南昌大学分子生物学实验课件
分子生物学导论--分子生物学实验技术 ppt课件
本次内容
一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化
精品资料
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• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
10×Buffer
2.0µl
Mg2+（25mM） 1.2µl
Taq酶（5U/µl） 0.1µl
dNTP（25mM） 0.2µl
加水至20µl，混合后，进行 PCR扩增 。
PCR反应程序：
Step1 95℃ 2分钟 Step2 95℃ 30秒 Step3 56℃ 30秒
（SSR引物退火温度在52-65 ℃ 不等。 ） Step4 72℃ 60秒 Step5 GOTO Step2 31循环
对BC3F3（113株）田间成株期鉴定为： R : S = 78 : 35
2.抗条锈病基因Yr5的SSR标记的建立
6个抗病株DNA和6个感病株DNA以2BL上的17对SSR 引物进行PCR扩增和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳多 态性引物Xgwm501对BC3F2（44株）和BC3F3（113株） 进行分析 Xgwm501—195bp、160bp 11.9cM Yr5基因
2、基因重组和连锁理论 连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换 与重组。
基因的连锁是位于同一染色体上的基因在遗 传过程中一般倾向于维系在一起。
基因的重组是通过一对同源染色体的两个非 姊妹染色单体之间的交换来实现的。
Sh C P1
Sh C
Sh C
94％
细胞
无交
sh c
换
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质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
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核酸和蛋白质的基本性质 及实验操作注意事项
蛋白质
一、核酸的基本性质
核酸：是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。核酸可 以分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核 酸（ribonucleic acid，RNA）两大类。
• 核酸（DNA和RNA）是线性多聚核苷酸， 基本结构单元是核苷酸
二、决定双螺旋结构状态的因素
1．氢键： 在每一个碱基上都有适于形成氢键的供氢体如氨基和羟基以及受氢
体如酮基和亚氨基。 （Tm为溶解温度）
Ｔm＝69.3十0.41(％G十C) （Marmur-Doty关系式 ）
形成氢键的特点：特异性很强 高度的方向性
2．碱基堆集力 同一条链中的相邻碱基之间的非
特异性作用力，即疏水作用力和 Van der Waal力。
(1)加入能减弱疏水作用的试剂可以 消除碱基堆集作用。
(2)DNA样品加热时，碱基堆集作 用减少，同时伴随A260的增加。
(3)能够断裂氢键的试剂对于单链 DNA的碱基堆集作用没有影响．但 是将双链DNA碱基堆集作用减少到 变性DNA的程度。
3．带负电荷的磷酸基的静电斥力
正离子(如Na+) 可以中和带负电荷的磷酸基团，有效地 屏蔽了磷酸基之间的静电斥力，促进了双螺旋结构的稳 定。
一、右手双螺旋结构模型的要点：
（1）主链脱氧核糖和磷酸基通过3'，5'磷酸二酯键交互 连接，成为螺旋链的骨架。
（2）碱基对由于双螺旋结构要求有一个正常的螺旋形式， 就必须是嘌呤和嘧啶相配。 （A-T，G-C）
（3）螺距 双螺旋链中的 任意-条链绕轴一周所升 降的距离的叫做螺距。
（4）大沟和小沟 沿螺旋铀 方向观察，两条主链和碱基 并不充满双螺旋的空间，双 螺旋的表面形成两条凹槽， 一条宽而深，叫做大沟，一 条狭而浅，叫做小沟。
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实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取一、实验目的学习细菌培养的培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂1、实验材料大肠杆菌（E. ） 5α菌株：，，2、实验设备恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅3、试剂酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素三、实验步骤液体（）培养基配方：蛋白胨() 1.0% （1 100 ）酵母提取物( ) 0.5% （0.5100 ）氯化钠 1.0% （1 100 ）7.0固体培养基：每100 液体培养基中加入1.5g琼脂粉请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！(1)每组按上述液体培养基配方，以配制100的量称取药品放入烧杯。
(2)用量筒量取约80 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100量筒定容至100。
(3)试纸检测值，并用1 N 或1 N 调节值至7.0。
(4)将100溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50。
(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50固体培养基。
(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。
并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。
当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 ，然后断开电源。
待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。
(8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。
(9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。
每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“”及各组的标记。
(10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1 50的氨苄青霉素（）溶液，使培养基中的终浓度为50。
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1. 将1 g叶片用液氮速冻后，迅速研磨成白色粉末，置入1.5 ml 离心管中； 2. 加入600 ul 预热的cTAB提取液65℃水浴提取1 hr，其中每10 min颠倒混
匀1次； 3. 取出离心管，冰浴冷却5 min 后，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），轻
1、根据带的深浅（明暗），估计含量
2、根据杂带的多少，判断纯度
3、根据和对比带（marker）比较, 大概知道片段的大小
Polyacrylamide (聚丙稀酰 胺):
has high resolving capability, and can resolve DNA/RNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide.
4. 因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)NA也可用于Northern blot试 验。
提取植物RNA时，要注意的问题：
1）一般用机械研磨的方法破碎植物 组织细胞；
2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白 与RNA分离并释放出RNA；
2.2 植物总RNA的提取与电泳
由于RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，如 mRNA,它携带了DNA的全部编码信息。 RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生 物学中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern验。
Agarose (琼脂糖):
(1) a much less resolving
4 kb 3 kb
power than
2 kb
polyacrylamide,
1 kb
(2) but can separate DNA
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1
实验流程一
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2
实验安排
准备材料：重组工程菌目标蛋白的表达 第1次 菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装 离子交换柱 第2次 测酶活、定蛋白、 离子交换层析 第3次 亲和柱层析，并对收集样 品进行测活、定蛋白等 第4次 对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析 第5次 Western blotting， 绘出分离纯化表 ppt 绘制包涵体复性曲线 课件
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B瓶 1N NaCl 100ml
A瓶 0N NaCl 100ml
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操作要点
1)在梯度洗脱仪中的洗脱瓶A（混合器）和洗脱瓶B（贮存器）
内各装入100毫升缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ（注意加溶液的方法），
注意液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内的气泡 2) 开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以 混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜 3) 将洗脱瓶A、洗脱瓶B与层析柱上端连接管道打开，同时将
O
对硝基苯酚磷酸酯 p-NPP
O O
-
-
Na+ Na+
碱性磷酸酶
O
- P
OH 对硝基苯酚
p-NP
NO2
NO2
以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对 硝基酚量测定酶活力。在37℃、pH10.0条件下，每分钟转 化产生1μ mol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位
ppt课件 6
每10秒记一个数（0、10、20、……120） 将时间及其对应的A405导入EXCEL文档中， 做时间t—A405曲线，得到斜率，
ppt课件 20
层析操作一般过程
装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、合并样品 上样前后样品活性测定---当天测定 上样前后蛋白浓度测定---最后一天测定
分子生物学(共19张PPT)
04
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成与结构
氨基酸通过肽键连 接形成多肽链，即 蛋白质的一级结构 。
多条多肽链组合在 一起，形成蛋白质 的三级结构。
蛋白质的基本组成 单位是氨基酸，共 有20种常见氨基酸 。
多肽链经过盘绕、 折叠形成二级结构 ，主要形式包括α螺旋和β-折叠等。
在特定条件下，蛋 白质可形成四级结 构，由多个亚基组 成。
发展历程
从20世纪50年代DNA双螺旋结构 的发现开始，分子生物学经历了 飞速的发展，成为现代生命科学 中最为活跃和前沿的领域之一。
分子生物学的研究对象与任务
研究对象
主要包括DNA、RNA、蛋白质Байду номын сангаас生 物大分子，以及它们之间的相互作用 和调控机制。
研究任务
揭示生物大分子的结构、功能及其相 互作用机制；阐明基因表达调控的分 子机制；探索生物大分子在生命过程 中的作用和意义。
转录因子
01
真核生物中存在大量转录因子，它们与DNA特定序列结合，激
活或抑制基因转录。
表观遗传学调控
02
通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式，改变染色质结构，影响
基因表达。
microRNA调控
03
microRNA是一类小分子RNA，通过与mRNA结合，抑制其翻
译或促进其降解，从而调节基因表达。
基因表达调控的分子机制
发育生物学研究生物体的发育过程，而分子 生物学则揭示了发育过程中基因表达和调控 的分子机制。
02
DNA的结构与功能
DNA的分子组成与结构
DNA的基本组成单位
脱氧核糖核苷酸，由磷酸、脱氧核糖 和碱基组成。
DNA的碱基
DNA的双螺旋结构
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寻找和验证肿瘤特异性标志物，用于肿瘤的早期诊断、预后评估和 个性化治疗。
肿瘤免疫治疗
利用分子生物学技术，研究和开发肿瘤免疫治疗策略，如CAR-T细胞 疗法等。
免疫学中的分子生物学应用
免疫相关基因
研究免疫相关基因的突变、表达和调控，揭示免疫应答和免疫疾 病的分子机制。
疫苗研发
利用分子生物学技术，研究和开发新型疫苗，如mRNA疫苗、 DNA疫苗等。
03
DNA修复机制
当DNA受到损伤时，细胞会启动修复机制对损伤进行修复。常见的修
复方式包括直接修复、切除修复和重组修复等。这些修复机制能够确保
遗传信息的稳定性和准确性。
03
RNA的结构与功能
RNA的分子组成
核糖核苷酸
RNA的基本组成单位是核 糖核苷酸，由磷酸、核糖 和碱基组成。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌 呤（A）、鸟嘌呤（G）、 胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U ）。
基因诊断与治疗
基因诊断
通过检测特定基因或基因突变来 预测或诊断疾病，如遗传性疾病
、癌症等。
基因治疗
通过修改或替换病变基因来治疗 疾病，如基因编辑技术CRISPR-
Cas9等。
个性化医疗
基于患者的基因组信息，制定个 性化的治疗方案，提高治疗效果
和减少副作用。
肿瘤分子生物学研究
肿瘤基因
研究肿瘤相关基因的突变、表达和调控，揭示肿瘤发生和发展的分 子机制。
分子生物学ppt课 件完整版
目 录
• 分子生物学概述 • DNA的结构与功能 • RNA的结构与功能 • 基因的表达与调控 • 分子生物学技术与方法 • 分子生物学在医学领域的应用
01
分子生物学概述
医学分子生物学实验ppt课件
3）在电泳中形成肉眼可见的指示带，可判断DNA电泳的速度
和位置
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50
荧光染料 (如SYBR Green I)
荧光染料SYBR Green I嵌入DNA的碱基平 面后，本身无荧光的DNA在紫外光激发下 发出荧光，且荧光强度与DNA含量呈正比。
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SYBR Green I
51
DNA 分子标准物 (DNA Marker)
用大量程的移液器移取小体积的液体 装配吸头时气密性不好，吸头不匹配 吸液速度和放液速度太快
自我检测漏气：吸取液体，垂直静置5秒，
观察是否有液滴流出；
规范操作，损坏赔偿！
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21
实验报告要求
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22
实验报告按下列要求书写
❖ 1. 实验题目——当次实验
❖ 2. 实验原理——简明扼要，有针对性
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1
2
3
4
5
6
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琼 脂 糖 凝 胶 电 精选编辑ppt 泳 系 统
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紫外投射分析仪：
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47
凝胶成像系统
精选编辑ppt
48
琼脂糖凝胶电泳操作步骤
❖ 样品：PCR产物 10 µl ❖ 加上样缓冲液2 µl，加荧光染料如Sybr Green I
注意点：缓慢转动，记录时间
❖ 停止（转速按钮回零，时间按钮回零，完全停止后 轻轻取出离心管）
精选编辑ppt
6
使用注意事项
❖ 1. 样品需对称放置； ❖ 2. 先调节离心时间，离心开始缓慢提高转速
至设定值； ❖ 3. 离心结束需等转子完全停止后才能打开离
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参考文献
1.马金石. 绿色荧光蛋白[ J] . 化学通报, 2009, 72( 3) : 243 250.
2. 季爱加, 宁喜斌 原核表达载体 pET28a EGFP 的构建与表 达 微生物学杂志 2011 年7 月第31 卷 第4 期
• 继续培养，分别在1、2、3h和过夜培养后各取1mL样品，作为诱导后 的样品。
• 每次取1mL样品置于Eppendorf管中，冰浴待用。诱导完后，将样品 5000r/min离心5min，回收上清液进行下一步实验或者保存在-20℃冰 箱中。
检测：SDS-PAGE原 理
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
制备感受态细胞
制备E.coli BL21(DE3)的感受态细胞——CaCl2法
（一）受体菌培养 1.从LB平板上挑取新活化的E.coli菌落，接种于5 ml LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜。 2.以2%接种量将过夜菌培养的E.coli接种于5 ml LB培养基中，37 ℃振 荡培养2-3 h，至菌浓度OD600=0.3-0.5 （二）感受态制备 1.将培养液冰浴20 min，取1.5ml菌液于无菌EP管中，4℃离心6000 rpm ，5 min. 2.重复上述操作，收集4.5ml菌液的菌体. 3.以预冷的800μLCaCl2轻悬菌体，冰上放置10min，4℃离心6000rpm，5 min.4.弃上清，加入100μL预冷CaCl2轻轻悬浮细胞，冰上放置数分钟后 即为感受态细胞悬液。
• 分别取过夜培养物100μL接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体 培养基，37℃恒温培养1~2h。
• 当细菌浓度A600达到0.4~0.6时，分别取出样品1mL作为IPTG诱导前的 样品，其余样品中添加100mmol/L的IPTG至终浓度为2mmol/L，其中一 瓶实验组不加IPTG的对照。
《分子生物学》课件-分子生物第六章.ppt
• 该方法操作简便，成本较低，适合于从培养细胞和动物组 织中提取RNA
(二)mRNA提取
四、核酸纯度鉴定 （一）核酸浓度检测
• DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值， 用标准样品测得在波长260nm处，A260＝1时， 样品中双链DNA浓度为50 μg/ml，单链DNA或 RNA浓度为40 μg/ml，或相当于20μg/ml寡核 苷酸
的活性 ②溶液II（200mmol/L NaOH，1% SDS，pH=12·5)： • 裂解细菌 • 使蛋白质、染色体DNA和质粒DNA变性 ③溶液III(3mol/L醋酸钾，2mol/L醋酸，pH=4·8) • 使变性蛋白质与染色体DNA共沉淀 • 闭环质粒DNA复性，留在上清液中 • 通过离心分离提取
2·收获和裂解细菌
• ①机械法:超声波、玻璃珠等（易引起 DNA断裂）
• ②化学试剂法:十二烷基硫酸钠 (SDS)等 （单用难以充分裂解）
• ③溶菌酶-化学试剂联合法:先用溶菌酶消 化，再用化学试剂处理（最常用）
3·分离纯化质粒
• 关键：除去染色体DNA • 质粒DNA特性： ①相对较小（仅为染色体DNA的0.1%-2%） ②闭环（染色体DNA大量断裂并且呈线性结构） • 提取方法：氯化铯密度梯度分离法、碱裂解法、
三、真核生物RNA
最关键的是抑制RNA酶的活 性(RNase无处不在，稳定 并且耐高温 )
提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备
• 塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用0.1%二乙基焦碳酸 盐（DEPC）水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯 仿腐蚀,故不能使用氯仿处理)
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实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取一、实验目的学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂1、实验材料大肠杆菌（E. coli） DH5α菌株：R-，M-，Amp-2、实验设备恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅3、试剂酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素三、实验步骤液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction) 0.5% （0.5g/100 ml）氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）PH 7.0固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！(1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。
(3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。
(4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。
(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培养基。
(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。
并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。
当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。
待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。
(8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。
(9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。
每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。
(10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。
快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。
(11)接种环蘸取菌液，密密划线。
(12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。
(13)一天后观察菌落。
四、思考题(1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌种的什么信息？(2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？(3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什么不是正放呢？(4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？实验二碱裂解法小量提取质粒DNA一实验目的了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。
二实验原理本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。
十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。
由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。
最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。
从细菌中分离质粒DNA的方法主要包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
三实验材料转化质粒pUC19后经氨苄抗性筛选获得的E. coli DH5α系列菌株四实验设备微量取液器(100μl,1000μl)，台式高速离心机五试剂溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。
溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH 、1％ SDS (临用前用0.4mol/L NaOH 和2％ SDS母液稀释)。
溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。
溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L 饱和酚、氯仿、TE缓冲液六实验步骤1. 用移液枪取1.5ml培养液放入1.5ml eppendorf管中，5000 rpm 5 min收集菌体；2. 弃上清,将管倒置于吸水纸上尽量使液体流尽；3. 菌体沉淀重悬浮于200μl溶液Ⅰ中；4. 按试剂配方配制溶液Ⅱ，加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和上下颠倒eppendorf管数次以混匀溶液(千万不要振荡，动作轻柔)；5. 立即加入200μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口并温和颠倒离心管数次，混匀溶液，置冰浴中10分钟；6. 12000 rpm离心10分钟；7. 加入等体积的酚/氯仿(1:1)，颠倒混匀， 12000 rpm 10分钟；8. 小心吸取上清夜移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟；9. 12000 rpm离心10分钟；10. 弃上清, 将管倒置于吸水纸上使所有液体流出，加入200μl 预冷的70％乙醇洗涤沉淀。
11. 同步骤10，重复洗涤沉淀一次；12. 弃去乙醇溶液，将管倒置于吸水纸上使液体流尽，室温或37℃下干燥；13、将沉淀溶于5μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
[注意]1. 提取过程应尽量保持低温。
2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好。
最好在用酚/氯仿抽提一次后再用氯仿抽提一次，以去除残留的酚对质粒的后继实验，如酶切反应等的不良影响。
3. 沉淀DNA通常使用冰冷的无水乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
沉淀DNA也可用异丙醇，但由于常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
4. 质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性。
5．用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：CA.染色体DNA断成了碎片B.染色体DNA分子量大，而不能释放C.染色体变性后来不及复性D.染色体未同蛋白质分开而沉淀七思考题1.溶液I中葡萄糖和EDTA各有什么作用？答：葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2. 溶液II为何必需即用即配？答：NaOH溶液长时间配制存放会与空气中的CO2反应，降低PH值，影响对细胞的裂解作用。
3. 加入溶液II后作用时间不能长，需要快速加入溶液III中和碱性溶液。
如果溶液II的作用时间过长或者反应过于激烈会导致什么后果？答：作用时间过长会使细菌的基因组DNA被打断，从而不能被彻底沉淀除去，影响质粒DNA的纯度。
4. 在变性蛋白质的过程中，为何必须注意不要将酚残留在上清液中？答：残留的酚对核酸酶具有抑制作用，因而会影响后面质粒DNA的酶切反应。
5. 最后DNA沉淀可以溶解在双蒸水（ddH2O）中，但最好溶解于TE 缓冲液中，为何？答：由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
实验三琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA一、实验目的：学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，了解质粒DNA电泳条带的多态性二、实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。
在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。
如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。
当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快，开环与线状分子的泳动亦有差异，于是在电泳时会产生三个条带的现象。
三、试剂与仪器设备：1. 质粒DNA2. 琼脂糖3. 6×载样buffer 0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油4．50×TAE 电泳Buffer 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。
5．溴化乙锭(EB)溶液 10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液，即凝胶中EB终浓度为0.5μg/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。
6. DNA Marker：共6条带，2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
上样6ul时750bp的带约为100ng，其余带约为50ng 7．各种国产移液器(10，20，100μl)8．消毒的tips枪头9．水平电泳槽和电泳仪四、实验步骤1、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入50ml 1×TAE稀释缓冲液,放电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
2、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间，将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。