Native-PAGE实验方法与问题及其解答 主要内容： 分离酸性蛋白步骤
Native-PAGE实验方法
Native-PAGE实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
分离酸性蛋白工作液配制1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2. 4×分离胶Buf M Tris-HCl，pH ： g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH ，加水定容到10 0ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf M Tris-HCl，pH ：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH ，加水定容到1 00ml，4℃贮存；4. 10×电泳Buf（ Tris-Gly）: g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4℃贮存；5. 2×溴酚蓝上样Buf: , Tris-Cl，甘油， % 溴酚蓝， dH2O； -20℃贮存；6. 10%APS；7. %考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 ，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,%C）3. 4×分离胶Buf M Tris-HCl，pH4. 4×堆积胶Buf M Tris-HCl，pH5. 水6. 10%APS 35 μl7. TEMED 15 μl8. 10×电泳Buf（ Tris-Gly）:100ml稀释到1L电泳条件 :100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
非变性凝胶电泳技术
Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
SDS-PAGE电泳操作规范
聚丙烯酰氨凝胶电泳一简介作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由shapiro 于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
二作用SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
BluenativePAGE实验讲义
Blue Native PAGE一．实验原理：Blue Native PAGE（BN-PAGE）是Hermann Scha¨gger1991年创立的一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离蛋白质复合物的电泳技术。
能分离10KD-10MKD范围内的蛋白质以及蛋白质复合物。
BN-PAGE 以考马斯亮蓝G-250 代替SDS 使蛋白质复合物带负电荷，根据各个不同复合物分子量不同从而在胶中得到分离。
这些复合物在胶中以蓝色条带形式呈现。
样品用一些温和的去污剂如dodecylmaltoside (DM),Triton X-100 和毛地黄皂苷(digitonin) 等溶解, 从而使复合物以近似天然的状态分离。
实验中若想进一步分析复合物各个亚基的成分，通常采用BN-PAGE结合SDS-PAGE的方式.实验结果如下图所示。
二实验需要用到的试剂：咪唑（Imidazole），6-氨基乙酸（6-Aminohexanoic acid），聚丙烯酰胺（Acrylamide (twice-crystallized) ），甲叉双丙烯酰胺.（Bis-acrylamide (twice-crystallized)），20%（W/V）Triton X-100，20%（W/V）dodecylmaltoside (DM)，20%（W/V）digitonin，甘油，5% （W/V）G-250（Coomassie blue G-250）,巯基乙醇（.Mercaptoethano）,过硫酸铵（AP），TEMED，氯化钠三溶液的配置AB-3 mix:称48 g acrylamide 加入大约50mL的ddH2O中，搅匀后定容至100mL，再加入1.5 g bisacrylamide，混匀，三层滤纸过滤后置于棕色瓶中保存。
5%G-250溶液：0.5g G-250，0.6559g 6-氨基乙酸溶于10毫升水中电极缓冲液和凝胶缓冲液的配方见表1样品溶解液的配方见表2分离胶和浓缩胶的配方见表3四实验流程：1.灌胶选择合适的玻璃板，用洗涤剂反复擦洗玻璃板，再用自来水反复冲洗，最后用双蒸水漂洗，自然晾干或者用吹风机吹干。
Blue Native PAGE电泳
ＡＢ．３ 凝胶缓；中液 甘油 水 总体积 １０％过硫酸铵 ＴＥＭＥＤ
３．５％丙烯酰胺 ０．４４ｍＬ ２ｍＬ
３．４ｍＬ ６ｍＬ ５０ｕＬ ５ｐＬ
４％丙烯酰胺 １．５ｍＬ ６ｍｌ
１０．４ｍＬ １８ｍＬ ｌＯＯｐ，Ｌ ｌＯｕＬ
１３％丙烯酰胺 ３．９ｍＬ ５ｍＬ ３９ ３ｍＬ １５ｍＬ ７５ｕＬ ７．５ｔｔＬ
圆参考文献 Ｅｕｂｅｌ Ｈ．Ｂｒａｕｎ帆Ｍｉｌｌａｒ ＡＨ．Ｂｌｕｅ－
ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ：ａ ｔｏｏｌ ｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００５，１：１１．
万方数据
ｗｗｗ．ｂｉｏｂｕｓｉｎｅｓｓ．ｃｏｍ．ｇｎ ２００８．０５（９ｆ１）．Ｉ生纺产业拉术 ７ｌ
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④充分匀浆。
⑨参考文献
Ｅ”ｂ。１ Ｈ，’８”３。ｈ Ｌ，Ｂ’４“”ＨＰ Ｎ。ｗ
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ａ ｕｎｉｑｔｍ
。
２００；，１３３：２７４．２８６．１
⑤参照表６，ＪＮ，Ｋ．ＤＭ或ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ。 ⑥将样品放置５～１０ｍｉｎ／陡之充分 溶解。 ⑦１０００００９离心１５ｍｉｎ．将上清液转 移到一新的离心管中。
②将匀浆好的样品分成小份．每份 分别对应２０ｍｇ细胞沉淀（湿重）．５ｍｇ 心肌（湿重），１５ｍｇ骨骼肌（湿重） 或１０ｍｇ肾．脑．肝组织（湿重）， １００００～２００００９离心１０ｍｉｎ。沉淀中 包含细胞核．线粒体和大的细胞碎片 等。该沉淀可以在液氮中速冻后保存 于一８０。Ｃ。
Native-PAGE实验方法与问题及其解答-主要内容-分离酸性蛋白步骤
Native-PAGE实验方法与问题及其解答主要内容：分离酸性蛋白步骤分离碱性蛋白步骤问题和解答步骤非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
分离酸性蛋白工作液配制1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2. 4×分离胶 Buf(1.5 M Tris-HCl ，pH 8.8)：18.2 g Trisbase溶于 80ml 水，用浓 HCl 调 pH 8.8，加水定容到 100ml ，4℃ 贮存；3. 4×堆积胶 Buf(0.5 M Tris-HCl ，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于 80ml 水，用浓 HCl 调 pH 6.8，加水定容到 100ml ，4℃ 贮存；4. 10×电泳 Buf （pH8.8 Tris-Gly ）:30.3 g Trisbase ， 144 g 甘氨酸，加水定容到 1l ，4℃ 贮存；5. 2×溴酚蓝上样 Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl ，3.0ml 甘油， 0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH 2 O ； -20℃贮存；6. 10%APS ；7. 0.25%考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 2.5g ，甲醇 450ml ，HAc 100ml, dH 2O 450ml ；8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml 甲醇，100 冰醋酸，800ml dH 电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正） 1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C ）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶 Buf(1.5 M Tris-HCl ，pH 8.8) 2.5ml4. 4×堆积胶 Buf(0.5 M Tris-HCl ，pH 6.8)1.25ml5. 水3.2ml6. 10%APS 35 μl7. TEMED 15 μl8. 10×电泳 Buf （pH8.8 Tris-Gly ）:100ml 稀释到 1L2 O电泳条件 :100V 恒压约 20min ，指示剂进入浓缩胶；改换160V 恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约 80min 。
BluenativePAGE实验讲义
Blue Native PAGE一．实验原理：Blue Native PAGE（BN-PAGE）是Hermann Scha¨gger1991年创立的一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离蛋白质复合物的电泳技术。
能分离10KD-10MKD范围内的蛋白质以及蛋白质复合物。
BN-PAGE 以考马斯亮蓝G-250 代替SDS 使蛋白质复合物带负电荷，根据各个不同复合物分子量不同从而在胶中得到分离。
这些复合物在胶中以蓝色条带形式呈现。
样品用一些温和的去污剂如dodecylmaltoside (DM),Triton X-100 和毛地黄皂苷(digitonin) 等溶解, 从而使复合物以近似天然的状态分离。
实验中若想进一步分析复合物各个亚基的成分，通常采用BN-PAGE结合SDS-PAGE的方式.实验结果如下图所示。
二实验需要用到的试剂：咪唑（Imidazole），6-氨基乙酸（6-Aminohexanoic acid），聚丙烯酰胺（Acrylamide (twice-crystallized) ），甲叉双丙烯酰胺.（Bis-acrylamide (twice-crystallized)），20%（W/V）Triton X-100，20%（W/V）dodecylmaltoside (DM)，20%（W/V）digitonin，甘油，5% （W/V）G-250（Coomassie blue G-250）,巯基乙醇（.Mercaptoethano）,过硫酸铵（AP），TEMED，氯化钠三溶液的配置AB-3 mix:称48 g acrylamide 加入大约50mL的ddH2O中，搅匀后定容至100mL，再加入1.5 g bisacrylamide，混匀，三层滤纸过滤后置于棕色瓶中保存。
5%G-250溶液：0.5g G-250，0.6559g 6-氨基乙酸溶于10毫升水中电极缓冲液和凝胶缓冲液的配方见表1样品溶解液的配方见表2分离胶和浓缩胶的配方见表3四实验流程：1.灌胶选择合适的玻璃板，用洗涤剂反复擦洗玻璃板，再用自来水反复冲洗，最后用双蒸水漂洗，自然晾干或者用吹风机吹干。
SDS-PAGE和Native-PAGE的比较
程中和电泳后都不会变性。
最主要的有以下几点：1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶的有SDS。
2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。
3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。
4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。
非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。
这点跟变性电泳也不一样。
所以与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离…分离碱性蛋白要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂实验操作同分离酸性蛋白。
回收native-PAGE结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下：电泳结束以后，切取部分染色，然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中的缓冲液相同），低温电泳2-3小时即可。
Blue native-PAGE 实验讲义
Blue Native PAGE一．实验原理：Blue Native PAGE（BN-PAGE）是Hermann Scha¨gger1991年创立的一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离蛋白质复合物的电泳技术。
能分离10KD-10MKD范围内的蛋白质以及蛋白质复合物。
BN-PAGE 以考马斯亮蓝G-250 代替SDS 使蛋白质复合物带负电荷，根据各个不同复合物分子量不同从而在胶中得到分离。
这些复合物在胶中以蓝色条带形式呈现。
样品用一些温和的去污剂如dodecylmaltoside (DM),Triton X-100 和毛地黄皂苷(digitonin) 等溶解, 从而使复合物以近似天然的状态分离。
实验中若想进一步分析复合物各个亚基的成分，通常采用BN-PAGE结合SDS-PAGE的方式.实验结果如下图所示。
二实验需要用到的试剂：咪唑（Imidazole），6-氨基乙酸（6-Aminohexanoic acid），聚丙烯酰胺（Acrylamide (twice-crystallized) ），甲叉双丙烯酰胺.（Bis-acrylamide (twice-crystallized)），20%（W/V）Triton X-100，20%（W/V）dodecylmaltoside (DM)，20%（W/V）digitonin，甘油，5% （W/V）G-250（Coomassie blue G-250）,巯基乙醇（.Mercaptoethano）,过硫酸铵（AP），TEMED，氯化钠三溶液的配置AB-3 mix:称48 g acrylamide 加入大约50mL的ddH2O中，搅匀后定容至100mL，再加入1.5 g bisacrylamide，混匀，三层滤纸过滤后置于棕色瓶中保存。
5%G-250溶液：0.5g G-250，0.6559g 6-氨基乙酸溶于10毫升水中电极缓冲液和凝胶缓冲液的配方见表1样品溶解液的配方见表2分离胶和浓缩胶的配方见表3四实验流程：1.灌胶选择合适的玻璃板，用洗涤剂反复擦洗玻璃板，再用自来水反复冲洗，最后用双蒸水漂洗，自然晾干或者用吹风机吹干。
Native-PAGE
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)原理、方法步骤与常见问题分析[转] 2009-12-09 20:27Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
Native-PAGE实验方法
Native-PAGE实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
分离酸性蛋白工作液配制1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4℃贮存；5. 2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2 O；-20℃贮存；6. 10%APS；7. 0.25%考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8) 2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10%APS 35 μl7. TEMED 15 μl8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到1L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
一般说来Native-PAGE需要注意下面几个问题
一般说来Native-PAGE需要注意下面几个问题：
1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要
的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统；
2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度；
3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然;
4. 变性样品的离子强度不能太高（I<0.1mM）。
调整样品的PH在4.0左右，这对于能否做好非变性样品非常重要。
上样BUFFER 中没有SDS之外，加入样品后不能加热.。
Native-PAGE实验方法.doc
v1.0可编辑可修改Native-PAGE 实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page 电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH 凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH 凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH 是的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
分离酸性蛋白工作液配制1. 40% 胶贮液 (Acr:Bis=29：1）；2. 4 ×分离胶Buf M Tris-HCl，pH：g Trisbase溶于80ml水，用浓HCl调pH，加水定容到100ml ，4℃贮存；3. 4 ×堆积胶Buf M Tris-HCl，pH：6 g Trisbase溶于80ml水，用浓HCl 调 pH ，加水定容到 100ml， 4℃贮存；4. 10 ×电泳B uf （ Tris-Gly）: g Trisbase，144 g甘氨酸，加水定容到1l，4℃贮存；5.2 ×溴酚蓝上样 Buf: , Tris-Cl，甘油，%溴酚蓝，dH2O；-20℃贮存；6.10%APS；7. % 考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1.碱性非变性胶17%分离胶 (10 ml)4%堆积胶 (5 ml)2. 40% 胶贮液 (40%T,%C）3. 4×分离胶Buf M Tris-HCl，pH4. 4 ×堆积胶Buf M Tris-HCl，pH5.水6.10%APS 35 μl7. TEMED 15 μl8. 10 ×电泳Buf （ Tris-Gly）:100ml稀释到1L电泳条件:100V 恒压约 20min ，指示剂进入浓缩胶；改换160V 恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
Native-PAGE
一、溶液配制：1．溶液A（丙烯酰胺储存液），100ml30%丙烯酰胺，0.8%双丙烯酰胺称取30g丙烯酰胺，0.8g双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，搅拌至完全溶解。
棕色瓶中密封，4℃保存。
2．溶液B（4×分离胶缓冲液），100ml1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)18.2g Tris 溶于40ml蒸馏水中，加入盐酸至pH8.8；加蒸馏水至100ml，4℃保存。
3．溶液C（4×浓缩胶缓冲液），100ml0.5mol/L Tris(pH6.8)6.0g Tris 溶于40ml蒸馏水，加盐酸至pH为6.8，加蒸馏水至10ml，4℃保存。
4．10%过硫酸铵，5ml0.5g 过硫酸铵溶解于5ml蒸馏水中。
-20℃保存。
5．电泳缓冲液，1L3.0g Tris，14.4g甘氨酸，加蒸馏水至1L(终pH6.8)。
6．5×样品缓冲液，10ml3.1ml 1mol/L Tris-HCl(pH6.8)，5ml 甘油，0.5ml 1%溴酚蓝，1.4ml 蒸馏水。
7．考马斯亮蓝染液，1LCBB R-250 1.0g，甲醇450ml，冰醋酸100ml，蒸馏水100ml。
8．考马斯亮蓝凝胶脱色液，1L甲醇100ml，冰醋酸100ml，蒸馏水800ml。
二、试验操作1．工作溶液的用量：（1）制备不同厚度电泳凝胶所需的溶液体积：制备两块6cm×8cm的凝胶凝胶厚度分离胶浓缩胶0.5mm 5.6ml 1.4ml0.75mm 8.4ml 2.1ml1.0mm 11.2ml2.8ml1.5mm 16.8ml 4.2ml配制量应比实际用量稍多些。
（2）X%分离胶的计算A 液X/3 mlB 液 2.5ml蒸馏水（7.5－X/3）ml10% AP 50μlTEMED 5μl（如果X＜8%，取10μl）总量10ml2．分离胶的制备配制一块12%的分离胶（6cm×8cm×0.75mm），需配5ml。
Native_PAGE
1. PAGE
TEMED AP+H2O 0-40℃ Bis 三维网 状结构 过硫酸自由基
PAM
交联 聚合
Acr
TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯 酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺 链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
3. Native PAGE的分类
– 操作过程
1. 样品处理： 加入考马斯亮蓝，其可以与膜蛋白结合消除 蛋白疏水性，从而起到增溶作用。同时使膜蛋 白带负电荷，电泳时（pH7.0）向阳极迁移。 2. 制胶。 通常在顶部的阴极一侧需要一个梯度为3-5% 的丙烯酰胺，在底部的阳极一侧需要梯度为1315%的丙烯酰胺，适用于10kDa—10MDa的分 离，可以通过改变胶的浓度，而改变分离范围。
1. PAGE
2. Native PAGE
• 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE) 是在不加入SDS、疏基乙醇等变性剂的条 件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺 凝胶电泳。在电泳分离后仍能保持蛋白质和 酶等生物大分子的生物活性和构象，对于生 物大分子的鉴定有重要意义。
3. Native PAGE的分类
• Blue native PAGE
– Blue-native PAGE是PAGE中应用较广的一种， 在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合 物方面有很大的优势。 – 1991年Schagger等人为了研究线粒体内膜中多 亚基蛋白复合物建立起的一种温和凝胶电泳系 统，它是以考马斯亮蓝G-250代替SDS使蛋白 复合物带负电，从而避免了蛋白质的变性。— —Blue native PAGE
native电泳详细流程
native电泳详细流程引言：native电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过利用蛋白质在电场中的迁移速度差异，实现对蛋白质的分离和定量。
本文将详细介绍native电泳的流程及相关步骤。
一、实验前准备1. 准备所需材料和试剂，包括聚丙烯酰胺凝胶、Tris缓冲液、样品及标准品等。
2. 准备电泳槽和电源设备，并确保设备正常工作。
3. 根据实验需要，选择合适的凝胶浓度和凝胶孔径。
二、制备样品1. 收集待测样品，如细胞提取液或纯化的蛋白质溶液。
2. 根据样品浓度和所需分辨率，决定所需加载样品的体积。
3. 如有需要，可对样品进行预处理，如去除杂质、稀释等。
三、样品加载1. 准备一个干净的试管，将所需样品加入，并加入适量的加载缓冲液。
2. 轻轻混合样品和加载缓冲液，确保均匀混合。
3. 将样品缓冲液混合物注入凝胶孔中，注意不要产生气泡。
4. 将凝胶板放入电泳槽中，确保样品完全覆盖凝胶孔。
四、电泳条件设置1. 根据实验需要，设置合适的电流和电压。
2. 将电泳槽连接至电源设备，确保连接牢固。
3. 打开电源开关，开始进行电泳。
五、电泳运行1. 根据实验需要，设置适当的运行时间和电流。
2. 观察电泳进程，确保电流稳定并出现良好的分离。
3. 根据实验需要，可以随时调整电流和电压。
六、凝胶染色和成像1. 在电泳结束后，取出凝胶板。
2. 根据实验需要，选择合适的染色方法，如银染、荧光染色等。
3. 进行染色处理，并按照染色剂的使用说明进行操作。
4. 染色完成后，使用成像设备进行成像，记录结果。
七、数据分析1. 根据成像结果，分析样品中蛋白质的迁移距离和分离情况。
2. 可以使用专业的软件进行数据分析和图像处理。
3. 结合已知的标准品或其他实验结果，进行定量和比较分析。
结论：native电泳是一种有效的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，实现了蛋白质的分离和定量。
本文详细介绍了native电泳的流程，包括实验前准备、样品制备、样品加载、电泳条件设置、电泳运行、凝胶染色和成像以及数据分析等步骤。
酸性蛋白酶实验方案
酸性蛋白酶降解猪瘦肉肉实验方案一、实验目的①购得黑曲霉发酵生产的酸性蛋白酶，并在其最适条件下进行研究②研究该酸性蛋白酶降解瘦肉的降解肉类效果、对酵母生长的影响。
③根据实验前后的含氮量，研究该酸性蛋白酶对瘦肉的降解度二、实验原理①酸性蛋白酶特性：活力定义：一个酶活力指1g酶粉成1ml酶液在40℃.PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个活力单位（u/g或u/ml）pH范围：2.5～4.0（最适PH3.5）最适温度：55℃，低于40℃稳定性状：褐色或灰色粉末，由黑曲霉经发酵提炼而成而成，易溶于水用途：生化研究。
水解蛋白, 具有较强的水解能力能力，能将大分子的蛋白质水解成氨基酸等②水解度(DH)的计算公式:DH( %)) =水解液中总氨基态氮/原料中总氮含量[1]③凯氏定氮法测总氮：凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
三、实验试剂和仪器①实验试剂：新鲜瘦猪肉(市售) ；酸性蛋白酶(5. 0×105IU/ g) (广州市凯升生物有限公司)、凯氏定氮法相关试剂②实验仪器：凯氏定氮蒸馏装置,雷磁酸度计,恒温水浴锅,电子天平、电磁炉四、实验方法①新鲜猪瘦肉预处理从市场上购得猪肉，清水洗净后，用小刀精心除去脂肪，将猪肉用自来水冲洗，去血1h后，冷冻保藏，一段时间后取出并切成块状，然后经高压灭菌灭菌，用无菌水冲洗，放置冰箱冷冻备用[3]。
②猪肉酶解工艺流程猪肉糜(经预处理) →配制pH3.5的柠檬酸缓冲液→按固液比（m/V）1：1匀浆[1、3]→加酶保温酶解→100℃灭酶15min→4500r/min离心 15min→上清液过滤→猪肉蛋白酶解液[3]③单因素实验组别设置在酶解时间5h、 pH3.5条件下实验，设置一个不加入酶的空白对照，每组设置3组平行对照：＊温度条件：55℃、30℃＊酶液加入量：按3%（M/M）（酶：底物）加入量[1]＊酵母培养：加入蛋白酶按6.5U/mL（酶：培养基）比例、不加蛋白酶对照进行液体培养猪瘦肉用量：每组15g，共8组，共120g。
blue native page 2d sds page原理
blue native page 2d sds page原理
Blue native page (BN-PAGE) 是一种用于分离和分析膜蛋白复
合物的电泳技术。
相比于传统的SDS-PAGE，BN-PAGE能够
在不破坏膜蛋白复合物的情况下，将其分离并保持其完整的活性和功能。
BN-PAGE原理如下：
1. 准备样品：将待分析的膜蛋白复合物进行溶解，并加入一定量的非离子性洗涤剂（例如：十二烷基硫酸钠）和蓝色色素（例如：Coomassie Blue G-250），形成复合物-洗涤剂-蓝色色素的复合体。
2. 电泳：将样品加载到BN-PAGE凝胶中，通过电泳使蛋白质
在凝胶中向阳极迁移。
由于复合物中的洗涤剂和蓝色色素具有负电荷，会形成一个复合物-洗涤剂-蓝色色素复合体，从而在BN-PAGE中具有净负电荷。
3. 凝胶分辨：在BN-PAGE电泳过程中，由于复合物的大小和
荷质比不同，会在凝胶中形成多个带电复合物。
相对较大的膜蛋白复合物会在近电极端停留，而相对较小的复合物会迁移到远离电极的位置。
4. 可视化和分析：通过凝胶染色（例如：Coomassie Blue染色）或免疫印迹等方法，可以可视化在BN-PAGE中分离的膜蛋白
复合物。
通过与分子量标准品的比较，可以确定复合物中不同蛋白质的相对分子质量。
总的来说，BN-PAGE利用洗涤剂和蓝色色素形成电泳复合物，通过电泳和凝胶分辨的方式，对膜蛋白复合物进行分离和分析。
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Native-PAGE实验方法与问题及其解答主要内容：分离酸性蛋白步骤分离碱性蛋白步骤问题和解答步骤非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
分离酸性蛋白工作液配制1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4℃贮存；5. 2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10%APS；7. 0.25%考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8) 2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10%APS 35 μl7. TEMED 15 μl8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到1L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V 恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
染色和脱色:取出胶板于0.25%考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。
也可以用银染或者活性染色。
分离碱性蛋白要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂实验操作同分离酸性蛋白。
回收native-PAGE结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下：电泳结束以后，切取部分染色，然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中的缓冲液相同），低温电泳2-3小时即可。
回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native （BN-PAGE），clear native（CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。
在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。
然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。
随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。
蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。
这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。
1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。
是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。
这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。
Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。
在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在pH7.5条件下也会向阴极迁移。
但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。
并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。
1.2 Clear Native PAGEClear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。
然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。
Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7）的电泳技术，分辨率通常比BN-PAGE低。
迁移距离决定于蛋白的固有电荷和凝胶孔径大小。
因此，BN-PAGE比CN-PAGE应用更广泛。
然而CN-PAGE在考马斯染料分析天然混合物干扰进一步分析时存在着优势。
如测定催化活性（例如线粒体ATP 合酶）或分离用于荧光共振能量分析的微量膜蛋白，CN-PAGE比BN-PAGE更温和，特别是使用洋地黄皂苷时，CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子组合体的结构而BN-PAGE会导致分解。
线粒体ATP 合酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE检出，但BN-PAGE 无法检出。
CN-PAGE起源于无色非变性PAGE，是BN- PAGE之后出现的技术。
既然CN-PAGE中没有带电荷的染料，蛋白在电场中的迁移完全取决于这个蛋白的固有电荷。
大分子和低聚蛋白必须有合适的物理参数才能在CN-PAGE中分开，特别是PI低于5.4，分辨率低。
由此看来，CN-PAGE除了获得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中没有什么优势了。
优点是条件更温和，在蛋白质组学研究中具有更大优势。
BN-PAGE和CN-PAGE的缓冲液和电泳条件一致，但是CN-PAGE的阴极缓冲液中不含考马斯染料，而是将0.025%的洋地黄皂苷加入到凝胶中。
1.3 QPNC-PAGEQPNC-PAGE（quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis）是一种应用于生物化学和生物有机化学的根据等电点分离蛋白的高分辨技术。
这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性或天然金属蛋白样品或正确或非正确折叠的可溶性的与金属辅助因子结合的蛋白混合物的鉴定。
1.3.1电泳缓冲液QPNC-PAGE是在特殊的装置里进行的分离生物活性分子的电泳过程。
在特殊的电泳缓冲系统（基于Tris-HCl和NaN3）中，一个生物系统中的大多数蛋白都会带电荷，在电场的正负极之间迁移。
尽管PH（10.00）的电泳缓冲液并不与细胞或组织中的生理PH 相符，但是在生理PH（8.00）的缓冲体系下蛋白会连续洗脱并分成不同的部分。
分离系统包括电泳槽和分部收集器，这些装置要置于冰箱中。
1.3.2凝胶特征为了得到一个PAGE所需的聚合完全的凝胶，聚丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚69hr。
最后，得到均质的含机械稳定和自由的单体或原子。
凝胶的孔径很大，因此分子筛作用在电泳分离中最小化。
基于上述原因，凝胶和活性分子之间的相互作用可以忽略。
待分离的金属蛋白（如金属分子伴侣，蛋白酶感染性初级因子，金属运输蛋白，淀粉状蛋白，金属酶，金属肽等）不会分解成脱辅蛋白和金属辅助因子。
孤立蛋白的生物活性结构（天然或3D构象）在QPNC-PAGE 后不会发生构象变化。
所以，金属蛋白和蛋白异构体在PAGE中被定量的分成高纯度的部分。
QPNC与其它电泳技术如SDS-PAGE，2-DE，等速电泳和CN- PAGE等相比被称为“突破性的方法”。
1.3.3 实验方法（1）储备液1）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00，室温2）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH8.00，室温3）40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C，4℃（新鲜）（2）电泳缓冲液20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH10.00（除气），4℃电泳槽上部：500ml电泳缓冲液电泳槽下部：2000ml电泳缓冲液（3）洗脱液20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH8.00（除气），4℃洗脱室：700ml洗脱缓冲液（4）分离胶丙烯酰胺4%T 体积40ml成分：4ml40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C4ml 200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.0032 mL H2O200 μL 10% AP S20 μL TEMEDAPS和TEMED最后加入。
轻轻搅拌烧瓶中的混合物，注意不能产生气泡。
然后把溶液移入内径为28mm，长为40mm有刻度的玻璃柱中。
加入3ml正丙醇。
60分钟聚合后用电泳缓冲液冲洗凝胶，然后用4ml电泳缓冲液覆盖凝胶表面。
在室温下凝集69小时。
（5）样品的准备和收集保持样品（生物液体）温度为4℃。
0.3ml甘油和2.7ml样品在分离前混合5分钟。
然后把处理好的样品加入到电泳缓冲液的上层。
这些蛋白在此电泳缓冲液中不是带负电（PI<10.0）就是带负电（PI>10.0），因此在电场中不是从正极迁移到负极就是从负极迁移到正极。