目的基因的克隆与基因文库的构建

5 RNaseH AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTT p OH 3’ DNApol dNTPs 5’ AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ S1 5’ 3’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH AAAAAAAAAAAAAA 3’ T4-DNA ligase p 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’
或确定其表达调控机制和生物学功能
分离克隆目的基因 ( 前 提 )
或建立高效表达系统，构建具有经济 价值的基因工程菌（细胞）
或将目的基因在体外进行必要的结构 功能修饰，然后输回细胞内改良生物 体的遗传性状，包括人体基因治疗
基因的克隆战略
• 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物
体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基
鸟枪法克隆目的基因的基本策略
1.染色体DNA的片段化
超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的 基因断开，大小不可控 部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
2.与载体连接 3.转化受体细胞 4.筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
AAAAAAAAAAAAAA
逆转录酶
dNTP s
TTTTTTTTTTTTTT p OH 3’
5’
AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTT p OH 3’
cDNA第一
链
5’
cDNA第二链的合成 自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失
’ G 5‘pppG 5 NaOH
5’
cDNA第二链的合成 引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
’ G 5‘pppG 3‘ 5
HO ’ G 5‘pppG
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCT P NaO H TTTTTp 5’ AAAAACCCCCCCOH TTTTT p 5’ 3’
3‘ 3‘
5
HOCCCCCCC
HOCCCCCCC
退火
TTTTTp 5’ Kleno dNTP
3‘ 5‘ HOCCCCCCC 3p ‘ GGGGGGG 5‘ HOCCCCCCC
w
s
TTTTTp 5’ AAAAAOH
cDNA法分离目的基因的基本程序
完备分离程序
提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借
mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆
特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如 血红蛋白基因等
cDNA法克隆目的基因的局限性
并非所有的mRNA分子都具有polyA结构
细菌或原核生物的mRNA半衰期很短
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯 化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因
助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛 选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆， 如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等
cDNA法分离目的基因的基本程序
特异分离程序
提 取 细 胞 总 mRNA， 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 ， 回 收 目 标
重组子中目的重组子的出现频率
鸟枪法操作的改进
2. 在连接前将DNA片段进行分级分离
例如，已知某目的基因位于1.8 kb的 SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开
，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相
当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块， 从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载 体进行拼接
2.0 kb 1.8 kb
1.6 kb
一 鸟枪法 二 cDNA法 三 PCR法 四 化学合成法
五 基因文库的构建
cDNA法克隆目的基因的基本策略
cDNA第一链的合成
mRN
’ G 5‘pppG 5 ’ G 5‘pppG 5 ’ G 5‘pppG 5 A AAAAAAAAAAAAAA
OH 3’
引物
退火
OH
AAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTT p OH 3’ 煮沸 5’
TTTTTTTTTTTTTTp
3’ Klenow dNTPs 5’ TTTTTTTTTTTTTTp AAAAAAAAAAAAAA 5’ S1
OH 3’
TTTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAAAA
cDNA第二链的合成 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 ’ G 5‘pppG
一 鸟枪法 二 cDNA法 三 PCR法 四 化学合成法
五 基因文库的构建
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称 为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的 体外DNA聚合程序 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩 增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学 合成聚合反应必需的双引物
目的基因
5 ‘ 5 5
5 ‘ 5 ‘ 5
5
‘ 5
变性
加热
‘
聚合
底物
‘ 5 ‘ 5
‘
5 ‘
5
退火
引物
5 ‘
‘ 5
3 1
‘ 5
‘ 5 ‘ 5 ‘
退火
引物
‘ 5
5
‘
聚合
底物
5 ‘
‘
‘
5
5 ‘ 5 ‘ 5 ‘ 5 ‘
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量wenku.baidu.com大，需要了解目的基因的背景知识
不能获得最小长度的目的基因
不能除去真核生物目的基因的内含子结构
鸟枪法操作的改进
1. 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高
因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；
• 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合
成目的基因，然后将之克隆表达。
一 鸟枪法 二 cDNA法 三 PCR法 四 化学合成法
五 基因文库的构建
鸟枪法克隆目的基因的基本策略
随机克隆供体细胞的全 基因组DNA片段，然后通 过快速有效的筛选程序从众 多克隆中分离出含有目的基 因的目的重组子，进而获得 目的基因。鸟枪法适用于原 核细菌目的基因的克隆分离 。