蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法

蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法

文章出处：朱敏

蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法

有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol左右,过多不仅耗费有机溶剂,而且可能导致沉淀不好.沉淀的条件一经确定,就必须严格控制,才能得到重复性结果.有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示.故操作条件比盐析法严格。

许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。某些第3组分的存在可以改变两相的比例和组成。有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶解度小且易变性。

疏水层析是近年发展的新方法。它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。此法能分离其它一些方法不易纯化的蛋白质。

利用分子形状和大小不同的分离方法

蛋白质形状有细长的如纤维，有密实的如圆球，形状很不相同。蛋白质的分子量从6000左右开始，有各种大小，大的可以大到几百万。利用这些差别，有几种方法可用来分离蛋白质。

凝胶层析

属最常用的蛋白质分离方法。系混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。所指凝胶从广义上说是一类具有三维空间多孔网状结构的物质，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。把适当的凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，于柱内加入欲分离的混合物，然后用大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物质的分子大小和形状不同，在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。

凝胶过滤是分子筛的一种，在介绍凝胶过滤法之前，首先介绍分子筛的由来。McBain(1928)提出了分子筛的概念。后来发现这一现象在许多地方都存在。Synge与Tiselins（1950）在解释凝胶层中的电泳和电渗现象时引用了分子筛的概念。此后发现在柱层析中也有这种现象，于是许多工作者尝试了一系列适用于生物高分子分离纯化用的分子筛。至1959年Porath 与Flodim找到部分水解的葡聚糖凝胶将其交联，得到了商品名为交联葡聚糖（Sephadex)的分子筛。该分子筛具有许多良好的性能，在蛋白质的分离分析中已被广泛采用。

Lathe与Ruthven(1956)曾利用分子筛效应测定过分子大小与分子量。Flodin与Granath （1961）发现不同分子量的葡聚糖级分，其凝胶过滤行为与分子量大小有关。Andrew（1962）发现蛋白质中也有类似的性质.此后经过不少人的实际应用，完善了这一方法，形成一个可*的测定高分子分子量的方法。

凝胶层析是60年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。由于设备简单、操作方便和不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，所以目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用。

PH值

与沉淀蛋白质或酶原理相同，结晶的溶液PH值一般选择在被结晶的蛋白质或酶的等电点附近，以利于晶体的析出。

温度

除少数情况外，通常选择低温条件进行。低温条件对蛋白质和酶不仅溶解度低且不易变性。在中性盐溶液中结晶时，温度可在0℃至室温范围内选择，在有机溶剂中结晶一般要求温度较低。

晶种

不易结晶蛋白质和酶如糜蛋白酶，往往加入微量的糜蛋白酶结晶可导致大量结晶的形成。有时用玻璃轻轻摩擦容器壁也可达到此目的。需加晶种才能形成结晶的蛋白质或酶，大多数结晶收率都不高。

金属离子

有些蛋白质和酶结晶时还需加入金属离子，如铁蛋白在硫酸铵溶液中结晶时，加入少量镉离子才形成菱状结晶，烯醇化酶也常加入汞盐后形成结晶。

结晶时间

在结晶条件比较适合的情况下，在几小时甚至几分名即可获得结晶。但有些情况需数天甚至数月才能结晶完全，视各种蛋白质和酶的具体情况不同而定。蛋白质和酶的结晶大多数是针状、棒状、片状，有的为八面体或立方体的菱状结晶。结晶的大小与结晶时间及条件有关。

干燥

干燥是将潮湿的固体、半固体或浓缩液中的水分（或溶剂）蒸发除去的过程。根据水分在固体中分布情况可分为表面水分、毛细管水分和被膜所包围的水分3种。表面水分附着于固体表面，蒸发时完全暴露于外界空气中，干燥最快、最均匀。毛细管水分存在于固体极细孔隙的毛细管中，水分子逸出比较困难，蒸发时慢并需较高温度。膜包围的水分如细胞中被细胞质膜所包围的水分，需经缓慢扩散至膜外才能蒸发最难除去。被干燥的物质其湿度与周围空气的湿度是一个动态平衡关系，暴露于大气中的物质是不会绝对干燥的。若使被干燥的物质所含水分低于周围空气中水分，则必须放在严密封盖的容器中进行干燥。用这种方法可得到含水量极低的干燥样品，生物大分子制备得到所需的产品后，为了防止变质易于保存和运输，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥，某些无活性核酸、微生物酶制剂和酪蛋白等工业产品则较多地应用喷雾干燥、气流干燥等直接干燥法。

真空干燥

在相同温度下，被干燥物质所含水分或溶剂由于周围空气压力的降低蒸发速度增加。真空度愈高，溶剂沸点愈低，蒸发愈快。其原理与真空浓缩（或称减压浓缩）相同。真空干燥适用于不耐高温、易氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器、及真空泵3

部分。干燥器顶部连接一带活塞的管道接通冷凝器，气化后的蒸气由此管道通过冷凝管凝聚，冷凝器另一端连接真空泵，干燥器内常放一些干燥剂如五氧化二磷、无水氯化钙等，以便干燥保存样品。

冷冻真空干燥

冷冻真空干燥除利用真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同的压力下，水蒸气压随温度的下降而下降。在低温下低压下冰很容易升华为气体。操作时通常将等干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。干燥后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。样品干燥时先在培养皿内铺成薄层（厚度不超过1cm的液体），置于低温冰箱内冻固。另在真空干燥器内用两个培养皿分别放置固体氢氧化钠和五氧化二磷，真空干燥上端抽气通过五氧化二磷干燥管与真空泵相连。当放进等待干燥的冻块后，立即封闭干燥器，开动真空泵，红5～10h 后得冷冻干燥品。也可将待干燥物质置于圆底容器中，然后浸入干冰-乙醇混合而成的冷却剂中，容器内液体迅速冻成固体，抽真空后等干燥冻块的水分子升华变成气体，经过冷凝器凝结为霜。冰冻的样品逐渐失去水分变成疏松的干燥粉末。上述操作关键在于真空泵的高真空度及管道的口径要合适。

喷雾干燥

喷雾干燥是将液体通过喷洒装置喷成雾滴后，与干燥介质（通常为热空气）直接接触干燥的方法。由于液体分散为雾滴时，直径通常只有1～200μm大小，与热空气接触面大，水分蒸发很快。在100℃的热空气中只需不到1秒的时间即可干燥。因干燥时间短和水分蒸发时吸收热量，使液滴及其附近的空气温度较低，故工业上常用。

样品贮藏保存

保存方法和生物大分子稳定性有很大关系，生物大分子的贮藏保存可分为干态和液态贮藏两种。但不论是干态或液态贮藏均应避免长期暴露于空气中防止微生物的污染。温度对生物大分子的稳定性影响很大，低温保存在大多数情况下是有利的。