用的调焦目镜;在光源进光处放置专用的绿色滤光片(有时可以不用)。
细胞生物学实验相差显微镜及超活染色
线相位推迟1/4波长。 两种膜有不同的镀法，从而制造出不同类型的相差物镜。
负相差物镜（Negative contrast）
吸收膜和相位膜都镀在共轭面上，通过共 轭面的直射光不但振幅减弱，而且相位也 被推迟1/4λ，衍射光因通过物体时相位也被 推迟1/4λ，这样就使得直射光与衍射光维持 在同一个相位上。两波相加、增强。通过 被检物体的合成光就比背景明亮。
两类活体染色
通常把活体染色分为体内活体染色与体外 活体染色两类。
体外活体染色又称超活染色，它是由活的 动、植物分离出部分细胞或组织小块，以 染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞 的某种结构上而显色。
实验目的
观察动物活细胞内线粒体、液泡系的形态、 数量与分布；
学习一些细胞器的超活染色技术。
试剂
3. 1%詹纳斯绿B贮存液 ：称取50mg詹纳斯 绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热 (30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即 为1%原液。
1/5000詹纳斯绿B工作液：取1%原液l ml加 入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液。装 入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的 充分状光阑像与相板共轭面吻合。
绿色滤光片
用于调整光源的波长使成波长范围比较窄 单色光。Olympus厂家生产的相差显微镜在 镜检时要使用该厂规定的IF550绿色滤光片 作为配套器件。
使用范围
相差显微镜能观察到透明样品的细节，适 用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、 增殖情况及细微结构的观察。
（液泡系：在动物细胞内，凡是由膜所包 围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡 系。）
健那绿（Tanus green）：用于染线粒体。线 粒体内细胞色素氧化酶使染料保持氧化状 态而呈蓝绿色。
相差显微镜名词解释
相差显微镜名词解释
相差显微镜(双目显微镜)是一种具有两个显微镜镜体并分别具有不同放大倍数的显微镜。
这种显微镜通常用于观察细胞、组织、晶体和其他微观结构。
双目显微镜有两个显微镜镜体,分别称为主镜和副镜。
主镜和副镜的放大倍数不同,并且它们的位置也有所不同。
这种显微镜的构造使得可以通过调整主镜和副镜之间的距离来改变放大倍数,从而可以更精确地观察微小的物体。
相差显微镜通过使用一种特殊的光学原理来放大图像。
这种原理称为干涉。
在相差显微镜中,主镜和副镜通过不同路径到达微小物体表面,并且它们与微小物体表面的反射光线发生干涉。
这种干涉使得光线变得更加聚焦,从而使物体的放大变得更加准确。
相差显微镜还可以用于研究物质的结构和组成。
通过对不同放大倍数的图像进行组合,相差显微镜可以揭示物体的结构和组成,帮助人们更好地理解物质的功能和性质。
此外,相差显微镜还可以应用于医学和生物学研究,帮助人们更好地了解细胞、组织和疾病的微观结构。
相差显微镜是一种高精度、高放大倍数的显微镜,可以用于观察微小的物体和结构,对科学研究和医学发展具有重要的作用。
相差显微镜安全操作及保养规程
相差显微镜安全操作及保养规程1. 前言相差显微镜（又称差示显微镜或增强相差显微镜）是一种透射式显微镜，在科研、教学和医学领域有着广泛的应用。
但是，使用相差显微镜需要注意安全操作和保养，以确保实验过程平稳安全、仪器长期使用。
因此，本文旨在介绍相差显微镜的安全操作和保养规程。
2. 使用前的检查在使用相差显微镜进行观察前，需要对设备进行检查，避免出现问题，影响使用效果。
具体检查事项如下：•检查电源线是否损坏或老化。
•检查是否已将显微镜插好电源并接地。
•检查各部位是否松动。
•检查光学仪器是否干净，无杂质，并检查目镜和镜头有无损坏。
3. 安全操作指南3.1. 试样处理在观察样品前，需要对样品进行处理，保证样品垂直于光轴、固定在样品台上并干净无尘。
有机溶剂和高温或强酸强碱等有害物质需保持适当的距离。
3.2. 目镜调整目镜调整是使用相差显微镜前必要的步骤。
具体操作如下：•调整目镜和配套物镜为相同的倍数。
•观察焦距象移是否正常。
•通过调节光阑和中心轴上的白色刻度来调整图像的清晰度。
3.3. 光学调节光学调节是观察样品时必要的操作步骤。
具体操作如下：•点亮光源，调整光亮度。
•将光阑收缩到适当大小。
•调节相差调节旋钮直到清楚观察到了样品，而不是其它的干扰因素。
3.4. 观察样品观察样品时需要遵守以下操作规程：•避免直接插动试样，以免影响其位置和光路。
•不要用手直接触碰样品。
•观察样品时不要移动试管、瓶子等容器。
3.5. 结束操作使用相差显微镜后需要进行如下操作：•关闭光源电源。
•调回目镜，收起试样，放回原处。
•清理样品台，保持干净整洁。
•关闭显微镜电源及主断路器。
•接好防静电线，合好仪器柜门。
4. 设备保养为确保相差显微镜的正常使用寿命，需要注意保养规程。
具体保养措施如下：•每天使用前，定期检查仪器是否正常，避免因设备损坏导致结果不准确、设备无法使用等问题。
•每天结束试验后进行设备清洁，特别是镜面纸巾每次使用后必须更换。
相差显微镜的工作原理(一)
相差显微镜的工作原理(一)相差显微镜的工作原理简介•相差显微镜是一种常用的光学显微镜，广泛应用于生物学、材料科学等领域。
它能够通过观察物体在相差板下的相位差来增强样本的细节和对比度。
什么是相位差•光通过不同介质传播时，由于介质的折射率不同会导致光程差，进而产生相位差。
相位差表示了光波相位相对于参考光波的延迟或超前。
相差板的作用•相差显微镜中的相差板可以引入相位差，改变光波的相位，进而使样本的细节得以突出。
常用的相差板包括相位环和直径介于~10微米的透明薄膜。
相差显微镜的工作原理1.物镜与相差板–在相差显微镜中，相差板被放置在物镜的镜片上。
–物镜是显微镜中的一个主要组件，用于放大和聚焦光线。
它包含多个透镜，使得光线能够通过样本并聚焦在观察者的眼睛或相机上。
–相差板通过引入相位差，改变光线的相位，从而在样本中产生干涉现象。
2.相差光的形成–通过具有透明薄膜的相差板引入的相位差会导致不同的光路长，进而使得来自样本的光线相位不同。
–光线在通过相差板前后的相位差差异会导致光线的干涉现象。
–干涉的结果是明暗交替的干涉条纹，这些条纹会突出样本中的细节和对比度。
3.检测和观察–通过目镜或相机等装置，观察者可以看到通过相差板在样本上形成的干涉条纹。
–这些条纹能够将样本的微小细节和微弱差异放大，使其能够被肉眼或相机有效观察到。
结论•相差显微镜通过相差板引入相位差，利用干涉现象来增强样本细节和对比度。
•它的工作原理基于光线的相位差差异和干涉现象。
•相差显微镜已成为科学研究和生物医学等领域中不可或缺的工具，为人们揭示微观世界提供了重要帮助。
相差显微镜的优势和应用•相差显微镜相比传统的亮场显微镜具有以下优势:1.增强对比度–相差显微镜能够通过引入相位差来增强样品的对比度，使得细微结构和细节更加清晰可见。
2.傍轴光学设计–相差显微镜使用了傍轴光学设计，使得光线在通过样品时不会出现球差和像差等影响成像质量的问题。
3.不需要特殊染色–与荧光显微镜不同，相差显微镜可以直接观察未染色的样品，不需要特殊的染色步骤，减少了实验的复杂性。
相差显微镜
组合环状光栏
不同数值孔径的物镜与不 同直径的环状光栏相适配。 空白圆孔:当显微镜另有 他用时，可以避开环状光栏 空挡。 聚光镜附在圆盘上方。
位相板
是一片玻璃上喷涂环形吸光物质 的平板。 环形相板与环状光栏成为共轭面。 位相板上除环形吸光物质以外的 所有板面称为补偿面（共协面）。 功能：吸收部分光线，延长部分 光线的光程，推迟部分光线的位相， 使之产生位相差。
阿贝成像原理
共轭：如果P和P’之一为物， 而另一点为其相应的象，则物 点和象点的这种关系称为共轭。 如右图中的O－O’和L－L’ L’烛光是L烛光的象
如果在聚光镜的前焦面上 放置孔径光栏，那么“光源－ 光源象”代之以“孔径光栏平 面－物镜后焦面的L”平面”。 L”是L’的象
在聚光镜和物镜之间插入一张 栅状物体，也即是光栅，则初级 成像光路被破坏。L烛光在它的 像平面上出现了数支烛光，而在 像平面上出现了光栅的干涉像。 这些干涉纹是由次波源0，－1， ＋1发射的衍射光的重叠所造成 的。此时，O和O’是共轭面，也 就是象平面是光栅O的象。
措施：阿贝在聚光镜前焦面上放置孔径 光栏时，这个平面就成为物镜后焦 面的共轭面；F.Zernike在这个平面 上放置了环状光栏，有空间滤波的 作用。 F.Zernike又在物镜后焦面上 放置了位相板，恰巧位相板的吸收 环变成环状光栏的成像平面。 目的：改变衍射光和直射光的位相和振 幅，加强物体细节的反衬度。
反衬度源自I1 I 2 物象与介质的反衬度r： r I1
I1 为物体的亮度， I 2为介质的
亮度， I 2 等于零时，物体的反 衬度应为1。 曲线1和2之间的Q角越小， 物象越接近于理想物象。其边 缘清晰，反衬度大。
相差显微镜特点及应用
相差显微镜特点及应用相差显微镜是一种通过利用光的相位差来增强显微镜分辨能力的显微镜种类。
它由光源、物镜、特制的光学装置和目镜等组成。
相差显微镜的主要特点是能够产生高分辨率、高对比度的影像。
相差显微镜的原理是利用了物镜与目镜之间采用特制的相差装置，使得光线在透过不同的物质时，经历不同的相位差。
在物镜和目镜之间形成一个干涉图样，这样可以增强细胞和微生物等的对比度，使其清晰可见。
相差显微镜具有以下几个主要特点：1. 高分辨能力：相差显微镜能够产生高分辨率的图像，可以观察到更加细微的结构特征。
相较于普通光学显微镜，相差显微镜能够辨别更小尺寸的细胞和微生物。
2. 高对比度：相差显微镜通过利用光的相位差来增强对比度，使得样本中的细节更清晰可见。
对于透明物质和无色物质，相差显微镜比普通显微镜更有优势。
3. 无需染色：相差显微镜不需要对样本进行染色处理，可以直接观察样本的原始结构，避免了染色过程对样本产生的影响。
4. 显示立体图像：相差显微镜可以观察到样本的立体图像，使得样本中的三维结构更加清晰可见。
这对于观察生物组织和器官等的结构十分重要。
相差显微镜在生物学、医学、材料科学等领域有广泛的应用。
下面将分别介绍其在这些领域中的应用。
1. 生物学应用：相差显微镜在生物学研究中被广泛使用，可以观察到生物细胞的结构和功能。
例如，在细胞学研究中，相差显微镜可以观察到细胞核、细胞质和细胞器等组成部分的结构，更好地了解细胞的功能和进程。
此外，相差显微镜还可以用于观察细胞的运动、分裂和凋亡等过程。
2. 医学应用：相差显微镜在医学研究和临床诊断中也有重要的应用。
例如，在病理学领域，相差显微镜可以观察到组织样本和细胞样本，帮助医生诊断疾病。
此外，在药物研发过程中，相差显微镜可以观察到药物对细胞的影响，评估药物的疗效和安全性。
3. 材料科学应用：相差显微镜在材料科学研究中也有广泛的应用。
例如，在纳米材料研究中，相差显微镜可以观察到纳米粒子和纳米结构的形貌和分布情况。
相差显微镜
相差显微镜（一）相差显微镜的特点相差显微镜是一种将光线通过透亮标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。
光线通过比较透亮的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。
因此，用一般光学显微镜观看未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以辨别。
然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。
随着光程的增加或削减，加快或落后的光波的相位会发生转变（产生相位差）。
光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特别装置环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透亮的物体表现出明显的明暗差异，对比度增加，使我们能比较清晰的观看到一般光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些微小结构。
（二）相差显微镜的成像原理镜检时间源只能通过环状光阑的透亮环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。
由于透亮圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。
因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。
由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生肯定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。
这样在相差显微镜镜检时，通过无色透亮体的光线使人眼不行辨别的相位差转化为人眼可以辨别的振幅差（明暗差）。
（三）相差显微镜的结构和装置相差显微镜与一般光学显微镜的基本结构是相同的，所不同的是它具有四部分特别结构：即环状光阑、相板、合轴调整望远镜及绿色滤光片。
1、环状光阑具有环形开孔的光阑。
位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。
相差显微镜
实验二相差显微镜（一）相差显微镜的特点相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。
光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。
因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。
然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。
随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。
光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。
（二）相差显微镜的成像原理镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。
由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。
因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。
由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。
这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。
（三）相差显微镜的结构和装置相差显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的，所不同的是它具有四部分特殊结构：即环状光阑、相板、合轴调节望远镜及绿色滤光片。
1、环状光阑具有环形开孔的光阑。
位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。
相差显微镜
暗相差
• 在被检物的折射率大于介质的情况下，透过共轭 面的直射光被吸收80%后亮度变暗，衍射光在通过 被检物后其相位己推迟1/4波长，再在位相板的补 偿面的电解质又推迟了1/4波长。由于这两束光的 相位不同（差1/2波长），其合成波的振幅为两者 之差，所以光线就更加暗。 • 与此同时，通过无结构介质的衍射光的光程只被 补偿面的电介质推迟l／4波长。这就造成通过光 密物质的光强远比通过无结构介质(背景)的光强 减衰得多。相差显微镜下标本细节的反差加大丁。 光密结构比背景暗得多了。这种反差叫暗反差也 叫正反差。
明相差
• 如果相板的共轭面上涂的是减速物质，推 迟直射光1/4波长，而补偿面涂的是吸光物 质，结果就是直射光与衍射光的相位相同 （衍射光通过物体时相位推迟了1/4波长）， 其合成波的振幅为两者之和，结果物体是 明亮的而背景是暗的，这称为明相差或负 相差。
暗相差和明相差
暗相差和明相差
相差显微镜实验方法和步骤
相差显微镜的成像原理
• 从波动光学的角度可把物体细节即生物标 本的细节，看成是成像光束的障碍物。它 可以改变相干光束的振幅、位相和光强分 布。 • 从变换光学的频谱转换角度，可把物体细 节看成是不同空间信息的集合物。它可改 变光信息的空间频谱。
相差显微镜的成像原理
• 在显微镜下标本细节的光密物质、光疏物质和无 结构的介质的折射率不同，因此相干光束通过光 密物质(t)时，必然产生衍射，使光程延长，推迟 位相(图10—21P)。这时衍射光(P)和直射光(S)之 间的位相出现d/λ差异。但是标本的吸收程度近 似，所以振幅未变即光强末变。这种直射光和衍 射光到达像平面重叠成像时，其合成波的振幅与 通过无结构介质的直射光的振幅几乎近似，即其 光强相似。这就是未染标本在普通显微镜下反差 很小的基本原因(图10—22)。
相差显微镜实验步骤
相差显微镜实验步骤相差显微镜是一种常用的光学显微镜，它能够提供高分辨率的显微观察。
下面将介绍相差显微镜的实验步骤。
1. 准备样品在进行相差显微镜实验前，首先需要准备好待观察的样品。
样品可以是生物组织、细胞、昆虫标本等。
样品应该被固定在载玻片上，并且可以使用染色剂对样品进行染色，以增强对细节的观察。
2. 调整显微镜将载玻片放置在显微镜的样品台上，并使用显微镜的机械调节装置将样品移动到显微镜的视野中。
调整显微镜的焦距，使样品清晰可见。
可以使用显微镜的聚焦轮进行细微调节，直到达到最佳观察效果。
3. 设置相差装置相差显微镜通过相差装置来增强样品的对比度。
相差装置由一个圆形光阑和一个位于光学路径中的偏光片组成。
首先，旋转偏光片，使其与样品台上的光阑重叠。
然后，通过调整光阑的大小和形状，使得光通过样品时产生相位差。
4. 观察样品通过相差装置增强对比度后，可以开始观察样品。
可以使用显微镜的目镜和物镜来放大样品，并且可以使用显微镜的放大倍数调节装置来调整放大倍数。
观察时要注意调整光源的亮度和样品的对比度，以获得清晰的图像。
5. 记录观察结果在观察样品时，可以使用相机或者手机将观察结果拍摄下来。
这样可以方便后续的分析和记录。
同时，可以使用显微镜上的刻度尺来测量样品的大小和距离。
6. 清理和保养实验结束后，应该及时清理显微镜和样品。
首先，关闭显微镜的电源和光源，然后用干净的软布擦拭显微镜的镜片和机械部件。
同时，将样品从载玻片上取下，用适当的方法进行处理。
总结：相差显微镜通过相差装置来增强样品的对比度，使得观察者可以更清晰地观察样品细节。
在进行实验时，需要准备好样品并调整显微镜的焦距。
然后设置相差装置，观察样品时要注意调整光源的亮度和样品的对比度。
最后，可以记录观察结果，并进行清理和保养工作。
相差显微镜的实验步骤简单明了，可以用于生物学、医学等领域的研究和教学。
实验3 相差显微镜的使用
实验3 相差显微镜的使用相差显微镜的原理：在人的视觉中，波长的变化表现为颜色的不同，振幅变化变现为明暗不同，而相位的变化肉眼感觉不到的，即人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），不能区分相位。
当光线通过无色通明的生物标本时，波长和振幅变化不大，只有相位发生了变化，因此在明场观察时很难观察到标本（图？）。
当照明光线通过活细胞时，虽然波长及振幅没有明显的变化，但由于细胞的各部分及细胞与周围介质之间折射率有所差别，光线通过各种界面时，一部分直接通过细胞称为直射光，另一部分变为衍射光，衍射光与直射光的波长一致，但衍射光的相位比直射光大约推迟约1/4个波长(λ)。
从标本某一点发出的直射光和衍射光经物镜会聚以后，在物镜的像场交于一点，衍射光与直射光就会发生干涉，而形成合成光波。
合成光的波长仍和原来相同。
但振幅为两束光的几何叠加。
相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，在光学系统中增加了特殊装置：在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜后焦面上加了一个相板，可利用被检物体的光程之差进行镜检，有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此，可以观察无色透明的物质，大大便利了活体细胞的观察。
改变相位由相板完成。
如果推迟直射光的相位1/4λ，则直射光和衍射光的相位相同，发生相长干涉，合成光将比直射光明亮，成为负反差。
如果推迟衍射光的相位1/4λ，则直射光比衍射光超前1/2λ，这时发生相消干涉，合成光比直射光暗，成为正反差。
图相差显微镜原理示意图（安利国，2004）相差显微镜的装置：相差显微镜有一些特殊的装置而有别于明视野显微镜。
相差聚光镜：位于镜台之下，由聚光镜和环状光阑（Ring slit）构成。
环状光阑装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为相衬聚光镜。
环状光阑使直射光成筒状射向标本面，然后在物镜后焦面聚焦形成一个光环；在标本面上发散的衍射光在到达物镜后焦面时不能聚焦成光环而是分散在光环之外，这样使直射光和衍射光在后焦面被分开。
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提高分辨能力方法：使用低波长光源，增大介质n值，增大孔 径角，提高对比度。 Leiting Pan, Nankai University
二.显微镜相关参数
2.2显微镜放大率 显微镜总的放大率是物镜放大率和目镜放大率的乘积。 显微镜放大是指被观察物的一维尺度放大。 当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显 微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放 大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图 像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而 放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图 像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥 显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率 合理匹配。
Introduction to Optical Microscopy
The Speaker: Leiting Pan The Tutor: Jingjun Xu
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内容
一.背景简介 二.显微镜相关参数 三.显微镜一些成像原理 四.荧光显微镜
五.激光扫描共聚焦显微镜（LSCM)
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一.背景简介
1.1显微镜发展史
1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。 1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时， 改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构。 1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜。 19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能 力大为提高。 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰 物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝 尔物理学奖。 19世纪20年代，恩斯特· 鲁斯卡用电子代替光制作了一个显微镜，能 够把实物放大17倍，他获得了1986年诺贝尔奖的物理奖，现在可得 到百万倍的放大，
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二.显微镜相关参数
2.6显微镜物镜 1.消色差物镜（Achromatic objective）：校正了轴 上红，蓝二色点的位置色差、黄绿光球差。 2.复消色差物镜（Apochromatic objective）：校正 红、绿、蓝三色光的色差，校正红、蓝两色光的球差。 3.半复消色差物镜（Semi apochromatic objective） 校正红、蓝两色光的球差和色差。 4.平视场物镜（Plan objective ）：视场平坦，校正 场曲的缺陷，提高视场边缘成像质量的目的。 5. 单色物镜：紫外物镜 6. 特种物镜：相衬物镜，长工作距离物镜。
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一.背景简介
1.2显微镜类别 光学显微镜
倒（正置）置显微镜 体视显微镜 金相显微镜 偏光显微镜 相差显微镜 干涉显微镜 微分干涉对比显微镜（DIC) 倒置（正置）荧光显微镜 数码显微镜 Leiting Pan, Nankai University
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二.显微镜相关参数
2.5 显微镜参数工作距离/覆盖差
工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的 距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。 因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是 调节工作距离。 显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标 准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从 而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的 成响质量。 数值孔径越大的物镜，工具距离越短，对盖玻片厚度有一定的 要求。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围 在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算 在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的 厚度。
Fig.4 显微镜 光路示意图
A'' B '' AB
L1
A' B '
L2
观察者
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二.显微镜相关参数
2.1显微镜分辨能力
Fig.5 改变数值孔 径示意图
R
0.61 0.61 NA n sin 2
普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值 0.2μm左右，人眼的在明视距离分辨力是0.2mm，所以一般显 微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。
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二.显微镜相关参数
2.4 显微镜参数视场数/视场直径 观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场 。 视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视 场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈 便于观察。 F=FN/β ，F-视场直径，FN-视场数（Field Number）， β-物镜放大率。 蔡司视场数是23mm ，用100X的物镜，其视场数是 23mm/100＝0.23mm，就是说把一个0.23mm的线段放 在显微镜下观察，线段两端正好在视野边缘。
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二.显微镜相关参数
2.3显微镜焦深 焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准 某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看 清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得 清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。 焦深与物镜的数值孔径及分辨率成反比，物镜低倍 到高倍切换再调焦，反之则不用。
电子显微镜
扫描隧道显微镜（STM） 扫描电子显微镜（SEM） （反射） 透射电子显微镜（TEM） 发射式电子显微镜
一.背景简介
1.2显微镜类别
Fig.1 正置显微镜
Fig.2 倒置显微镜
Fig.3 体视显微镜
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二.显微镜相关参数
2.1 显微镜光学原理
原理：主要由物镜和目镜组成，物镜的焦距很短，目镜焦距长，物镜作用是得 到物体放大的实象，目镜是将物镜所成实象作为物体得到放大的虚象。
' A' B位于 物体 AB到物镜L1距离稍大于物镜焦距F1, 通过物镜得到放大的实象 A' B '， 目镜的焦距F2以内，是目镜的物体，通过目镜得到放大虚象 A'' B ''。