DNA文库的构建精
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平均插入片段大小20kb
f= 20Kb/3×109 Kb
N=ln（1-p）/ln（1-f） =690773.2
（三）、基因组 DNA文库的构建流程
基因组 DNA 文库的构建程序包含 5 个部分：
? ① 载体的制备； ? ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight
（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA，
（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌，
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。
基因组DNA文库
基因文库
cDNA文库
基因组文库与cDNA文库最大的区别在于cDNA文库具 有时空特异性。
基因文库的应用： 构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因
第八章 DNA文库的构建
教学目的
掌握：基因组文库构建的基本原理和步骤、 cDNA文库构建的基本原理和操作技术；
熟悉：cDNA 第一链的合成、cDNA 第二链的合 成；
一、基因文库
某一生物部分基因的集合叫 该生物的亚基因组文库。
某一生物全部基因的集合 叫该生物的基因文库。
基因文库（gene library)： 某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载
二、基因组 DNA文库的构建
（一）基因组DNA文库的类型
质粒文库， （﹤10kb) 噬菌体文库，（0-23kb ) 粘粒文库， (~45kb) 人工染色体文库， (又称大片段基因组 DNA文库，
100kb —1Mb）
（二）文库的代表性和随机性
文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段可 以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任 何一段基因组DNA。
体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。
外源DNA片断、载体、宿主
? 构建基因文库的基本程序：
（1）提取研究对象基因组 DNA,制备合适大小的 DNA 片断，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成 cDNA，
则可将Spel酶切的 基因组DNA中的 8.3kb片断回收，用 于构建DNA文库。
三、cDNA文库的构建
1、cDNA文库的特征 1）基因表达的时空性决定 cDNA文库的取材，
构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的 发育时期或这一时期的特殊组织。
根 叶 花 花药 茎 穗下节 幼胚 GAmyb
一般覆Baidu Nhomakorabea倍数达到4-6倍覆盖率。
（四）、亚基因组文库
指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个 YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交
显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上
2）表达量的差异决定构建 cDNA文库要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总 mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300 个拷贝，占总 mRNA的49% 低丰度mRNA ：1-15个拷贝，占总 mRNA的29%
2、均一化cDNA文库
通过一定的策略和方法，将构建好的独立 cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度 基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等 丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致， 这种cDNA文库称均一化cDNA文库。
? 2．高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量
要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库 最终平均插入片段长度的 3～5 倍。实践表明，提取的 基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片 段越大。
3．文库的连接转化或包装侵染
DNA, HMW DNA ）的提取； ? ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（ PFGE size
selection）； ? ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ? ⑤ 重组克隆的挑取和保存。
? 1．基因组 DNA 文库的载体制备 载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。
? 寻找最适的载体与基因组之间的 比例。 ? 首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价
高且质量稳定的包装蛋白， ? 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入
片段的 DNA 的转化效率也有所不同。
? 4．文库的质量检测
克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度 越高，文库质量就越好。
一个完整基因组文库应包含克隆的数目，
Clark和Carbon公式：
N=ln（1-p）/ln（1-f） N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数 p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率 f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组 DNA 大小
的比值
例：哺乳动物基因组：3×109 Kb p：=99%
如果电泳观察到的 28SrRNA条带的亮度约为 18SrRNA条 带亮度的两倍，说明 RNA样品完整，降解不多，如果两条带 的亮度反过来，说明部分 28SrRNA已降解；如无清晰条带， 表明样品己严重降解。
mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生 完整的cDNA)
? 3、cDNA文库的构建
第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
插
1）mRNA的完整性及mRNA的富集
通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的 完整性，间接判断mRNA的完整性。
3)第二链cDNA的合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链 第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环 合成第二链 cDNA S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成 cDNA第二链
常用方法
f= 20Kb/3×109 Kb
N=ln（1-p）/ln（1-f） =690773.2
（三）、基因组 DNA文库的构建流程
基因组 DNA 文库的构建程序包含 5 个部分：
? ① 载体的制备； ? ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight
（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA，
（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌，
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。
基因组DNA文库
基因文库
cDNA文库
基因组文库与cDNA文库最大的区别在于cDNA文库具 有时空特异性。
基因文库的应用： 构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因
第八章 DNA文库的构建
教学目的
掌握：基因组文库构建的基本原理和步骤、 cDNA文库构建的基本原理和操作技术；
熟悉：cDNA 第一链的合成、cDNA 第二链的合 成；
一、基因文库
某一生物部分基因的集合叫 该生物的亚基因组文库。
某一生物全部基因的集合 叫该生物的基因文库。
基因文库（gene library)： 某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载
二、基因组 DNA文库的构建
（一）基因组DNA文库的类型
质粒文库， （﹤10kb) 噬菌体文库，（0-23kb ) 粘粒文库， (~45kb) 人工染色体文库， (又称大片段基因组 DNA文库，
100kb —1Mb）
（二）文库的代表性和随机性
文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段可 以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任 何一段基因组DNA。
体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。
外源DNA片断、载体、宿主
? 构建基因文库的基本程序：
（1）提取研究对象基因组 DNA,制备合适大小的 DNA 片断，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成 cDNA，
则可将Spel酶切的 基因组DNA中的 8.3kb片断回收，用 于构建DNA文库。
三、cDNA文库的构建
1、cDNA文库的特征 1）基因表达的时空性决定 cDNA文库的取材，
构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的 发育时期或这一时期的特殊组织。
根 叶 花 花药 茎 穗下节 幼胚 GAmyb
一般覆Baidu Nhomakorabea倍数达到4-6倍覆盖率。
（四）、亚基因组文库
指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个 YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交
显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上
2）表达量的差异决定构建 cDNA文库要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总 mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300 个拷贝，占总 mRNA的49% 低丰度mRNA ：1-15个拷贝，占总 mRNA的29%
2、均一化cDNA文库
通过一定的策略和方法，将构建好的独立 cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度 基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等 丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致， 这种cDNA文库称均一化cDNA文库。
? 2．高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量
要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库 最终平均插入片段长度的 3～5 倍。实践表明，提取的 基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片 段越大。
3．文库的连接转化或包装侵染
DNA, HMW DNA ）的提取； ? ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（ PFGE size
selection）； ? ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ? ⑤ 重组克隆的挑取和保存。
? 1．基因组 DNA 文库的载体制备 载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。
? 寻找最适的载体与基因组之间的 比例。 ? 首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价
高且质量稳定的包装蛋白， ? 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入
片段的 DNA 的转化效率也有所不同。
? 4．文库的质量检测
克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度 越高，文库质量就越好。
一个完整基因组文库应包含克隆的数目，
Clark和Carbon公式：
N=ln（1-p）/ln（1-f） N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数 p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率 f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组 DNA 大小
的比值
例：哺乳动物基因组：3×109 Kb p：=99%
如果电泳观察到的 28SrRNA条带的亮度约为 18SrRNA条 带亮度的两倍，说明 RNA样品完整，降解不多，如果两条带 的亮度反过来，说明部分 28SrRNA已降解；如无清晰条带， 表明样品己严重降解。
mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生 完整的cDNA)
? 3、cDNA文库的构建
第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
插
1）mRNA的完整性及mRNA的富集
通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的 完整性，间接判断mRNA的完整性。
3)第二链cDNA的合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链 第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环 合成第二链 cDNA S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成 cDNA第二链
常用方法