双光子和光谱在激光共聚焦显微镜上的应用经验
双光子显微成像原理及近期应用案例
双光子显微成像原理及近期应用案例双光子显微成像是一种高分辨率的成像技术，它利用两个光子的共同作用实现对生物样本的成像。
该技术在生命科学、医学和材料科学等领域有着广泛的应用。
本文将介绍双光子显微成像的原理，并探讨其在近期的应用案例。
双光子显微成像的原理是基于非线性光学效应。
在传统的荧光显微镜中，利用单光子的激发来激发和探测样品中的荧光信号。
然而，单光子的能量较高，容易导致样品的光化学损伤和细胞的光毒性作用。
而双光子显微成像则采用两个光子的准同步非共线激发，以降低光毒性并增加分辨率。
双光子显微成像的工作原理是通过使用超短脉冲激光来激发样品中的荧光物质。
这种超短脉冲激光具有高能量浓度和高峰值功率，可以实现光穿透较深的样品，如活体组织。
当两个光子同时到达荧光物质并被吸收后，它们的能量叠加，使得荧光物质处于激发态，进而发出荧光信号。
通过检测和记录这些荧光信号，可以获取样品的高分辨率图像。
在生命科学领域，双光子显微成像因其高分辨率和非侵入性的优势而得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察细胞内的亚细胞器、蛋白质分子和细胞结构的变化。
双光子显微成像还可以用于监测神经元活动和细胞信号传导等重要生理过程。
通过对这些生物学过程的观察和研究，我们可以更好地理解生命的本质和疾病的发生机制。
近年来，双光子显微成像在医学诊断和治疗方面也取得了重要进展。
例如，在皮肤科领域，双光子显微成像可以非侵入性地观察皮肤水分含量、胶原蛋白分布和血管结构等，从而帮助医生诊断和治疗各种皮肤病。
另外，双光子显微成像还可以用于术前虚拟操作和手术引导等方面，提高手术的准确性和成功率。
例如，在眼科手术中，医生可以利用双光子显微成像技术精确地观察眼底血管和细胞变化，从而为患者提供更好的治疗方案。
除了生命科学和医学领域，双光子显微成像还在材料科学、纳米技术和能源研究等领域得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察材料中的晶格结构、电子云变化和界面反应等，为新材料的设计和合成提供重要的参考。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率的显微镜技术。
它结合了光学和计算机技术，通过使用激光扫描技术将样品的逐点扫描成像，可以获取到非常清晰的三维图像。
激光扫描共聚焦显微镜的原理是基于共焦聚焦技术。
它使用一束激光光束照射在样品表面上，并收集激光光束的反射或荧光信号。
激光光束通过一个探测镜来聚焦在样品表面上的一个非常小的点上，该点称为焦点。
通过扫描样品，系统可以获取到完整的样品图像。
1.高分辨率：激光扫描共聚焦显微镜可以获得非常高的分辨率。
由于只有焦点附近的信息被收集，所以可以消除反射和散射带来的干扰，提高图像的清晰度和分辨率。
2.三维成像：激光扫描共聚焦显微镜可以进行多个焦面的扫描，从而获取到三维样品图像。
这使得可以观察样品的内部结构和深层次的信息。
3.高灵敏度：激光扫描共聚焦显微镜可以检测到样品的荧光信号。
这在生物医学领域中非常有用，可以用于观察细胞和组织中的荧光标记物。
4.实时观察：由于激光扫描共聚焦显微镜具有快速扫描和成像的能力，因此可以进行实时观察。
这对于研究动态过程和实时观察样品的变化非常有用。
在生物医学研究中，激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于观察和研究活细胞及组织的结构和功能。
它可以用于观察和研究细胞器的位置和运动、细胞的分裂过程、病理细胞的形态学变化等。
在材料科学研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究材料的结构和性质。
它可以帮助研究人员观察各种材料的微观结构、表面形貌以及材料中的缺陷和分子分布等。
在纳米技术研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究纳米材料的形态和结构。
它可以帮助研究人员观察纳米粒子的形状、大小和分布，研究纳米材料的组装过程和性质等。
总之，激光扫描共聚焦显微镜是一种非常强大并且在科学研究中得到广泛应用的显微镜技术。
它通过激光聚焦和扫描技术，可以获得高分辨率、三维成像和实时观察的样品图像，并且在生物医学研究、材料科学和纳米技术等领域有着重要的应用价值。
激光共聚焦显微镜系统的原理和应用
激光共聚焦显微镜系统的原理和应用激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。
能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。
一.激光共聚焦显微镜系统应用领域：涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。
二.基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
双光子共聚焦显微镜FV1200MPE使用说明
点击 观察透射光（倒置显微镜） 2. 选择染料 点击 跳出荧光染料选择窗口，选择对应荧光 >> Apply 3. 扫描图像
Focus X2 以 2 倍速扫描图像，适合低扫描分辨率图像的快速聚焦（忽 略 Kalman、慢速扫等功能） Focus X4 以 4 倍速扫描图像，适合高扫描分辨率图像的快速聚焦（忽 略 Kalman、慢速扫等功能） XY Repeat 可以直接高质量扫描图像，但速度略慢（使用 Kalman、 慢速扫等功能） XY 适合快速预扫描后直接高质量出图，可以执行高级 lamda/Z/Time 扫描（使用 Kalman、慢速扫等功能） 六、关机步骤： 1. 物镜 Escape，无水乙醇擦净镜头。 2. 滤光转轮放至 DICT。 3. 软件上一定要关闭双光子激光器！ 4. 关闭软件。 5. 拧闭总控器（1 把）和共聚焦激光器钥匙（2 把）。 6. 从右至左关闭电源（其中汞灯长按关闭）。 7. 关闭电脑。 8. 待汞灯 300 秒倒计时完毕，关闭两个插线板总电源。
图9 激发分色镜（图 9a）：标识数字为反射的激光波段，其余波段荧光通 过。 荧光反射镜(图 9b)：标识数字为分界波段，如图表示为<560nm 波段反射，>560nm 波段将透过该镜片。 吸收滤色镜（barrier filter）(图 9c)：用于过滤特异波段的荧光， 在光谱系统中该部分可以通过狭缝和光栅随意调节。标识一般表示为 “带通”，如图表示 505nm-525nm 波段的荧光可以通过此滤色片。 8. 物镜： 成像的决定性部件，对系统的分辨率、检测荧光强度等起决定作用。 系统分辨率(能够检测相互靠近两点的最小距离)R = k×NA/λ 物镜的数值孔径（Numerical Aperture）：NA 越高，分辨率越好。 介质折射率：折射率越高，物镜能够达到的 NA 越高。 色差校正：对可见光各波段的校对能力，使同一点发出的不同颜色的 光能够同时成像到同一平面的能力。 五、数据采集 三步骤获取图像 1. 观察 显微镜下观察标本，选择合适的物镜
激光共聚焦显微镜的原理和应用
激光共聚焦显微镜的原理和应用1. 引言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，已经广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。
本文将介绍激光共聚焦显微镜的原理和应用。
2. 原理激光共聚焦显微镜通过激光束的共聚焦和通过物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
2.1 激光共聚焦•通过透镜来聚焦激光束•聚焦点在样本表面上产生光斑•样本反射或发射出来的光再次通过透镜，聚焦到探测器上•透镜的位置可以移动，可以扫描整个样本2.2 反射和荧光信号的采集•激光束照射到样本上，经过反射或荧光发射•光学系统收集并聚焦这些发射的光•通过探测器记录下发射光的强度和位置•通过移动透镜和探测器，可以获得样本的三维图像3. 应用激光共聚焦显微镜在许多领域都得到了广泛的应用，以下是其中的几个典型应用。
3.1 细胞生物学•可以观察细胞的形态和结构•可以追踪细胞内的生物分子运动•可以观察细胞的生物化学过程3.2 分子生物学•可以观察和定量细胞器的分布和聚集情况•可以观察和测量分子的扩散速率•可以研究蛋白质的合成和代谢过程3.3 医学研究•可以观察和诊断组织和器官的病理变化•可以研究疾病的发生和发展机制•可以评估治疗方法的有效性和副作用3.4 材料科学•可以观察材料的微观结构和表面形貌•可以研究材料的热力学和力学性质•可以评估材料的耐久性和可靠性4. 总结激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，通过激光束的共聚焦和物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
它在细胞生物学、分子生物学、医学研究和材料科学等领域都有着广泛的应用。
利用激光共聚焦显微镜，科研人员可以观察和研究生物和材料的微观结构、功能和相互作用，为科学研究和应用提供了强大的工具。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
双光子激光扫描荧光显微镜及其应用
表 1 几种常见荧光分子的单光子 、双光子 和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单 、双光子激发过程示意图
图 2 单 、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它 的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激 发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对 双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面 、准 确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦 激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
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2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个 光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以 光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常 的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同 时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子 激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体 中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单 地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激 发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时 吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这 就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源
共聚焦激光扫描显微镜技术在医学研究中的应用讲解
共聚焦激光扫描显微镜技术在医学研究中的应用上世纪80年代发展起来的一种先进的细胞生物学分析仪器,是一项具有划时代意义的高科技新产品,是近代生物医学图像分析仪器最重要的发展之一,有细胞“CT”之称。
它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外线或可见光激发荧光探针,从而得到组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+,pH值、膜电位等生理信号及细胞形态改变,成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代较有力的研究工具。
1 基本构造与原理 CLSM是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的一种高尖设备。
其主要由计算机系统、激光发射系统、探子系统、X-Y轴台阶系统和Z轴前进马达构成。
计算机系统一般由不同型号的CLSM作相应硬件配置及相应的图像采集、分析、离子测定等软件配置。
激光器通常是氪-氩离子混合激光管,可有多个激光波长。
按工作介质不同,激光器可分为气体、固体、染料和半导体等几种。
而近年来问世的双光子激光器具有更明显的优势。
“双光子”具有更强的穿透力,更为重要的是其比普通的CLSM的激光能量低,因此对活细胞的损伤更小, 同时减少高能量激光对荧光染料的漂白效应,从而使观察活细胞的实验过程延长。
CLSM采用点光源代替传统光镜的场光源,使探测点与照明点相对于物镜焦平面是共扼的。
焦平面以外的点不会在探测点处成像,只有焦平面上的点同时聚焦于探测点和照明点,即共聚焦。
以激光做光源并对样品进行扫描,在此过程中两次聚焦,因此称为共聚焦激光扫描显微镜。
2 主要优点 . 提高了敏感性及分辨率使用荧光素交联的抗体来测定细胞内的某些特异性参数在生物医学研究中已基本普及应用,但常常受到不在同一焦平面上的荧光干扰,而造成本底较高、组织结构细节不易分辨清楚。
CLSM的分辨率高于普通光镜,同时CLSM将高敏感性的光电倍增管合为一体,并应用数字滤过功能, 使信噪比最佳化,尽可能地排除了焦点以外的荧光干扰。
激光共聚焦显微镜的原理和应用讲解
激光共聚焦显微镜的原理和应用李楠王黎明杨军关键词激光; 显微镜; 原理和作用中国图书资料分类法分类号R 318. 51激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品, 它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图象处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象, 在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+、pH 值, , 成为形态学, , , 学, 1994, 了目前世界次最高, 功能最全的美国M eridian 公司的产品:A cas 系列U lti m a 型和扫描速度最快的In sigh t 型两台激光共聚焦仪。
仪器自1995年5月份到货安装以来, 已为我院7个科室的10个课题所应用, 目前主要开展的研究内容有:(1 细胞内游离钙的实时监测; (2 细胞通讯的研究; (3 细胞形态学的研究。
1基本原理和功能1. 1基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源, 标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰; 激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描, 标本上的被照射点, 在探测针孔处成像, 由探测针孔后的光电倍增管(PM T 或冷电耦器件(cCCD 逐点或逐线接收, 迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭作者单位解放军总医院实验仪器中心, 北京100853的, 焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔, 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面, 克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
在显微镜的载物台上加一个微量步进马达, 可使载物台上下步进移动, 最小步进距离为的0. 1Λm , 能清楚地显示, 实现了的目的, 这就是21. . CT ”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平, 使图像更加清晰, 从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数
LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数LSM780双光子激光共聚焦显微镜是一种基于双光子荧光共聚焦显微镜技术的高性能显微镜，具有高分辨率、深入组织的成像能力，能够提供关于三维结构和功能的细胞和组织的详细信息。
下面将详细介绍LSM780双光子激光共聚焦显微镜的技术参数。
1. 激光系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜通常配备两个紫外激光器，能够提供两个不同波长的激光，通常为800nm和1040nm。
这些激光器可以分别或同时使用，以适应不同的样品和实验需求。
2.激光功率：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的激光功率通常在几十至上百毫瓦之间。
激光功率的选择取决于样品的特性和实验需求，功率越高，进一步成像的深度越大，但也会增加样品的破坏风险。
3.探测系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的探测系统包括一个探测单元、一个光学滤光片轮和一个光电倍增管（PMT）。
探测单元通常包含两个探测器，可用于收集荧光信号和二次非线性光学信号，以获得不同的成像信息。
4.透射探测：LSM780双光子激光共聚焦显微镜还可配备透射探测系统，用于监测透过样品的激光强度，以实现更精确的深度控制和真实的三维成像。
5.XY扫描系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的扫描系统通过使用高速扫描镜和电子扫描控制器来实现XY扫描，以获取二维图像。
扫描速度和分辨率可以通过调整激光功率和扫描模式进行优化。
6.Z轴扫描系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的Z轴扫描系统通常由一个压电陶瓷驱动器和一个扫描镜组成，可以实现在样品的Z轴方向上进行成像，从而获得三维图像。
7. 图像处理软件：LSM780双光子激光共聚焦显微镜通常使用配套的图像处理软件，如Zeiss ZEN软件，用于图像采集、分析和处理。
该软件提供了多种功能，包括多通道成像、3D成像和图像重建等。
总之，LSM780双光子激光共聚焦显微镜具有先进的激光系统、灵活的样品探测系统、高速和高精度的扫描系统以及强大的图像处理软件等技术参数，为研究者提供了一种高分辨率、高亮度和无损伤成像的显微技术工具。
激光共聚焦显微镜原理和应用
激光共聚焦显微镜原理和应用
激光共聚焦显微镜，又称双代理镜，是一种精密的衍射成像仪器，在
显微镜中用于研究各种微小样品的形态、结构和化学特性。
激光共聚焦显
微镜是一种高灵敏的、具有很高的分辨率的光学显微成像系统，在生物、
材料和分析科学等领域有着广泛的应用。
激光共聚焦显微镜的基本原理是利用一种双代理镜，其中一个代理镜
将外入的量子光束分成两部分，一部分照射到样品上，另一部分反射到另
一个代理镜上，两支平行光线通过要研究的样品，做出聚焦的衍射图像，
然后将衍射图像反射到接收端，接收端再将衍射图像转换成电子信号，然
后显示在屏幕上，这样就能将样品的形态、结构和化学组成辨认出来。
由于激光共聚焦显微镜的衍射成像效果比传统的光学显微镜要好，所
以在研究微小样品的形态、结构和化学组成时非常有用。
它可以用来观察
微小样品的形状和细节，如细胞、细菌和细胞器结构等，还可以观察抗原、抗体和药物在细胞和组织内的分布情况，在药物研发、生物医学、食品卫
生质量检测等多个领域得到了广泛的应用。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM ）的原理从基本原理上讲, 共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜, 它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好, 光源波束的波长相同, 从根本上消除了色差。
1． 2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 消除了球差; 并进一步消除了色差1． 3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点, 用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像, 再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的, 标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号, 并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中, 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像, 得到的图像是数字化的, 可以在电脑中进行处理, 再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管, 可以将很微弱的信号放大, 灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合, 是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前, 一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜, 它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合, 如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ等, 因此被称为万能显微镜, 通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
共聚焦激光显微镜原理及应用
共聚焦激光显微镜原理及应用共聚焦激光显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，简称CLSM）是一种高分辨率的显微镜，通过激光扫描和共聚焦原理，可以获得具有优良对比度和空间分辨率的三维显微图像。
本文将介绍共聚焦激光显微镜的原理、构造和应用。
一、原理共聚焦显微镜的原理基于激光扫描和共聚焦现象。
它使用激光作为光源，通过物镜透镜聚焦激光束在样品上方的一个点上。
样品中的荧光物质会在激光照射下发出荧光信号。
探测器能够收集到这些荧光信号，并通过共聚焦技术将来自样品的不同深度的信号聚焦到同一平面上，从而获得高分辨率的三维显微图像。
二、构造共聚焦显微镜的主要构造包括激光源、扫描系统、探测器和图像处理系统。
激光源通常采用激光二极管或氩离子激光器，用于产生高强度的激光束。
扫描系统由扫描镜和扫描控制器组成，可以控制激光束在样品上的扫描轨迹。
探测器用于收集样品发出的荧光信号，并将其转换为电信号。
图像处理系统用于对收集到的信号进行处理和显示，以生成高质量的显微图像。
三、应用共聚焦激光显微镜在生命科学、材料科学和医学等领域具有广泛的应用价值。
1. 生命科学领域：共聚焦激光显微镜在细胞生物学、分子生物学和神经科学等领域中起着重要作用。
它可以观察活体细胞内的亚细胞结构及其动态变化，如细胞器、细胞骨架和细胞核等。
通过标记荧光染料或融合蛋白，可以实现对特定蛋白或分子的定位和跟踪，从而研究生物过程的机制和调控。
2. 材料科学领域：共聚焦激光显微镜在材料科学中用于表面形貌分析、纳米结构观察和薄膜检测等。
它可以实现对材料表面和界面的高分辨率成像，帮助研究材料的结构、形貌和成分。
同时，通过激光扫描的方式，还可以进行局部区域的观察和分析，为材料设计和制备提供重要的参考。
3. 医学领域：共聚焦激光显微镜在医学诊断和病理学研究中有着广泛的应用。
它可以实现对组织和细胞的高分辨率成像，帮助医生观察和诊断疾病。
例如，可以对癌细胞进行标记和定位，研究其生长和扩散机制，为肿瘤的早期诊断和治疗提供依据。
双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜
院系：生命科学联合中心
仪器 编号 制造商 国别 经费 来源 责任 教授
201214339 德国 科研专款 或基金 程和平
所属ห้องสมุดไป่ตู้实验室 制造 厂商 单价 存放 地点
北京大学生命科学联合中心 蔡司 402.82万元 型号 购置 日期 LSM 710 NLOFLIM 2012年11月
程和平 否 程和平 服务 对象 电子 邮件 — chengp@ 收费 标准 联系 电话 62765957 — 开放 时间 —
608
双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜
主要研 究方向 在研 或曾 承担 重大 项目 奖项 专利 人才 培养 相 关 科 研 信 息 学 术 论 文
线粒体超氧炫、钙离子活动的机制和生理功能，活细胞内CaMKII酶活性和ATP浓度成像
国家基础研究项目（“973计划”）
— 博士生4人，硕士生2人
—
知名 用户 共 享 信 息 备 注 是否对 外开放 联系人
英杰交流中心335E
基 本 信 息
技术指 标及功 能简介
红外飞秒激光，可见激光， 34 通道光谱检测系统， 10 种染料可用同一时间精确区分，电动显微镜， FLIM荧光寿命成像系统。细胞自身荧光寿命分析， 自身荧光对于标记荧光的有效区分活细胞钙离子浓 度测量,共振能量转移，局部氧气浓度测量。 光谱范围 350nm-1100nm ；覆盖近紫外、可见光、 近红外波段。其光谱分辨率 3nm ，采用 x 、 y 轴独立 双镜扫描；Coherent- Chameleon Vision II红外飞秒 脉冲激光器，波长范围：680-1080nm，包含色散补 偿功能；双光子显微镜提供反射和透射的 NDD 通 道；32通道可见光光谱成像；TCSPC设备时间通道 宽度最小可达813fs，荧光寿命图像最高分辨率可达 8192×8192。
双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验
图像采集与处理
采集参数设置
根据样本特性和实验目的，合理 设置图像采集的参数，如曝光时 间、增益等，以提高图像质量。
图像处理与分析
利用专业软件对采集到的图像进 行必要的处理和分析，如去噪、 增强对比度、测量荧光强度等。
数据导出与共享
将处理后的数据导出为通用的文 件格式，便于进一步的数据分析 和共享。
防止光漂白
在观察过程中，应尽量避免长时间 照射和频繁扫描，以减少荧光染料 的光漂白。
荧光探针的选择与使用
探针特异性
选择具有高特异性的荧光探针，以确 保标记的准确性和可靠性。
探针浓度与稳定性
探针混合使用
在某些情况下，可能需要将几种荧光 探针混合使用，此时应确保它们之间 不会发生相互干扰或淬灭现象。
根据实验需求，调整荧光探针的浓度， 并确保其在样本中的稳定性。
药理学研究中的应用
总结词
双光子和光谱扫描在药理学研究中具有重要价值，能够观察药物对细胞和组织的影响，有助于发现新 的药物作用机制和靶点。
详细描述
在药理学研究中，双光子和光谱扫描技术被广泛应用于观察药物对细胞和组织的影响。这些技术能够 实时监测药物对细胞代谢、能量代谢、蛋白质表达等方面的影响，帮助科学家们发现新的药物作用机 制和靶点，为新药研发提供有力支持。
04 技术挑战与未来展望
提高成像深度与分辨率
优化双光子吸收截面
通过提高双光子吸收截面，可以降低成像所需的激光功率，从而 减少光毒性。
开发新型光谱扫描技术
通过改进光谱扫描技术，可以实现更快速、更准确的图像采集，提 高分辨率。
优化光学元件
选用高数值孔径的物镜和低噪声的光电探测器，提高成像深度和分 辨率。
察细胞和组织的细微结构。
光子学技术在光学显微镜中的使用技巧
光子学技术在光学显微镜中的使用技巧光学显微镜是一种广泛应用于生物学、物理学、材料科学等领域的重要仪器。
光子学技术的发展为光学显微镜的性能提升提供了新的可能。
本文将介绍光子学技术在光学显微镜中的使用技巧，包括共聚焦显微镜、荧光显微镜和融合显微镜等几个方面。
首先，共聚焦显微镜是一种利用光子学技术的先进显微镜。
它能够实现样品的三维成像和高分辨率观察。
在使用共聚焦显微镜时，需要注意以下技巧。
首先，要选择合适的激光波长。
不同的样品对激光的吸收和散射能力有所差异，选择合适的激光波长可以最大限度地提高成像质量。
其次，样品的染色也是关键。
常见的染色剂如DAPI、荧光标记物等可以提高样品对激光的响应。
此外，合理调节共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、像素大小等也可以影响成像效果。
其次，荧光显微镜是一种利用光子学技术进行标记成像的显微镜。
它可以通过荧光标记物对样品进行高对比度、高灵敏度的成像。
在使用荧光显微镜时，有几个技巧需要注意。
首先，要选择合适的荧光标记物。
不同的标记物对激发波长和发射波长有不同的要求，选择合适的标记物可以提高成像信号的强度和对比度。
其次，要进行合理的控制实验条件。
比如，避光操作可以减少背景噪声的干扰，合理调整激发光的强度可以避免标记物的漂白。
此外，对于多标记物同时进行成像的情况，要确保各个标记物的发射波长之间不会产生相互干扰。
最后，融合显微镜是利用光学显微镜和其他成像技术的优势相结合，进行高分辨率观察的显微镜。
在使用融合显微镜时，需要注意以下技巧。
首先，要根据样品的需要选择合适的成像模式。
融合显微镜可以结合光学显微镜、电子显微镜、原子力显微镜等多种成像模式，根据不同样品的特点选择合适的成像模式，可以获得更全面、更准确的信息。
其次，要熟练掌握不同成像技术的原理和操作方法，充分发挥不同成像技术的优势。
例如，利用原子力显微镜的高分辨率成像能力，可以观察到样品的表面形貌和局部力学性质。
总之，光子学技术为光学显微镜的使用带来了新的突破。
激光共聚焦显微镜原理和应用
激光共聚焦显微镜原理和应用共聚焦显微镜的发展历史1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。
1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。
1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。
1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到非常清晰的图像。
1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。
共聚焦显微镜最大的优点就是可以只检测一个聚焦平面的信号。
样品聚焦平面和检测器（光电倍增管）之前均有一个针孔，针孔的设置可以有效地滤除非聚焦平面的信号，增加显微镜的信噪比。
激光扫描显微镜能够逐点和诸行对样品进行扫描，最终根据象素信息形成一个高对比度和高分辨率的图像。
通过逐层对样品扫描并把每一层的图像组合成一个整体，激光扫描显微镜能够对样品进行三维分析，非常适合于超厚样品的检测。
传统显微镜是一次性照明整个视野中的样品，因此可以用眼睛直接观察或者用CCD获取图像，没有时间延迟；而共聚焦显微镜是逐点成像，无法用眼睛成像，也无法用CCD获取图像，只能用探测器收集每个象素点的信号，再通过软件重构图象，有一定的时间延迟。
How a Confocal Image is FormedCondenser Lens Pinhole 1Pinhole 2Objective LensSpecimen DetectorWide Microscopy and Confocal MicoscopyWide Field Confocal Field Wide Field Confocal FieldConfocal PrincipleTransmitted Light White Light Source630 nm BandPass Filter620 -640 nm LightTransmitted LightLight Source520 nm Long Pass Filter>520 nm LightTransmitted Light Light Source575 nm Short Pass Filter<575 nm Light Standard Short Pass FiltersOptical Filters Dichroic Filter/Mirror at 45 degReflected light Transmitted LightLight Source510 LP dichroic Mirror生命科学院的激光共聚焦显微镜Beam Path of Zeiss CLSM 510 METAThe unique scanning module is thecore of the LSM 510 META. It containsmotorized collimators, scanning mirrors,individually adjustable and positionablepinholes, and highly sensitive detectorsincluding the META detector. All thesecomponents are arranged to ensureoptimum specimen illumination andefficient collection of reflected oremitted light. A highly efficient opticalgrating provides an innovative way ofseparating the fluorescence emissions inthe META detector. The gratingprojects the entire fluorescencespectrum onto the 32 channels of theMETA detector. Thus, the spectralsignature is acquired for each pixel ofthe scanned image and subsequently canbe used for the digital separation intocomponent dyes.Focus ConeSpecimen X/Y ImageXYTo get an 2 D image, the excitation spot has to be moved over the specimen3 D information is acquired by moving the excitation focus not only in XY direction but also in Z direction. The result is a 3 D data stack consisting of number of XY images representing different optical sections from the specimenX/Y/Z StackZ-Driveoptical slice共聚焦显微镜的三维信息采集zxy# z sections =#imagesA confocal data set is similar to a book. A book has many pages, and Each page shows information only available if you move down to that page and ready it. Reading a page in a book, is just like scanning with a confocal microscope –you remove all of the other pages!z xy zyy The advantage of confocal microscopy is that you can visualize frames from a 3D object even in planes that you don’t image directly. This is called “slicing” an object and is an important component of confocal imaging.三维数据重构建荧光共振能量转移荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子标尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。
双光子共聚焦显微镜的原理
双光子共聚焦显微镜的原理
双光子共聚焦显微镜是一种高分辨率、三维成像的显微镜，它可以用
于成像细胞、组织和生物材料。
这种显微镜基于双光子激发荧光技术，可以利用激光束对样本进行扫描。
因此，它被广泛应用于生物医学、
材料科学和纳米技术等领域。
其工作原理是：利用高强度激光束在样本中产生双光子吸收作用。
双
光子吸收在非线性光学中，是一个基于量子机制而产生的非线性过程。
当两个光子在聚焦后同时达到样本中的某个特定区域时，它们的能量
就会被吸收，从而导致荧光发射。
这个过程被称为双光子激发。
在这一过程中，只有位于焦平面内的物质才能够吸收光子产生荧光信号。
因此，在显微镜中可以采用一组高分辨率的三维扫描镜头，控制
激光束的聚焦位置和深度，从而实现对样本的高分辨率成像。
与传统的荧光显微镜相比，双光子共聚焦显微镜可以显著提高成像的
分辨率和对深部组织的成像深度。
同时，该技术不需要对样品进行染色，避免了有机化学反应可能对样品造成的伤害。
总之，双光子共聚焦显微镜是一种重要的成像工具，它在生物医学、
材料科学和纳米技术等领域具有广泛的应用前景。
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副发射峰位于约540nm
Lambda合成图特征： 后者高度约为前者的一半
GFP：绿色偏蓝 自发荧光：绿色偏黄
呈台阶形 自发荧光：
叶绿素荧光：红色
在560nm左右对称分布
叶绿素荧光：
625nm以上强烈信号
可编辑版
6
转基因材料的快速筛选
原则：密集预排列待测样
技巧：lambda扫描
色彩判别
பைடு நூலகம்
荧光峰形检查
GFP蓝绿特征色
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8
非线性效应：碳纳米管
Ex 850
421
原理：某些材料在双光子
激发，会发射波长为激发
光一半的荧光
Ex 1000
利用不同波长的双光子激光照 射可能含碳纳米管的靶向药物， lambda扫描发现荧光信号呈现 严格的倍频关系
Ex 1040
498 518
可编辑版
9
光刻和深度扫描
一种人工合成的透明有机晶体， 在一定强度的近紫外光下会发生 局部变性，从而具有双光子效应
可编辑版
3
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
单光子激发，水稻根带有强烈的黄绿色
自发荧光
双光子激发，自发荧光为蓝色
ex 488nm，Lambda mode
ex 820nm , lambda mode
可编辑版
4
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
• 双光子激发下GFP荧光与自发荧光 的波长分离，820nm激发时，仅采 集493-542nm区间的信号以保证特 异性
在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm
ex 900nm 做z-stack，显示多层光 刻效果，信号随深度增加而衰减
可编辑版
10
叶表面蜡质层成像及厚度测定
菲（多环芳烃类）渗透 Ex 700nm Channel mode Z-stack
可编辑版
11
谢谢大家
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12
GFP台阶形特征峰
518
540
可编辑版
7
土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析
目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种 环境条件 问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧 光的杂质颗粒 解决： 1 固定样品体积 2 lambda成像检测GFP特异荧光 3 最大化pinhole
Ex 820nm, channel mode
可编辑版
5
微弱或自发荧光存在下的信号鉴定
Promoter::GFP载体注射烟草叶片（lambda mode成像）
GFP
叶绿素
转GFP弱表达
转GFP不表达
镜下目视特征：
光谱特征：
绿色信号被强烈红光掩盖 GFP：
GFP和RFP弱时无法分辨 主发射峰位于约518nm
双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微 镜上的应用经验
浙江大学生命科学学院 仪器与技术服务平台
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1
机型：Zeiss LSM710 nlo
690-1080nm可调谐飞秒激光器
32通道阵列PMT
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2
激光共聚焦显微镜的非常规应用
• 利用双光子分辨目标荧光和自发荧光 • 利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假 • 转基因材料快速筛选 • 嘈杂背景下的细胞计数 • 非线性效应 • 光刻和深度扫描 • 模拟近红外光源