4株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定

16h 的待筛选细菌, 在上述平板上点种, 48h 内观察划
线区或点种区周围是否出现明显的抑菌透明区或覆
盖区; 或将小圆形滤纸片贴于涂布了指示菌的 2216E
固体培养基上, 取 0.01ml 待测菌滴于滤纸片上, 48h
内观察划线区或点种区周围是否出现明显的抑菌透
明区或覆盖区。
1.3 拮抗物质的反应动力学
分离筛选了几株具有抑制病原菌作用的拮抗菌, 并 对其进行了分类学鉴定及安全性试验, 以期为功能 益生菌的应用、高效免疫活性物质的开发以及对虾微 生态制剂的研发奠定重要基础。
1 材料与方法
1.1 细菌的分离与培养 从 健 康 的 不 同 生 长 阶 段 的 中 国 对 虾 (Penaeus
chinensis)及凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道 内, 分离到 96 株对虾体内细菌作为体外拮抗试验的 待测菌株。指示菌株为本实验室分离和鉴定的对虾病 原菌株, 包括鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌 (V. harveyi)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus), 以及 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphyloccocus aureus) 和 微 球 菌 (Micrococcus cohn)。待测菌株、指示菌株均用 2216E 海水琼脂培养基常规培养, 并用含 15%甘油的 2216E 液体培养基保存于−80℃。 1.2 拮抗菌的筛选
养(在不同温度下同一株菌的起始浓度相同), 24h 后
测定其在 600nm 波长下的吸光值。
1.6.2 不 同 盐 度 下 待 测 菌 株 的 生 长
将
LV060806、LV060808、LV060810、LV060815 分别在
盐度为 0、5、10、20、30、40、50 和 60 的 2216E 液
大连宝生物有限公司进行测序。在 GenBank 数据库中
进行相似序列比对, 并构建进化树分析菌种同源性。
1.8 统计分析
采用 SPSS11.5 软件对试验数据进行单因素方差
分析(One-way ANOVE)。若有显著差异, 再做 LSD 多
重比较。显著水平采用 0.05, 若 P<0.05,Biblioteka Baidu则表示有显
11.0 的 2216E 液体培养基培养(在不同 pH 值下同一株
菌的起始浓度相同), 24h 后测定其在 600nm 波长下的
吸光值。
1.7 益生菌的鉴定
1.7.1 生化指标 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第
九版)( Holt et al, 1994), 将筛选到的有益菌进行鉴
定。鉴定项目包括形态观察、革兰氏染色、各项生理
20 世纪, 抗生素的发现促进了人类医学的巨大进 步, 自此抗生素成为抗菌治病的首选药物。大量的抗 生素被广泛应用, 使动物养殖业尤其是水产养殖业不 断受益。在药物和技术不断革新的基础上, 高密度、 集约化、规模化、工厂化的养殖模式日趋成熟, 水产 动物养殖业一度发展迅速(Grave et al, 1995)。但随之 而来的病害大量传播、抗生素肆意滥用、养殖环境恶 化、病原耐药性增强、养殖动物药物残留等问题也日 益为人们所关注(Sambasivam et al, 2003)。开拓和发展 符合环境友好和可持续发展战略的病害防治技术和产 品已经成为水产养殖业的迫切需求(Pauly et al, 2002)。
提要 采用体外拮抗试验的方法, 先从不同生长阶段的对虾肠道中分离的 96 株细菌中筛选出 4 株 对病原菌(鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌)有拮抗作用的细菌; 进一步通过固体扩散法和液体混合 法确定 LV060806、LV060808 的产物对鳗弧菌有明显抑制作用, LV060806、LV060815 的产物对副溶 血弧菌有明显抑制作用, LV060810、LV060815 的产物对哈维氏弧菌有明显抑制作用。溶血试验证实 这些菌株不产生溶血素, 不具有潜在的致病性; 动物安全性实验证实菌株浓度在 106 cfu/ml 以下对实 验对虾无明显的毒害作用。随后测定了其 16S rRNA 基因序列, 分析了相关细菌相应序列的同源性, 构建了系统发生树, 结合菌株表型特征和生理生化特性最终鉴定结果为：LV060806、LV060808 为 Vibrio natriegens; LV060810、LV060815 为 V. alginolyticus。 关键词 益生菌, 筛选, 鉴定, 抑制作用, 安全性实验 中图分类号 S963.73
的产生(Riquelme et al, 1997)。
1.5 安全性试验
设待测菌株、阳性对照菌和阴性对照实验组, 每
组设两个平行, 每个平行随机选取暂养 7 天的健康凡
纳滨对虾 50 尾; 每尾注射待测菌株、阳性对照菌和
阴性对照 50µl, 每天记录其死亡情况。阳性对照为本
实验室分离的对虾病原菌——鳗弧菌, 阴性对照为对
生化指标等。
1.7.2 16S rRNA 鉴定 扩增 16S rRNA 序列的正
向引物为：5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′;
反向引物为：5′-ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-
3′。对益生菌进行 16S rRNA 的 PCR 扩增。将得到的
PCR 产物切胶, 用胶回收试剂盒回收(博日公司), 交由
0、0.5、1、3、6h 内均无太大增长, 但到了 6h 后阳 性对照迅速升高, 而阴性对照与拮抗菌均保留原有 无明显变化的状态, 这说明了 LV060806、LV060808 的 产 物 对 鳗 弧 菌 有 明 显 抑 制 作 用 , LV060806 、 LV060815 的 产 物 对 副 溶 血 弧 菌 有 明 显 抑 制 作 用 , LV060810、LV060815 的产物对哈维氏弧菌有明显抑 制作用。 2.3 拮抗菌的安全性试验
抑菌效果/抑菌圈直径(mm)
LV060806 覆盖/9 抑菌/2 — 抑菌/5 覆盖/7
LV060808 抑菌/6 — — 抑菌/6 覆盖/5
LV060810 覆盖/8 抑菌/3 抑菌/3 抑菌/2 —
LV060815 —
抑菌/3 抑菌/5
— —
2.2 拮抗物质的反应动力学 由表 2 可以看出阴性对照、阳性对照和待测菌在
376
海洋与湖沼
39 卷
指示菌
鳗弧菌 V. anguillarum 哈维氏弧菌 V. harveyi 副溶血弧菌 V. parahaemolyticus 金黄色葡萄球菌 S. aureus 微球菌 M. cohn
表 1 待测菌株对指示菌的抑菌效果 Tab.1 The inhibitory of strains to indicator bacteria
清作为阴性对照。置于 28℃作用, 分别于 0、0.5、1、
3、6、24h, 取 1ml 测定其在 600nm 波长下的吸光值。
1.4 溶血素的产生
将 2216E 液体培养基过夜培养的待测菌株点种
于血平板(购自青岛大学医学院附属医院)上, 28℃培
养 24h, 根据菌落周围透明圈的形成, 来判断溶血素
1.3.2 拮抗物质的反应动力学
将病原弧菌于
2216E 斜面上活化 18h, 用无菌海水洗下, 菌悬液
0.1ml 加入拮抗菌 LV060806、LV060808、LV060810、
LV060815 的 CFS (0.9ml)中, 以病原菌+含 0.1%蛋白
胨的除菌海水作为阳性对照, 以除菌海水+拮抗菌上
体培养基培养(在不同盐度下同一株菌的起始浓度相
同), 24h 后测定其在 600nm 波长下的吸光值。
1.6.3 不 同 pH 值 下 待 测 菌 株 的 生 长
将
LV060806、LV060808、LV060810、LV060815 分别在
pH 值为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、
① 通讯作者: 宋晓玲, 研究员, E-mail：songxl@ysfri.ac.cn 收稿日期: 2007-03-25, 收修改稿日期: 2007-05-19
4期
李海兵等: 4 株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定
375
在 2216E 液体培养基中培养过夜, 取 0.1ml 涂布于新
鲜的 2216E 固体培养基中, 然后用接种环刮取活化
注射待测菌, 生理盐水和阳性对照后, 每天记录 死亡数, 计算其累计死亡率, 用 SPSS11.5 软件对试 验数据进行统计分析, 结果如表 3、表 4 所示： LV060806、LV060808、LV060810、LV060815 的 104
cfu/ml 和 106 cfu/ml 注射组与生理盐水注射组均无显 著性差异(P>0.05), 虽有些死亡现象, 但比较少, 为 非病原引起; 而阳性对照鳗弧菌的 104 cfu/ml 和 106 cfu/ml 注射组均引起对虾大量死亡, 显著高于其他注 射 组 (P<0.05) 。 由 此 可 知 LV060806 、 LV060808 、 LV060810、LV060815 在 106 cfu/ml 浓度以下对对虾 无毒害作用。 2.4 益生菌的生长特性
虾生理盐水。每株菌用 106 cfu/ml 和 104 cfu/ml 两个
浓度进行肌肉注射。
1.6 益生菌的生长特性
1.6.1 不 同 温 度 下 待 测 菌 株 的 生 长
将
LV060806、LV060808、LV060810、LV060815 分别在
4、10、20、30、37 和 42℃中以 2216E 液体培养基培
益生菌(probiotic bacteria), 特别是来源于对虾内 外环境的益生菌, 由于其在改善养殖水环境、抑制病 原微生物的生长、改善对虾健康状况、促进对虾生长、 提高饲料利用率等方面的突出作用, 引起越来越多 的关注(Gatesoupe, 1999)。对虾益生菌的筛选、应用 和作用机制的研究, 成为海洋微生物研究的重点(李 继 秋 等 , 2006; 申 玉 春 等 , 2007; Balc á zar et al, 2007)。作者从健康的中国对虾及凡纳滨对虾肠道内
参照文献(Smith et al, 1993), 将活化后的指示菌
* 国家高技术研究发展计划(863 计划)项目, 2006AA100313 号; 国家重点基础研究发展规划(973)项目, 2006CB101806 号。 李海兵, 硕士, E-mail：lihaibing8@yahoo.com.cn、lihaibing8@126.com
1.3.1 拮抗菌去细胞上清液(CFS)的制备 拮抗菌
LV060806、LV060808、LV060810、LV060815 于 2216E
液体培养基 28℃培养 16—18h, 4℃ 5000g 离心 10min,
去细胞沉淀, 经 0.22µm 滤膜过滤, 所得液体为去细胞
上清液(CFS)(Benkerroum et al, 1993), 置于 4℃备用。
著差异。
2 结果
2.1 拮抗菌的筛选 采用十字交叉法, 从分离自健康中国对虾及凡
纳滨对虾肠道的 96 株海洋细菌中筛选到 4 株对病原 弧菌具有拮抗作用的候选菌, 在血平板上未观察到 溶血现象, 表明这些菌株不产生溶血素, 不具有潜在 的致病性。采用琼脂扩散法对这 4 株菌进行体外拮抗 试 验 , 结 果 表 明 , 这 4 株 海 洋 细 菌 LV060806 、 LV060808、LV060810、LV060815 对测试的革兰氏阴 性细菌和革兰氏阳性细菌有一定的拮抗作用(表 1), 其中菌株 LV060806 对哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌 有抑制作用, 对鳗弧菌、微球菌有覆盖作用; LV060808 对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌有抑制作用, 对 微球菌有覆盖作用; LV060810 对鳗弧菌有覆盖作用, 对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌有抑制 作用; LV060815 对哈维氏弧菌、副溶血弧菌有抑制作 用。
第 39 卷 第 4 期 2008 年 7 月
海洋与湖沼
OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA
Vol.39, No.4 July, 2008
4 株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定*
李海兵1, 2 宋晓玲1① 韦 嵩1, 2 李 赟2 兰 萍1
(1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071; 2. 中国海洋大学生命科学与技术学部 青岛 266003)