免疫组化染色操作步骤

免疫组织化学染色原理和操作步骤

一、免疫组织化学原理

免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。

PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。

生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。

图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）

SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用

生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。

在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧

化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行

显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相

似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤，

同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免

疫绥化染色技术。

图2. SP法原理示意图

二、实验准备：

1. 标本准备

①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理

②冰冻组织切片：由病理室常规处理

③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到

60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h。

2.试剂准备

①抗体选择

单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后

将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体

的缺点，但是可能出现非特异性杂交。因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体，抗体说明书上必须有IHC测试结果。如果该分子文献报道较多，可选择文献上常用的经典抗体。

②二抗试剂盒

目前本实验室所用二抗试剂盒为Life Technologies Histostain-Plus Kit (HRP, Broad Spectrum)，货号85-9043，一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。

③DAB试剂盒

目前本实验室所用为加强型DAB显色试剂盒，货号DAB-2032。

④其他试剂

二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES胶3.抗体特异性验证

所有免疫组化抗体均须Western blot验证抗体特异性，并需免疫荧光实验验证抗原定位。

4. 耗材准备

免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片

5. 溶液配制

①磷酸盐缓冲液（PBS）

10×PBS母液配制

NaCl 72 g

Na2HPO4·12H2O 37.3 g

KH2PO4 4.3g

加蒸馏水至1000 ml，充分混匀贮存。

使用时用蒸馏水10倍稀释，调整pH值至7.3—7.4。

②柠檬酸抗原修复液

抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：

称取柠檬酸10.5 g，溶于500 ml蒸馏水；称取Na2HPO4·12H2O 57.3g，溶于800 ml蒸馏水。分别量取358 ml柠檬酸溶液和642 ml Na2HPO4溶

液，充分混匀后调整pH值至6.0，即得2×母液，贮存备用。

③1%盐酸酒精

浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合，充分混匀。

三、免疫组化操作步骤

1. 组织片脱蜡水化

①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15 min。

②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5 min。

③依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸，每缸5 min。

④依次放入90％乙醇、85％乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2 min，取出。

⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。

2. 抗原修复

将切片浸入1×柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2 min，然后停止加热让切片自然冷却。

注意：抗原修复过度或不足，均会影响最终染色结果。切片骤冷可致脱片，必须自然冷却！

3.封闭内源性过氧化氢酶

①放入3% H2O2溶液的玻璃缸中，浸泡15 min。

②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。

③放入PBS缓冲液的玻璃缸中，浸泡5 min。

4. 抗体杂交

①甩去PBS余液，将组织片平辅在湿盒中，加正常山羊血清1滴

20 µl（试剂盒中的A液，根据组织大小调整用量），28℃放置20 min，甩干。

②加稀释好的一抗1滴（20~50 µl，根据组织块大小进行调整），置于湿盒4℃过夜。

③置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲