双光子和光谱在激光共聚焦显微镜上的应用经验

副发射峰位于约540nm
Lambda合成图特征： 后者高度约为前者的一半
GFP：绿色偏蓝 自发荧光：绿色偏黄
呈台阶形 自发荧光：
叶绿素荧光：红色
在560nm左右对称分布
叶绿素荧光：
625nm以上强烈信号
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6
转基因材料的快速筛选
原则：密集预排列待测样
技巧：lambda扫描
色彩判别
荧光峰形检查
GFP蓝绿特征色
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3
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
单光子激发，水稻根带有强烈的黄绿色
自发荧光
双光子激发，自发荧光为蓝色
ex 488nm，Lambda mode
ex 820nm , lambda mode
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4
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
• 双光子激发下GFP荧光与自发荧光 的波长分离，820nm激发时，仅采 集493-542nm区间的信号以保证特 异性
GFP台阶形特征峰
518
540
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7
土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析
目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种 环境条件 问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧 光的杂质颗粒 解决： 1 固定样品体积 2 lambda成像检测GFP特异荧光 3 最大化pinhole
双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微 镜上的应用经验
浙江大学生命科学学院 仪器与技术服务平台
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1
机型：Zeiss LSM710 nlo
690-1080nm可调谐飞秒激光器
32通道阵列PMT
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2wenku.baidu.com
激光共聚焦显微镜的非常规应用
• 利用双光子分辨目标荧光和自发荧光 • 利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假 • 转基因材料快速筛选 • 嘈杂背景下的细胞计数 • 非线性效应 • 光刻和深度扫描 • 模拟近红外光源
在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm
ex 900nm 做z-stack，显示多层光 刻效果，信号随深度增加而衰减
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10
叶表面蜡质层成像及厚度测定
菲（多环芳烃类）渗透 Ex 700nm Channel mode Z-stack
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11
谢谢大家
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12
Ex 820nm, channel mode
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5
微弱或自发荧光存在下的信号鉴定
Promoter::GFP载体注射烟草叶片（lambda mode成像）
GFP
叶绿素
转GFP弱表达
转GFP不表达
镜下目视特征：
光谱特征：
绿色信号被强烈红光掩盖 GFP：
GFP和RFP弱时无法分辨 主发射峰位于约518nm
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8
非线性效应：碳纳米管
Ex 850
421
原理：某些材料在双光子
激发，会发射波长为激发
光一半的荧光
Ex 1000
利用不同波长的双光子激光照 射可能含碳纳米管的靶向药物， lambda扫描发现荧光信号呈现 严格的倍频关系
Ex 1040
498 518
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9
光刻和深度扫描
一种人工合成的透明有机晶体， 在一定强度的近紫外光下会发生 局部变性，从而具有双光子效应