水飞蓟素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠肝纤维化作用

水飞蓟素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠肝纤维
化作用
研究背景肝纤维化是由多种慢性肝病引起的肝脏炎症和修复失调所导致的,如病毒感染、毒物损伤、代谢紊乱和酒精滥用等,其特征是细胞外基质(extracellular matrix.ECM)过度沉积。

肝脏中的纤维沉积,尤其是I型胶原,
可以保护肝细胞免受各种毒性刺激。

然而,过度的纤维沉积和调节失调会导致肝脏结构破坏、肝功能衰竭和肝硬化。

到目前为止,临床上还没有有效的治疗肝纤维化的药物。

为寻找更好的治疗靶点,近年来对肝纤维化的病理生理机制进行了深入研究。

大量的研究表明,固有免疫,特别是巨噬细胞在肝纤维化中起着关键作用。

肝巨噬细胞可通过多种途径促进肝纤维化,如释放促炎症因子,如肿瘤坏死
因子(TNF)-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6,诱导肝细胞坏死,促纤维化细胞因子,如转化生长因子(TGF)-β1直接激活肝星状细胞(HSC)。

肝脏中巨噬细胞的来源主要有两种:一种是来源于胚胎祖细胞的存活时间长、自我更新的常驻库弗细胞(KF)。

在稳定状态下,肝脏中巨噬细胞数量的平衡主要依赖于KFs细胞的自我更新和增殖。

另一种是在病理状态下从骨髓和外周血中迁移而来的单核细胞。

肝脏损伤后,外周血中的单核细胞大量趋化进入肝脏,并被活化成为巨噬细胞,释放促炎症因子和促纤维化因子,加剧了肝损伤和纤维化。

这些发现表明抑制单核细胞浸润可能是治疗肝纤维化的一个新靶点。

进一步的研究发现,单核细胞主要根据细胞表面分子Ly6C分为两大亚群:经典单核细胞(Ly6Chi单核细胞)和非经典单核细胞(Ly6C]o单核细胞)。

经典的单
核细胞表达高水平的CCR2和Ly6C,并表达低水平的CX3CR1,具有促炎症和促纤维化作用。

而非经典的单核细胞表达高水平的CX3CR1和低水平的CCR2和Ly6C,具有抗炎和抗纤维化作用。

Ly6Chi单核细胞高表达的CCR2受体可与急慢性肝病时升高的趋化蛋白1(MCP-1)结合,导致Ly6Chi单核细胞向肝脏的趋化。

与野生小鼠相比,MCP-1-/-和CCR2-/-小鼠在毒性(四氯化碳,CCL4)和代谢(methionine choline-deficient)两种肝纤维化模型中显示较少的肝纤维化。

药理抑制MCP-1的小鼠也出现类似现象。

因此,通过MCP-1/CCR2轴减少单核细胞浸润已成为肝纤维化治疗的重要靶点。

水飞蓟是菊科药用植物。

水飞蓟素是一种含有水飞蓟全部药用成分的化合物,主要含有水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭。

水飞蓟素作为一种传统的保护肝的药物,具有特殊的疗效和极低的毒性,广泛应用于肝病的治疗。

许多临床和动物研究已经证实水飞蓟素具有保护肝细胞和抗肝纤维化的作用,但潜在机制仍然模糊不清。

因此,本研究旨在研究水飞蓟素是否可以通过抑制Ly6Chi单核细胞的浸润而减轻四氯化碳诱导的肝纤维化。

以此来揭示水飞蓟素的保肝和抗肝纤维化的作用机理,为临床上更好的应用水飞蓟素提供充足的理论支持,且为今后治疗肝纤维化疾病提供新方向。

研究方法本论文分为理论研究和实验研究两部分。

第一部分总结了中西医对肝纤维化的研究进展。

第二部分研究了水飞蓟素抗纤维化的作用机制。

在理论研究部分,完整的叙述了中医先贤对肝纤维化病因病机、辨证和治疗
的观点。

并总结了现代医学,特别是基础研究在肝纤维化的发病机制、病理生理及药物研究进展,为下一步实验研究提供理论基础。

在水飞蓟素抗纤维化实验方面,利用CCl4反复腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型,探讨水飞蓟素减少Ly6Chi单核细胞肝脏浸润抑制小鼠肝纤维化作用。

具体方法是用CCl4反复腹腔注射小鼠(C57BL/6),需连续4周,肝纤维化模型建立后,予水飞蓟素灌胃给药。

水飞蓟素的保肝降酶作用主要是通过检测各组小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平,且通过肝组织病理HE染色法对疗效进行评定。

水飞蓟素的抗肝纤维化功效则是通过Masson染色、Collagen-I免疫组化来评价;除此之外,利用α-SMA免疫组化观察各组小鼠肝星状细胞活化的差异。

利用细胞表面分子CD45、F4/80、CD11b来观察各组小鼠肝脏中白细胞、巨噬细胞和单核细胞浸润的差异。

通过流式细胞术检测单核细胞不同亚类在小鼠肝组织中浸润的区别,同时检测T细胞、DC细胞、NK细胞及B细胞在肝纤维化时在小鼠肝脏浸润水平。

Realtime PCR技术对小鼠肝组织中表达的TNF-α、TGF-β1 mRNA、1L-6及IL-1β水平进行检测。

此外选择免疫组化、RealtimePCR法对小鼠肝组织内表达的MCP-1水平进行检测。

研究结果1.水飞蓟素缓解CCl4注射引起的肝脏炎症和肝纤维化CCl4腹腔反复注射四周后,与空白对照组相比,CCl4组小鼠血清中ALT、AST的水平显著上升。

同时小鼠肝组织病理通过HE染色发现,CCl4组小鼠肝细胞大量变性、凋亡,肝小叶正常结构破坏,见许多白细胞浸润;水飞蓟素组小鼠血清中ALT、AST较CCl4组明显降低,HE染色示肝细胞坏死、肝小叶的破坏明显减少,白细胞浸润亦
Masson染色法结果表明:相比于正常组,CCl4组小鼠肝组织具有更高水平的胶原纤维沉积量,小叶纤维间隔及假小叶形成;Collagen-I免疫组化显示CCl4组小鼠肝组织内Ⅰ型胶原沉积明显增加。

α-SMA免疫组化显示CCl4组小鼠肝脏中肝星状细胞(HSC)活化明显增加。

而水飞蓟素治疗后,小鼠肝组织内的Masson染色和Collagen-I免疫组化明显减少,提示水飞蓟素可以减轻CC14注射引起肝纤维化。

这可能是水飞蓟素抑制HSC的活化来减少胶原的分泌的结果。

2.水飞蓟素抑制Ly6Chi单核细胞浸润及单核细胞相关的促炎和促纤维化细胞因子分泌通过CD45、F4/80、CD11b免疫组化,可以观察到与正常组小鼠相比,CCl4组小鼠肝脏中浸润的CD45+、F4/80+、CD11b+细胞明显增加,提示小鼠肝纤维化期肝脏中白细胞、巨噬细胞和单核细胞数量明显增加。

而水飞蓟素组中CD45+、F4/80+、CD11b+细胞浸润明显减少,提示水飞蓟素可以减少肝纤维化期小鼠肝脏中白细胞、巨噬细胞和单核细胞的浸润。

通过流式细胞术,我们进一步探索了水飞蓟素对单核细胞的不同亚群和其他种类白细胞的在肝纤维化期浸润的作用。

结果发现水飞蓟素可以明显减少肝纤维化期升高的Ly6Chi单核细胞浸润,但对Ly6Clo单核细胞无明显作用,也对其他白细胞亚群如B细胞、T细胞、DC细胞和NK细胞无明显作用。

这些研究结果提示水飞蓟素可能主要是通过影响Ly6Chi单核细胞发挥抗炎抗纤维化作用。

利用PCR检测了 CCl4注射4周后单核细胞相关的促炎和促纤维化的细胞因子变化,结果显示CCl4组小鼠肝脏中IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表达较空白组明显增高,而水飞蓟素灌胃后可以明显降低肝组织内TNF-αmRNA表
与空白组对比,模型组小鼠肝组织内促纤维化细胞因子TGF-β1 mRNA水平较明显增高,而予以水飞蓟素干预后TGF-β1 mRNA表达明显降低。

3.水飞蓟素抑制单核细胞趋化因子分泌通过RT-PCR和免疫组化进一步检测了各组小鼠肝组织内单核细胞趋化因子的的表达量,研究结果表明:相比于对照组,模型组小鼠肝组织内能够表达更高水平的MCP-1 mRNA,而水飞蓟素治疗后的小鼠肝组织内的MCP-1 mRNA表达水平较模型组明显减低,但仍高于空白对照组。

小鼠肝组织MCP-1免疫组化显示MCP-1蛋白表达和mRNA表达趋势一致。

而三组小鼠单核细胞趋化因子的变化趋势与各组小鼠单核细胞浸润趋势一致。

研究结论水飞蓟素具有保肝和抗肝纤维化的作用,但其作用机制却知之甚少。

近年来,对Ly6Chi单核细胞在肝纤维化中的作用已被证实。

因此,本研究旨在探讨水飞蓟素能通过减少Ly6Chi单核细胞浸润减轻肝纤
维化。

在腹腔注射四氯化碳的小鼠肝纤维化模型中,肝脏组织学和病理学分析显示水飞蓟素可显著减轻四氯化碳所致的小鼠肝纤维化和炎症反应,并且水飞蓟素灌胃小鼠表现出Ly6Chi单核细胞浸润较少,而四氯化碳组与水飞蓟素组其他白
细胞亚群无显著性差异。

同时,进一步研究发现,水飞蓟素能显著降低CCl4诱导的肿瘤坏死因子(TNF)-α/转化生长因子(TGF)-β1和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达增加,
减少肝内Ly6Chi单核细胞数量。

总之,我们的研究表明水飞蓟素具有抗肝纤维化的作用,水飞蓟素可能通过抑制MCP-1表达进而抑制Ly6Chi单核细胞肝脏浸润,减少促炎及促纤维化因子的分泌,发挥抗肝脏炎症和纤维化的作用。