肿瘤抗原的制备

肿瘤抗原的制备

2．1．取手术切除的无菌肿瘤组织，用%的洗必泰浸泡30分钟。

2．2．无菌生理盐水冲洗3遍。

2．3．用无菌的组织剪剪碎，加入5ml RPMI 培养基研磨，经200目网过滤后收取单细胞悬液。

2．4．后用RPMI重悬细胞（1*107/ml），装入5ml无菌冻存管，经水浴加热1小时后，60 o C水浴继续加热1小时。

2．5．将冻存管迅速浸入液氮速冻，10分钟后取出，放入室温融化；反复5次。2．6．将肿瘤细胞裂解物加入Falcon离心管，离心20分钟，收取上清。2．7．肿瘤细胞冻溶上清经0.2um的一次性无菌滤器（Pall, 4612）过滤除菌。3．外周血树突状细胞的培养

3．1．细胞来源

自愿接受经抗原冲击的自体树突状细胞瘤苗过继回输治疗的病人，且外周血白细胞在正常范围，不经药物动员即可经临床血细胞分离机分离单个核细胞。经血细胞分离机分离约4L全血，获得1-5*109单个核细胞，用以树突状细胞的体外培养。

3．2．用淋巴细胞分离液分离去除残留红细胞和粒细胞

收取的单个核细胞（约100ml）

3．3．离心后用平口巴氏滴管吸取界面细胞，收取细胞。

3．4．将经离心洗涤的单个核细胞用培养基配成4*106/ml的细胞悬液，种入750ml 无菌Falcon培养瓶，接种体积25ml。

3．5．将盛有细胞的培养瓶置5%二氧化碳，饱和湿度的培养箱中培养贴壁12

小时。

3．6．将培养瓶取出，轻轻摇晃十数次，使非贴壁细胞悬起，弃去悬浮细胞，再缓慢往瓶中加入培养基，轻轻晃动洗去残留非贴壁细胞。

3．7．往保留贴壁细胞的培养瓶中加入含特殊因子的新鲜完全培养基置5%二氧化碳，饱和湿度的培养箱中继续培养。

3．8．培养至第3天，往培养瓶中补充新鲜培养基，继续培养2-3天。3．9．培养过程中每天1次观察细胞的形态，在培养的第5，6天，可见细胞变为毛刺状，并聚集成团。

3．10．终止培养，用10ml吸管轻轻吹打培养瓶底部，使部分半贴壁的树突状细胞悬起，将培养液吸入50ml离心管，200g离心10分钟，收取细胞。

4．树突状细胞的抗原冲击

4．1．将收取的树突状细胞用含特殊因子的新鲜完全培养基配成2*106/ml的细胞悬液，以50ug/ml的浓度加入制备的肿瘤抗原，过夜培养。

4．2．用50ml离心管收取经与肿瘤抗原孵育过夜的树突状细胞悬液，200g离心10分钟，收取细胞；再加入40ml无菌生理盐水洗涤，连续3次。收集细胞即为APDC，取部分产品按检定规程检测各类指标。

4．3．肿瘤抗原冲击的树突状细胞对淋巴细胞刺激功能的检测