DNA文库的构建精
合集下载
怎样构建基因组文库
E 与载体相连
2
1
甲基化酶 人工接头I REI
人 工 接 头 II
REII 与载体相连 3 重 组 cDNA
ds-DNA合 成
与 SalI匹 配 接头相连
NotI酶 切
cDNA的定向插入
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA
ligase
NotI primer/adaptor SalI adaptor
P o ly A 3 1
51
GGG
M o d ifie d o lig o (d T ) P rim e r
F irst-stra n d sy n th e sis c o u p le d w ith (d C ) ta ilin g b y R T
51
GGG CCC
p o ly A
T e m p la te sw itc h in g a n d e x te n sio n b y R T
1) 当反转录酶合成到mRNA模板5’端后,它会在第一 链的3’端加上几个C; 2) 合成的寡核苷酸G与C配对； 3）反转录酶以新合成的cDNA为模板，继续合成第 二条cDNA链； 4）LD PCR—Long Distance PCR
S M A R T M eth o d
P o ly A + R N A
2. Okayama–Berg改进法
该法集中了常规方法和 Okayama–Berg法的优点,第 一条cDNA链合成用常规法， 但在3’-端加尾后，其余步 骤与Okayama–Berg法相同
UC19
1)Pst I 2)TdT+dGTP
GGGG GGGG
Sma I
CCCC
GGGG
2
1
甲基化酶 人工接头I REI
人 工 接 头 II
REII 与载体相连 3 重 组 cDNA
ds-DNA合 成
与 SalI匹 配 接头相连
NotI酶 切
cDNA的定向插入
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA
ligase
NotI primer/adaptor SalI adaptor
P o ly A 3 1
51
GGG
M o d ifie d o lig o (d T ) P rim e r
F irst-stra n d sy n th e sis c o u p le d w ith (d C ) ta ilin g b y R T
51
GGG CCC
p o ly A
T e m p la te sw itc h in g a n d e x te n sio n b y R T
1) 当反转录酶合成到mRNA模板5’端后,它会在第一 链的3’端加上几个C; 2) 合成的寡核苷酸G与C配对； 3）反转录酶以新合成的cDNA为模板，继续合成第 二条cDNA链； 4）LD PCR—Long Distance PCR
S M A R T M eth o d
P o ly A + R N A
2. Okayama–Berg改进法
该法集中了常规方法和 Okayama–Berg法的优点,第 一条cDNA链合成用常规法， 但在3’-端加尾后，其余步 骤与Okayama–Berg法相同
UC19
1)Pst I 2)TdT+dGTP
GGGG GGGG
Sma I
CCCC
GGGG
12 第十二讲 DNA文库的构建
部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子， 在该重组子群集中包含了其全部特别适合某些病毒 基因组结构克隆对应一种mRNA序列，这样在 目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较 低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的， 由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序 列。
基因重组
体外包装不同的基因， 但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有 15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同 的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克 隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得 多。
转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序
列的结构与功能。基因组DNA与cDNA的比较基因组DNA的重组cDNA分子反映来源细胞 中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNmRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹ 检测⑴基因组DNA的分离制备 不同来源的DNA制备方法不同。 一般来说，有液相法和固相法两种。 液相法提取的DNA长度一般在100kb左右， 基本可以满足构建各种小插入片段基因组文 库的要求。
大相对分子质量(high molecular weight,HMW) 基因组DNA的提取方法
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组3.2 基因组信息的可重建性 通过建立叠连群(conti一般来说，DNA片段长，完整基因组文 库所含的克隆数越少。反之，越多。 基因组越大，应包含的克隆数越多， 反之，越少。
4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的 特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的 oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一 链。
基因重组
体外包装不同的基因， 但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有 15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同 的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克 隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得 多。
转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序
列的结构与功能。基因组DNA与cDNA的比较基因组DNA的重组cDNA分子反映来源细胞 中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNmRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹ 检测⑴基因组DNA的分离制备 不同来源的DNA制备方法不同。 一般来说，有液相法和固相法两种。 液相法提取的DNA长度一般在100kb左右， 基本可以满足构建各种小插入片段基因组文 库的要求。
大相对分子质量(high molecular weight,HMW) 基因组DNA的提取方法
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组3.2 基因组信息的可重建性 通过建立叠连群(conti一般来说，DNA片段长，完整基因组文 库所含的克隆数越少。反之，越多。 基因组越大，应包含的克隆数越多， 反之，越少。
4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的 特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的 oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一 链。
DNA文库的构建和目的基因的筛选
第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选第一节 概述基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。
通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。
因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。
目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。
随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。
它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。
目的基因用途很广，主要有以下几个方面：①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。
②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。
③研究生物种系进化与相关同源性。
④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。
⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。
⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。
根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。
原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。
哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。
要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。
欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。
目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。
根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。
DNA文库的构建和目的基因的筛选
指某一生物体全部或部分基因的集 合，像一个没有目录的“基因图书馆”。某个生物 像一个没有目录的“基因图书馆” 的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重 或 的基因组 片段与适当的载体在体外重 组后，转化宿主细胞， 组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选 后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或 后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌
按照外源DNA片段的来源来分：基因组、 片段的来源来分：基因组、 按照外电泳
色 体 文 库 构 建
红色Ura+,Try+转化子菌落（四）基因组的筛选利用同源探针克隆基因
三、cDNA的构建 的构建构建cDNA应满足的条的筛选（一）构建cDNA应满足的条件 构建 应满足的条件
的代表性 重组cDNA的序列完整性 的序制备 的制备 细胞总 及mRNA的分离 的分离 cDNA第一链的合 第一链的合 成 双链cDNA链的合 链的合 双链 成 与载体的连接 噬菌体颗粒的大于研究基因的平均长度 含有相邻DNA片段的独立克隆间 片段的独立克隆间 含有相邻 克隆片段易于从载体上完整卸下最好不带任何载体序列 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。ຫໍສະໝຸດ （二）基因组的构建过程
基因组DNA的分离制备 的分离制备 基因组 基因组DNA的片段化 基因组 的片段化 载体制备 重组连接 噬菌体离体包装 重组噬菌体感 X
B
Ori
X
ARS1
pYAC4
酵 母
TRP1 CEN4 Sup4 S E
Sm
按照外源DNA片段的来源来分：基因组、 片段的来源来分：基因组、 按照外电泳
色 体 文 库 构 建
红色Ura+,Try+转化子菌落（四）基因组的筛选利用同源探针克隆基因
三、cDNA的构建 的构建构建cDNA应满足的条的筛选（一）构建cDNA应满足的条件 构建 应满足的条件
的代表性 重组cDNA的序列完整性 的序制备 的制备 细胞总 及mRNA的分离 的分离 cDNA第一链的合 第一链的合 成 双链cDNA链的合 链的合 双链 成 与载体的连接 噬菌体颗粒的大于研究基因的平均长度 含有相邻DNA片段的独立克隆间 片段的独立克隆间 含有相邻 克隆片段易于从载体上完整卸下最好不带任何载体序列 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。ຫໍສະໝຸດ （二）基因组的构建过程
基因组DNA的分离制备 的分离制备 基因组 基因组DNA的片段化 基因组 的片段化 载体制备 重组连接 噬菌体离体包装 重组噬菌体感 X
B
Ori
X
ARS1
pYAC4
酵 母
TRP1 CEN4 Sup4 S E
Sm
基因组文库构建
构 建 基 因 组 D N A 和 cD N A 文 库 的 流 程 示 意 图
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化 1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题： ①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算， 基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。 ②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，完整筛出更不容易。
H in d I I I C os N otI Z T7 P a rC CM SP6 N otI
r
H in d III 部 分 酶 切
P a rB P a rA
BAC o r iS PFG L re p E H in d I I I C IP
P u lse d -fie ld g e l e le c tro 使其成为一定大小的片段连接到适当载体常为噬菌体上经体外包装转染细菌得到一群含不同dna片全部基因的随酶切使其成为一定大小的片段，连 接到适当载体(常为噬菌体)上，经体外包装 转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组 噬菌体颗粒。此即是基因。这群DNA片 段含盖基因组全部基因。
但应注意： (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的 mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或DNA。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
真 核 基 因 组 DNA
λ 取 代 型 λ 噬 菌 体 载 体
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选.pp t
由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从
总RNA中富集mRNA是构建cDNA的一个重 要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大 提高筛选到目的基因的可能性。
二、第一链cDNA的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录 酶催化。
常用的反转录酶有2种：AMV（来自禽成髓细
的各种信息（如表达丰度、蛋白性内切酶或机械力量切割成一定长 度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重 组并转化相应的宿主细胞体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并 能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息 的自Moloey鼠白血 病病毒）。两者都是依赖于RNA的DNA聚合酶， 有5’→3’DNA聚合酶活性。（目前常用的反转 录酶多是通过点突变去掉RNase H活性的MoMLV）
反转录酶合成DNA时需要引物引导。常用的 引物主要有oligo（dT）引物和随机引物。 ① oligo（dT）引物一般包含15-30个脱氧胸 腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的寡 核苷酸片段； ② 随机引物一般包含6-10个盖基因组的倍数。
1975年Clar（1-p）/ln均插入片段的 长度和： 1）采用部分酶切或随机切割的方法来打断染 色体DNA，以保的插入片段大小所得到的平 均值。
插入效率表示有插入片段的克隆在所检测的
克隆中所占的比例，也是通过电泳检测的。
基因组覆盖倍数的估算方法有2种：
①用公式计算，基因组覆盖倍数=平均插入片 段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是 约数）； ②结合基因组针筛选到的阳性克隆 的总个数除以使用的总探针数。
三、第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过 程。 cDNA合成的方法： ①自身引导合成法； ②臵换合成法； ③引导合成法； ④引物-衔接头合成法。
总RNA中富集mRNA是构建cDNA的一个重 要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大 提高筛选到目的基因的可能性。
二、第一链cDNA的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录 酶催化。
常用的反转录酶有2种：AMV（来自禽成髓细
的各种信息（如表达丰度、蛋白性内切酶或机械力量切割成一定长 度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重 组并转化相应的宿主细胞体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并 能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息 的自Moloey鼠白血 病病毒）。两者都是依赖于RNA的DNA聚合酶， 有5’→3’DNA聚合酶活性。（目前常用的反转 录酶多是通过点突变去掉RNase H活性的MoMLV）
反转录酶合成DNA时需要引物引导。常用的 引物主要有oligo（dT）引物和随机引物。 ① oligo（dT）引物一般包含15-30个脱氧胸 腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的寡 核苷酸片段； ② 随机引物一般包含6-10个盖基因组的倍数。
1975年Clar（1-p）/ln均插入片段的 长度和： 1）采用部分酶切或随机切割的方法来打断染 色体DNA，以保的插入片段大小所得到的平 均值。
插入效率表示有插入片段的克隆在所检测的
克隆中所占的比例，也是通过电泳检测的。
基因组覆盖倍数的估算方法有2种：
①用公式计算，基因组覆盖倍数=平均插入片 段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是 约数）； ②结合基因组针筛选到的阳性克隆 的总个数除以使用的总探针数。
三、第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过 程。 cDNA合成的方法： ①自身引导合成法； ②臵换合成法； ③引导合成法； ④引物-衔接头合成法。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
和仅为4.6%，低丰度 的比例高达95.4% 基因组DNA饱和杂交法&基于复性，使筛选差异 表达基因的可能性大大提高 原理：将含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为 待测样本（tester），将基因表达谱相似或相近但不 含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为对照样本 （driver），使tester和driver的cDNA进行多次杂交， 去掉在二者之间都表达的基因，而保留二者之间差 异表达的基因。
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
DNA文库的构建
，包含该生物的所有遗传物质： 编码的、不编码的；应该是物种特异性的 组织（某一类细胞）的mRNA反转录成cDNA构建而成， 因此只包含被表达基因的编码序列（还有mRNA上的3‘、；体现了基因的表达调 控。
真核生物mRNA的结构
2、提取RNA基本步骤
总步骤：裂解细胞、沉淀蛋白、去除DNA、质量分析等； 裂解细胞： 强离液剂：胍盐, SDS, N-laurylsarcosine
(sarcosyl), 尿素, 苯酚 ； 破坏质膜，保持细胞核或细 胞器的完整性 ：如Nonidet P-40 (NP-40)，研磨、蛋白 酶K、蜗牛酶(含纤维素酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶和几丁 质酶等，可破坏酵母菌细胞壁)、SDS等处理； 沉淀蛋白：SDS、β -巯基乙醇、氯仿、苯酚、盐酸胍、异 硫氰酸胍等； 沉淀RNA：乙醇、异丙醇、氯化锂等； RNA质量分析； 从总RNA中纯化分离mRNA； RNA的长期保存。
制备基因组DNA的常用试剂
破碎细胞（液氮研磨、匀浆、超声波破碎） 除去蛋白杂质：（蛋白酶K、SDS、 CTAB、苯
酚）； 除去RNA(RNase A) 除去黏多糖(CTAB); 沉淀DNA（乙醇、异丙醇）； 抑制DNase（EDTA，可以螯合Mg++等）； 脱盐（70%乙醇漂洗）。
关键是对付RNase：措施
为了保证mRNA的完整性，必须使用最新鲜的生物材料， 最好是培养的活细胞，或从活体即刻采集的样品进行制备， 或者置于液氮、超低温冰箱保存的样品；
DEPC处理配置溶液用水：用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯 ，一种很强的RNA酶抑制剂）浸泡处理和高压灭菌；
烘烤玻璃器皿：200-300℃烘烤4小时；塑料器皿：在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底清洗，灭菌，即可去除 RNase；
真核生物mRNA的结构
2、提取RNA基本步骤
总步骤：裂解细胞、沉淀蛋白、去除DNA、质量分析等； 裂解细胞： 强离液剂：胍盐, SDS, N-laurylsarcosine
(sarcosyl), 尿素, 苯酚 ； 破坏质膜，保持细胞核或细 胞器的完整性 ：如Nonidet P-40 (NP-40)，研磨、蛋白 酶K、蜗牛酶(含纤维素酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶和几丁 质酶等，可破坏酵母菌细胞壁)、SDS等处理； 沉淀蛋白：SDS、β -巯基乙醇、氯仿、苯酚、盐酸胍、异 硫氰酸胍等； 沉淀RNA：乙醇、异丙醇、氯化锂等； RNA质量分析； 从总RNA中纯化分离mRNA； RNA的长期保存。
制备基因组DNA的常用试剂
破碎细胞（液氮研磨、匀浆、超声波破碎） 除去蛋白杂质：（蛋白酶K、SDS、 CTAB、苯
酚）； 除去RNA(RNase A) 除去黏多糖(CTAB); 沉淀DNA（乙醇、异丙醇）； 抑制DNase（EDTA，可以螯合Mg++等）； 脱盐（70%乙醇漂洗）。
关键是对付RNase：措施
为了保证mRNA的完整性，必须使用最新鲜的生物材料， 最好是培养的活细胞，或从活体即刻采集的样品进行制备， 或者置于液氮、超低温冰箱保存的样品；
DEPC处理配置溶液用水：用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯 ，一种很强的RNA酶抑制剂）浸泡处理和高压灭菌；
烘烤玻璃器皿：200-300℃烘烤4小时；塑料器皿：在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底清洗，灭菌，即可去除 RNase；
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
物理剪切—利用振荡、超声等物理方法剪 切可以非常随机地进一步将长片段切割成 小片段，片段末端通常都是平末端
限制性酶解—位点非随机分布。常用的酶 是Sau3A，该酶产生的酶切黏性末端与 BamHI酶解载体产生的末端相同
基因组DNA片段的限制性内切酶酶解
• 使用限制性内切酶酶解基因组DNA可产生非 随机片段，为了获得15－25kb的或更大的基 因组DNA片段（适用于λ噬菌体或黏粒载体 的片段），需要进行部分酶解，即通过合理 使用限制性内切酶（种类和用量），调节酶 切片段的大小
• 也可用反转录酶或Klenow酶延伸引物来合 成第二链。
•
cDNA末端的处理
• 由于大片段的平末端连接效率非常低，因 此为了避免用平末端体（EMBL3等）
• EMBL3 ：载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和 填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。 从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段
的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组 体将变成 red-gam- ，同时载体上含有 chiC 位
mRNA的提取
• 全长mRNA具有 一个polyA的3’ 末端，可以被用 于mRNA的分离；
• 可以用寡聚纤维 素柱，选择性地 吸附mRNA
• 纯化
• 用结合有寡聚（dT ）的磁珠加到细胞裂解 液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。
检测mRNA
• 翻译，检测翻译产物： 用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液 或兔网织红细胞裂解液）来检测 mRNA的完整性，也可用凝胶电泳 直接检测，用杂交法分离 mRNA。
示差筛)
• 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cD)得以实现的。
DNA和CDNA文库构建
（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌，
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因组DNA基因cDNA
基因组与cDNA最大的区别在于cDNA具 有时空特异型
一般覆盖倍数达到是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交
显示目标基因在片段)第二链cDNA的合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链 第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环 合成第二链cDNA S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成cDNA第二链
常用方法PCR合成法是构建cDNA的一种新策略， 已得到广泛应用。优点：
如果电泳观察到的28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条 带亮度的两倍，说明RNA样品完整，降解不多，如果两条带 的亮度反过来，说明部分28SrRNA已降解；如无清晰条带， 表明样品己严重降解。
mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
插
1）mRNA的完整性及mRNA的富集
通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的 完整性，间接判断mRNA的完整性。
则可将Spel酶切的 基因组DNA中或这一时期的特殊组织。
根 叶 花 花药 茎 穗下节cDNA 第一链的合成、c的基因组DNA或cDarbon公式：
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因组DNA基因cDNA
基因组与cDNA最大的区别在于cDNA具 有时空特异型
一般覆盖倍数达到是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交
显示目标基因在片段)第二链cDNA的合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链 第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环 合成第二链cDNA S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成cDNA第二链
常用方法PCR合成法是构建cDNA的一种新策略， 已得到广泛应用。优点：
如果电泳观察到的28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条 带亮度的两倍，说明RNA样品完整，降解不多，如果两条带 的亮度反过来，说明部分28SrRNA已降解；如无清晰条带， 表明样品己严重降解。
mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
插
1）mRNA的完整性及mRNA的富集
通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的 完整性，间接判断mRNA的完整性。
则可将Spel酶切的 基因组DNA中或这一时期的特殊组织。
根 叶 花 花药 茎 穗下节cDNA 第一链的合成、c的基因组DNA或cDarbon公式：
第三章基因文库的构建
目标基因组的大小 载体装载的平均片段＝ 重uestion2装载量 ➢ 所用的内切酶对基因组DNA的完全切割
频率和6Kb
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
TCAGGCT
T
★
Wild-type
(1) (1) DNA polymerase + 4 dNTPs
(2) T4 DNA ligase + ATP
正链DNA的合成
按照体外
DNA重组技术,将待突变的DNA片
G
段插入到M13噬菌体上. 然后制备
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切A，把 所得到的大量基因组DNA片段与载体连接， 然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。 是某个生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体。
SI核酸酶处理 Klenow 酶， 连接酶处理
16
一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失
17
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序
列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的 相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征
由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按 设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在 异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。
(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe; (2) Isolate mutant
频率和6Kb
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
TCAGGCT
T
★
Wild-type
(1) (1) DNA polymerase + 4 dNTPs
(2) T4 DNA ligase + ATP
正链DNA的合成
按照体外
DNA重组技术,将待突变的DNA片
G
段插入到M13噬菌体上. 然后制备
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切A，把 所得到的大量基因组DNA片段与载体连接， 然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。 是某个生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体。
SI核酸酶处理 Klenow 酶， 连接酶处理
16
一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失
17
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序
列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的 相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征
由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按 设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在 异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。
(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe; (2) Isolate mutant
DNA文库的构建(精)
一般覆盖倍数达到是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交 显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上 则可将Spel酶切的 基因组DNA中酶+dCTP
末端转移酶+dGTP
载体和cDNA退火
CH3
CH3
加接头
CH3
接头
CH3
CH3
CH3
cDNA的定向插入
ds-DNA合成 与SalI匹配 接头相连 NotI酶切
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase
NotI primer/adaptor
SalI adapto反复冻溶基因组DNA与cDNA的比较
1）cDNA所包含的遗传信息要远远少于基因组 DNA但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外 大量调控序所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于 低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，NA,制备合适大小的DNA 片断，或提取组织或器官的mRNA并反转录成 cDNA， （2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA， （3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌， （4）阳性重组菌落或噬DNA探针
从原平板克隆 中分离cDNA
步骤： 1）基因组DNA的酶切、固定 2）基因DNA充分饱和杂交，固 定相应的cDNA, 5) 洗脱cDNA并重新转化受体菌。
限制：由于基因组的复杂性，很难究基因的表 基于复性动力学原理的均一化学法
基因组DNA饱和杂交法
理论基础：不同表达水平的基因对应的基因组拷 贝数相对一高；二是去磷酸化好。
BAC文库的构建[精华]
![BAC文库的构建[精华]](https://img.taocdn.com/s3/m/9904d7a768dc5022aaea998fcc22bcd127ff4244.png)
BAC文库构建技巧基因组DNA文库构建实验技巧基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。
通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。
研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。
不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。
比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre 的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。
DNA文库的构建和目的基因ppt课件
含
▪ 从特定组织提取的染色制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因 91)基因组 (Genomic library) ：
▪ 是指将某种生物体基因组转录的全部
mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补
DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发 育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形 成的互补DNA。
因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会 富集某些特异序列。所以起始材料的选择 十分重要。
30
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备
2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方
法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测
1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为5008000bp，大部分mRNA位于1.51
▪ 外源基因：插入到载体内的那个特定
的片段基因。
▪ 目的基因：那些已被或者准备要分离、
改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
2
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。
15
（二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切 酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
16
▪ 从特定组织提取的染色制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因 91)基因组 (Genomic library) ：
▪ 是指将某种生物体基因组转录的全部
mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补
DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发 育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形 成的互补DNA。
因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会 富集某些特异序列。所以起始材料的选择 十分重要。
30
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备
2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方
法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测
1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为5008000bp，大部分mRNA位于1.51
▪ 外源基因：插入到载体内的那个特定
的片段基因。
▪ 目的基因：那些已被或者准备要分离、
改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
2
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。
15
（二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切 酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
16
基因组DNA-文库的构建
/3/10Biblioteka 11①λ噬菌体载体；
工
具
限制性内切酶Sau3A、BamHⅠ； 准
备
琼脂糖凝胶（或蔗糖）；
T4连接酶；
注1：Sau3A与BamHⅠ，是一对同尾酶。 注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
泳分级分 的提取
离
cos L B S
S B R cos T4连接酶
约20kbDN片段 体外包装
重组噬菌体
侵染大肠杆菌大肠杆菌基因⑤ 体 外 包 装 与 转 化
➢5.
小
➢1.DNA
➢2.
➢3.
➢4.
结
如
基
基
为
何
因
因
什
制
组
组
么
文
DNA
DNA
作
要
库
一
构
与
cDNA
个
文
文
建
DNA
库
库
的
的
文
特
作
文
文
库
点
coscosbamh载体dnacos可用载体dna片段弃去中间片段真核基因组dna约310bpsau3a做局部消化被限制酶切开的dna片段琼脂糖凝胶电泳纯化约20kb片段cost4连接酶约20kbdn片段体1/12
BamH Ⅰ位点
cos L
R cos
载体DNA
弃去中间片段
cos L B B R cos
可用载体DNA片段
② 载 体 的 制 备
④③
HMW DNA
真核基因组DNA （约3×109bp）
脉
Sau3 A做局部消化
冲 电
工
具
限制性内切酶Sau3A、BamHⅠ； 准
备
琼脂糖凝胶（或蔗糖）；
T4连接酶；
注1：Sau3A与BamHⅠ，是一对同尾酶。 注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
泳分级分 的提取
离
cos L B S
S B R cos T4连接酶
约20kbDN片段 体外包装
重组噬菌体
侵染大肠杆菌大肠杆菌基因⑤ 体 外 包 装 与 转 化
➢5.
小
➢1.DNA
➢2.
➢3.
➢4.
结
如
基
基
为
何
因
因
什
制
组
组
么
文
DNA
DNA
作
要
库
一
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与
cDNA
个
文
文
建
DNA
库
库
的
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文
特
作
文
文
库
点
coscosbamh载体dnacos可用载体dna片段弃去中间片段真核基因组dna约310bpsau3a做局部消化被限制酶切开的dna片段琼脂糖凝胶电泳纯化约20kb片段cost4连接酶约20kbdn片段体1/12
BamH Ⅰ位点
cos L
R cos
载体DNA
弃去中间片段
cos L B B R cos
可用载体DNA片段
② 载 体 的 制 备
④③
HMW DNA
真核基因组DNA （约3×109bp）
脉
Sau3 A做局部消化
冲 电
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序通常包括以下步骤：
1. DNA提取：从样品（比如细胞、组织、血液等）中提取DNA，并对其进行质量控制。
2. DNA片段化：将DNA样品通过不同的方式（比如随机切割、酶切等）分解成小片段，一般为200-800bp。
3. 处理DNA片段：对DNA片段进行多个步骤的处理，包括末端修复、加上适配器、文库大小筛选等。
4. PCR扩增：使用PCR技术通过适配器扩增DNA片段，以获得足够多的文库。
5. 纯化文库：对PCR扩增产生的文库进行纯化，以去除杂质。
6. 测序：利用高通量测序技术对文库进行测序，生成原始测序数据。
7. 数据处理：对原始测序数据进行序列质控、序列拼接、比对等处理，最终生成基因组序列。
常用的基因组文库构建程序有：TruSeq DNA Sample Preparation Kit（Illumina）、Nextera DNA Flex Library Prep Kit（Illumina）、KAPA HyperPlus Library Preparation Kit （Roche）等。
7.DNA 文库的构建
的提取和 mRNA 分离； 分离； 第一， 第二，第一链 cDNA 合成； 合成； 第二， 第三，第二链 cDNA 合成； 合成； 第三， 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并 第四， 导入宿主中繁殖。 导入宿主中繁殖。代表性和随机性 二、代表性和随机性
N=ln（ N=ln（1-p）/ln（1片段的大小和基 因组 DNA 大小的比值
载体age）、粘粒载体 噬菌体（ phage）、 ）、粘粒载体 （cosmid）、细菌人工染色体（Bacterial cosmid）、细菌人工染色体（ ）、细菌人工染色体 Artificial Chromosomes, BAC）、酵母人工染 BAC）、 ）、酵母人工染 色体 YAC（Yeast Artificial Chromosomes, YAC（ YACs）、 YACs）、 P1 （Bacteriophage P1）和 PAC 。 P1）代表性和随机性 二、代表性和随机性
代表性是指中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可 片段complementary DNA , cDNA）。 cDNA cDNA）。 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内 的 mRNA 经体外反转胞内转录水平上的基因的群体， 时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包 括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上 括该生物的全部基因， 存在很大差异。① 载体的制备； 载体的制备； ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取； DNA）的提取； ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分 离（PFGE size selection）； selection）； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主 细胞； 细胞； ⑤ 重组克隆的挑取和保存。 重组克隆的挑取和保存。
N=ln（ N=ln（1-p）/ln（1片段的大小和基 因组 DNA 大小的比值
载体age）、粘粒载体 噬菌体（ phage）、 ）、粘粒载体 （cosmid）、细菌人工染色体（Bacterial cosmid）、细菌人工染色体（ ）、细菌人工染色体 Artificial Chromosomes, BAC）、酵母人工染 BAC）、 ）、酵母人工染 色体 YAC（Yeast Artificial Chromosomes, YAC（ YACs）、 YACs）、 P1 （Bacteriophage P1）和 PAC 。 P1）代表性和随机性 二、代表性和随机性
代表性是指中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可 片段complementary DNA , cDNA）。 cDNA cDNA）。 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内 的 mRNA 经体外反转胞内转录水平上的基因的群体， 时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包 括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上 括该生物的全部基因， 存在很大差异。① 载体的制备； 载体的制备； ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取； DNA）的提取； ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分 离（PFGE size selection）； selection）； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主 细胞； 细胞； ⑤ 重组克隆的挑取和保存。 重组克隆的挑取和保存。
cDNA和基因组文库DNA的构建
T4多核苷酸激酶（3000单位/ml） 1μl
室温温育15分钟。 2 . 7.测定从上面步骤4取出的3μl反应物中放射性活度，测定1μl第二链合 成产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
• 2 . 8.用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到
已掺入到DNA第一链种的dNTP的量。 [第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(6某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体。
基因组：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息， 用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上 的定位，基达 的基因序列信息，用于研究特定细胞中基：反转录酶催化合成cDNA第一链
阶段2：cDNA第二链的合成
阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6：cDNA (互补DNA）
成的下一步骤。
3：cDNA的甲基化
• 3 . 1.在cDNA样品中加入以下试剂： 2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl 5 mol/L NaCl 2μl 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl 20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1μl 加H2O至 96μl 3 . 2.取出两小份样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为1号和2号， 置于冰上。
4.4.加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，以终止反应。
• 4.5.用酚：氯仿抽提，再通过Sephadex G-50离心柱层析，除去未
掺入的dNTP。
4.6.在柱流出液中加入0.1倍体积的3 mol/L 乙酸钠（pH5.2）和二 倍体积的乙醇，样品于4℃至少放置15 min。
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? 2．高质量大分子量基因组 DNA 的提取践表明，提取的 基因组 DNA 分子量越大，所得到到的 28SrRNA条带的亮度约为 18SrRNA条 带亮度的两倍，说明 RNA样品完整，降解不多，如果两条带 的亮度反过来，说明部分 28SrRNA已降解；如无清晰条带， 表明样品己严重降解。
mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生 完整的cDNA)
体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因。外源DNA片断、载体、宿主
? 构建基因的基本程序：（1）提取研究对象基因组 DNA,制备合适大小的 DNA 片断，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成 cDNA，
2）表达量的差异决定构建 cDNA要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总 mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300 个拷贝，占总 mRNA的49% 低丰度mRNA ：1-15个拷贝，占总 m数目，
Clark和Carbon公式：
N=ln（1-p）段的大小和基因组 DNA 大小
的比值
例：哺乳动物基因组：3×109 Kb p：=99%
一般覆盖倍数达到是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个 YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交
显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上
则可将Spel酶切的 基因组DNA中或这一时期的特殊组织。
根 叶 花 花药 茎 穗下节cDNA 第一链的合成、c的基因组DNA或cDNA片段取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
插
1）mRNA的完整性及mRNA的富集
通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的 完整性，间接判断mRNA的完整性。
（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA，
（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌，
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因组DNA基因cDNA
基因组与cDNA最大的区别在于cDNA具 有时空特异均插入片段大小20kb
f= 20Kb/3×109 Kb
N=ln（1-p）/ln（1-f） =690构建程序包含 5 个部分：
? ① 载体的制备； ? ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight
DNA, HMW DNA ）的提取； ? ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（ PFGE size
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱselection）； ? ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ? ⑤ 重组克隆的挑取高；二是去磷酸化好。
? 寻找最适的载体与基因组之间的 比例。 ? 首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价
高且质量稳定的包装蛋白， ? 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入
片段的 DNA合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链 第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环 合成第二链 cDNA S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成 cDNA第二链
常用方法
mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生 完整的cDNA)
体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因。外源DNA片断、载体、宿主
? 构建基因的基本程序：（1）提取研究对象基因组 DNA,制备合适大小的 DNA 片断，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成 cDNA，
2）表达量的差异决定构建 cDNA要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总 mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300 个拷贝，占总 mRNA的49% 低丰度mRNA ：1-15个拷贝，占总 m数目，
Clark和Carbon公式：
N=ln（1-p）段的大小和基因组 DNA 大小
的比值
例：哺乳动物基因组：3×109 Kb p：=99%
一般覆盖倍数达到是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个 YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交
显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上
则可将Spel酶切的 基因组DNA中或这一时期的特殊组织。
根 叶 花 花药 茎 穗下节cDNA 第一链的合成、c的基因组DNA或cDNA片段取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
插
1）mRNA的完整性及mRNA的富集
通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的 完整性，间接判断mRNA的完整性。
（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA，
（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌，
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因组DNA基因cDNA
基因组与cDNA最大的区别在于cDNA具 有时空特异均插入片段大小20kb
f= 20Kb/3×109 Kb
N=ln（1-p）/ln（1-f） =690构建程序包含 5 个部分：
? ① 载体的制备； ? ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight
DNA, HMW DNA ）的提取； ? ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（ PFGE size
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱselection）； ? ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ? ⑤ 重组克隆的挑取高；二是去磷酸化好。
? 寻找最适的载体与基因组之间的 比例。 ? 首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价
高且质量稳定的包装蛋白， ? 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入
片段的 DNA合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链 第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环 合成第二链 cDNA S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成 cDNA第二链
常用方法