水通道蛋白的研究

Байду номын сангаас(四)rt—pcr
蛋白质的mrna丰度很小，比且容易降解。rt—pcr可以成千上万倍地对mrna进行扩展，通过电泳扩展产物，可以检测到aqps的mrna。
六、aqps在法医学上的研究
aqps的发现比较晚，研究现主要集中在临床、生物学和植物学领域，本文作者还没有检索到相关法医学方面的研究。本作者认为只少在以下几个方面值得法医工作者进行探讨研究。
四、aqps的组织分布
水通道蛋白在人类妊娠早期就开始表达，胎儿12周龄时就可以检测到，36周龄时aqps表达明显增加，出生时其红细胞和肾小管中的aqps表达量就几乎与成人相等，而在小鼠的表达需出生后1～2个月才趋于高峰并持续。
aqps在大鼠中的分布研究得比较多，也比较清楚，在人体组织中的研究比较少，但近年来增加较快。
五、aqps的检测方法及发展前景
aqps是随着生物学和化学技术的发展而发现的。最早a—gre等利用电泳技术对红细胞rh抗原蛋白进行分离、纯化时发现了aqpa，并测定了它的分子量，[ 又利用标记重组、冰冻蚀刻和形态测量术等方法证实了它们的核酸序列和空间结构，并用分子克隆技术对aqp1进行了cdna克隆o[4,6,1oi现阶段对aqps的研究方法主要有：
[6]preston gm ，agre p．isolation of the cdna for erythrocyte integral
membrane protein of 28 kilodattons：member of an ancient channel fami—
ly．proe natl acad sci usa，1991，88(24)：11110～11114
(一)基础研究
aqps在人体组织内广泛存在，人体机能的运转(不论是正常生理还是异常病理)均与水有关，说明aqps或多或少都在发挥积极作用。在法医学研究中，经常遇到与水转运有关的病理问题，如各种死因导致的肺水肿、脑水肿、皮肤皮革样化以及角膜浑浊等，特别是一些不明原因的猝死。通过对aqps的研究，
对阐明这些疑难疾病、现象的机理有所帮助。
human red cells biochem biophysacta，1970，211：104～ 106
[3]solomon ak．water channels across the red blood cell and other biological
membrances．methods enzymol，173：192～ 222
(一)aqf)0
aqpo是一种古老的内在蛋白，又称mip。有水通道作用．同时对其它离子及小分子也有通过作用，主要在晶状体内皮细胞表达。【19
(二)aqp1
aqp]是第一个最先发现并被鉴定的水通道蛋白。 r它在组织中的分布极其广泛，如血液循环系统中的心肌肉、毛细血管、淋巴管内皮细胞和红细胞等，[ 。 神经系统中的脑脉络丛上皮细胞，呼吸系统中的肺泡i型细胞、支气管粘膜下腺细胞和气管腔上皮，l2 消化系统中的胰腺、胆囊、肝管、胆管和结肠隐窝上皮细胞等，泌尿系统中的肾近曲小管及髓袢降支细段上皮细胞，以及唾液腺、泪腺和汗腺等腺体上皮细胞和视网膜_2 一等均有水通道蛋白aqp1的表达。
(二)原位杂交
该方法与免疫组化方法类似。免疫组化检{昊4蛋白质，原位杂交检测它的dna。现大鼠、兔和人的水通道蛋白核苷酸序列已经全部测定，可在世界上各大基因库中查到相关的基因序列，合成核酸探针，进行原位杂交，从而在核酸水平上测定aqps的表达和存在。
(三)免疫电镜
可以很好地定位aqps在细胞结构中的存在，[ 特别是在细胞浆内膜性器官上的定位，弥补了免疫组化的不足。该法对组织块的条件要求很高，组织块要新鲜，用锇酸固定，环氧树脂包埋，并且进行超薄切片，需专业人员进行操作。
1 j1988年agre等 在纯化人的红细胞膜上rh蛋白时，偶然发现了一种新的膜蛋白，分子量约28 kd左右，属于一种内在膜整合蛋白(channel forming integral mem—brane protein，简称chip28)。1991年chip28的cdna 分子克隆成功，并成功地将chip28体外转录合成的cdna转染非洲爪蟾的卵母细胞，结果发现转染后的卵母细胞在低渗透溶液中很快膨胀，并最终破裂。[ ， 又将chip28嵌入脂质体进行实验，能明显加快水的转运_8]，从而证实chip28对水有特殊通透性：1993年arge将这种内在膜整合蛋白正式称为水通道蛋白(aquaporins，简称aqps)。[ ]目前已发现9种水通道蛋白亚型，按顺序分别命名为aqpa～aqp9，它们形成一个aqps家族，考虑到以前发现的一种膜内在蛋白，又称mip(major intrinsic protein，简称mip)，也对水有一定的通过作用，有些学者把它也归入水通道蛋白家族中，取名为aqpo：
参考文献
[1]fettiplace r，haydonda．water permeability oflipidmembrane．physi—
ol rev．1980，60：510～ 550
[2]macey r i，farm er r e l．inhibition of water and solute permeability in
(二)应用研究
在法医学实践中，对于一些具体问题的正确鉴定还存在很大的模糊性和不精确性。如生前溺死与死后抛尸的鉴定、死亡时间的推定等，现在都是凭大体病理解剖和经验进行推断，科学性较差。如果借助于aqps的理论和技术成果进行相关研究，寻找它们之间的差别，建立相应的数据库，也许在一些问题的解决方面会有所突破。
tlon，and partial characterization of a novel mr 28，000 integral mem—
brane protein from erythrocytes and renal tubules．j biol chem ，1988，
263：15634～15642
(一)免疫组化
aqp1～aqp5的单克隆抗体已经研究成功，并且商品化，可以用于定位、半定量研究aqps蛋白在组织中的表达o[2t-23~该方法比较成熟，简单易行，研究用组织块条件比较宽松，可用于常规固定的新鲜组织。该方法可以比较好地检测到细胞膜上的aqps，但对细胞内膜性器官上的aqps定位不理想。
[4]agre p，gregory m p，barbara l，et a1．aquaporin chip：the archety—
pal molecular water channe1．am j physio1．，1993，265：f463一f476
[5]bradley m．denker，barbara l，agre p，et a1．identification，purifica—
(三)aqp2
以前认为aqp2仅在肾脏集合管上皮细胞顶质膜表达，但国内杨军等研究证实，它在人的涎腺中也有表达。[ 一
(四)aqp3
aqp3在肾脏集合管主细胞的基底侧和气管、鼻咽等上皮细胞有表达l2 ，在消化系统的结肠、肝脏、胰腺和小肠组织中也有表达。
(五)aqp4
aqp4主要分布在脑和脊髓中，特别是在神经胶质细胞和室管膜细胞上表达比较强烈，[24 3在其他组织中也有表达，如肾内髓集合管上皮细胞，支气管、气管的柱状上皮和鼻咽上皮细胞，胃粘膜层腺细胞等。
和尿素等有机小分子有一定的通过性，并且它们的核苷酸序列也很相似，[14, ]可据此将aqps家族分为两个亚家族，即aqp3和aqp7为一个亚家族，其余aqps为另一个亚家族。
对aqps的调节存在长期和短时调节之分。长期调节作用在核酸转录水平上，主要表现为aqps的mrna合成增加，蛋白表达量增强，如皮质醇类激素可以从该水平上增加aqp1的表达等。[ ]短时调节主要表现为细胞浆内的囊泡等膜单位短时与细胞膜融合，它们膜上的aqps转移到细胞膜上，导致细胞膜单位面积上aqps的量短时增加，如当受到加压素的作用时，肾组织细胞浆中的囊泡与肾脏细胞顶端膜融合，使囊泡中的aqp2转移到胞膜中发挥作用，一旦刺激消失，又通过形成囊泡载体，aqp2返回到胞浆中，从而减少细胞膜上的aqp2，水通透性降低，所以这种短时调节机制又称为“穿梭机制”。 l
[7]preston gm，carroll tp，guggino wb，et al appearance of water cban—
nels in xenopus oocytes expresing red cell chip28 protein science，
有些水通道对含汞试剂敏感，其功能可被汞试剂抑制。这是因为这些水通道蛋白的npa前序列中存在189一半胱氨酸残基，该残基为汞的特异性结合位点，一旦汞试剂与这个位点结合，就可抑制水通道。在现在已知的aqps家族中，只有a0p4和aop7的npa前序列不含189一半胱氨酸残基，它们为汞不敏感性水通道蛋白。_7·lo 3
三、aqps的功能与调节
aqps对水有选择性性通透作用，将体外转录合成的水通道cdna注入非洲爪蟾的卵母细胞和嵌入脂质体进行实验，证明水的渗透率(pf)呈数十倍地增加，c 6-8]从而证实aqps对水有特殊通过性。aqps对各种离子不具有通过性，_1 3_它们的功能不受温度、质膜成分的影响，但有的研究证实aqp3和aqp7对甘油
(六)aqp5
aqp5位于肺的i型细胞、上气道的分泌上皮细胞，在一些分泌性细胞中也有表达，如颌下腺、腮腺上皮细胞等。l2
(七)aqp6
aqp6仅分布于肾脏组织中。
(八)aqp7、aqp8、aqp9
aqp7、aqp8、aqp9在消化系统的唾液腺、食管、胃肠道、肝胆及胰腺有表达。[27 aqp7在肾脏、心脏、骨骼肌和脑组织中有表达，[28 aqp8、aqp9在肺组织中有表达，但具体定位不清楚。[28]