第 8 讲 DNA RNA 蛋白质操作技术(1)
5分子生物学研究法——DNA、RNA及蛋...
ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系
前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经RNaseH加工后 产生有555个核苷酸的引物，起始DNA合成。
Plac MCS lacZ’
pUC18/19
5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷
X-gal
b
a b-半乳糖苷酶的a-肽段
CH2OH
HO
O
OHH H
O
H
H
H OH
Cl Br
N
Cl O Br
N
N
Br Cl
5、pGEM-3Z质粒
长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ' 基因。
Pst I
Hind III
第二部分来源于pSC101质粒的四
BamH I
环素抗性基因（tetr）；
Pvu I
第三部分则来源于ColE1的派生质
Pst I
Apr
Tcr
pBR322
粒pMB1的DNA复制起点（ori）。
Sal I 优点是具有较小的分子量(4363bp)， 易于纯化。即使携带了6-8kb的外
含X-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA分子的菌落为白 色。
pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码 的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体 转化子的鉴定。
具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoR I 和BamH I）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。
分子生物学研究法DNARNA及蛋白质操作技术
• PCR反应条件957502℃
Taq• PCR过程
• PCR的特点
Taq
Taq
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• PCR反应条件72℃ • PCR过程 • PCR的特点
第2轮结束
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第模1板轮D扩N增A 第2轮扩增
重复30轮后
2 =1,073,741,824 • PCR反应条件
• PCR过程 第3轮扩增
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PCR反应的全过程，即三步，可以被不断重复： •DNA解链（变性）， •引物与模板相结合（退火）， •DNA合成（链的延伸）。
经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合 位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。
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PCR的主要步骤
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重组DNA操作过程：
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种分子后，将其重新导入到 寄主细胞中，通过细菌（如：大肠杆菌）转化，选择转化子，通过筛选，获得 DNA重组表达。 并可在宿主细胞中保持下来，也可以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。
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55 酶
22
12
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条 单 链
变 性
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
4
5
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PCR的基本原理
• PCR反应条件95℃ • PCR过程 • PCR的特点
近代医学中的分子生物学技术
近代医学中的分子生物学技术医学发展的不断进步，离不开现代分子生物学技术的运用。
分子生物学技术是指利用分子生物学的基本理论和实验方法进行研究的技术手段，它具有高精度、高灵敏、高特异性等特点，被广泛应用于基因治疗、肿瘤学、免疫学等领域。
分子生物学技术主要包括4个方面：DNA技术、RNA技术、蛋白质技术和细胞技术。
下面将依次介绍。
一、DNA技术DNA技术是指利用基因工程技术对DNA进行操作和改造的技术，其目的是研究DNA，揭示其作用机理，以及利用DNA进行基因诊断、基因治疗、基因工程等方面的应用。
DNA技术主要包括PCR、基因克隆、DNA测序、DNA芯片等技术。
PCR技术（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的技术，它的原理是利用核酸引物将所需的DNA片段扩增至每个分子数以百万计。
PCR技术已经广泛用于基因检测、DNA重组、疾病诊断及生物系统学等研究领域。
基因克隆技术是通过分子克隆技术将相应的DNA分子克隆到细胞质体或病毒载体上，利用重组DNA技术将所需的DNA片段提取、扩增插入到所需的载体中，形成一个新的基因组，这种技术被广泛用于疾病的基因治疗和工业生产中。
DNA测序技术是将DNA单链进行测序的技术，它通过测量DNA碱基序列决定DNA的组成和序列，利用碱基对的配对特性来确定DNA条带的化学结构和排列顺序，这种技术已经被广泛应用于基因诊断、疾病治疗、基因工程等方面。
DNA芯片技术是一种高通量的基因表达分析技术。
它是一种半导体芯片上附有数百万至数千万个RNA或DNA分子的技术，可以在一个实验中同时检测数千种基因表达水平，从而迅速获取大量有关细胞和组织的表达信息。
二、RNA技术RNA技术主要包括RNA提取、RNA测序、RNAi等技术。
RNA提取技术是研究RNA的一种常用方法，通过分子生物学技术将细胞或组织中RNA分离出来，以便进一步研究RNA的生物学特性以及RNA在各种疾病中的作用机制。
RNA测序技术是指通过测序技术对RNA进行测序，以获得RNA子集的特定序列和结构线索，从而推断RNA的在细胞内的功能，并且可以进行基因表达分析、疾病诊断及治疗等方面的应用。
RNA基本操作技术ppt课件
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2、RNA的浓度
OD260 值 =1 ， 相 当 于 单 链 DNA 或 RNA 为 40μg/mL，寡核苷酸为20μg/mL。
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3、RNA的完整性
rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S rRNA亮度 接近2：1；mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加 0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟， 12000g离心10分钟
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例 加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟， 注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然 后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分 钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并 保存于-70℃
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RNA的纯度、浓度与完整性
1、RNA的纯度
纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.8-2.0 之间。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋 白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；
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5.DNA、RNA及蛋白质操作技术
520nm激发光
三个要素：
5’端短波长荧光基团
目的DNA特异序列 （50-150bp）
3’端长波长荧光基团
结果分析： 设阴性对照和4个以上标准品，每个样品3次重复。 以10-15个循环的荧光值或阴性对照荧光值的最高 点作为阈值或基线。
Ct值：产物荧光强度首次超过阈值时，PCR所需的循环数。
CaCl2法是制备感受态细胞最常用的化学方法， E.coli→低温预处理的CaCl2溶液中，造成细胞膨胀， 细胞膜通透性发生变化，易与外源DNA相黏附。 转化方法： CaCl2法（热击法）和电击法。
热击法： 连接液→E.coli感受态细胞→冰上→42℃ 短暂热刺激，外源DNA被细胞吸收。
凝胶浓度高低影响其孔隙大小，浓度越高，孔隙 越小，分辨能力越强。
电泳缓冲液：TAE、TPE、TBE，作用：①稳定体 系的pH值；②使溶液具有一定的导电性；③EDTA 可螯合Mg2+，抑制DNA酶活性，还可防止Mg2+与 核酸生成沉淀。
载样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%蔗糖水溶液。作 用： ①增加样品密度； ②使样品带颜色； ③可预 测泳动速率。 Marker：分子量不同的DNA片段， 作用类似于标尺。
电击法：用电融合仪， E.coli→电极杯，12.515kV/cm、5ms的电脉冲可在细胞膜上造成孔洞， 介质DNA通过孔洞进入细胞质。
经过转化后的细胞在选择培养基上培养，筛选 出带有外源DNA分子的阳性克隆。
筛选方法：抗生素筛选和蓝白斑筛选。
抗生素筛选的原理：利用质粒上的抗生素抗性基因。
2027 bp 1548 bp 1375 bp 947 bp 831 bp
DNA，RNA，蛋白实验操作步骤v2
DNA提取仔细看试剂盒说明书！使用前：1.在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇（加入量看瓶标签）2.若缓冲液GA或GB有沉淀，37℃水浴溶解，摇匀后使用简要步骤如下：1.冻存全血37℃快速融化，取200μL血液加20μL Proteinase K溶液，混匀。
2.加200μL缓冲液GB，颠倒混匀数次，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心。
3.加200μL无水乙醇，振荡混匀15s，可能会有絮状沉淀，瞬时离心。
4.将所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3（吸附柱放入收集管），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
5.向CB3中加入500μL缓冲液GD（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
6.向CB3中加入600μL漂洗液PW（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
7.重复步骤6.8.将CB3放回收集管，12000rpm（~13400g）离心2min，弃废液。
将CB3置于室温放置数分钟，以挥发残留的乙醇。
9.将CB3转入一1.5mL Ep管，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm（~13400g）离心2min，备用。
DNA/RNA浓度测定使用仪器：ND-1000使用方法：1.保持检测区域的清洁。
准备无RNA酶水，使用前润洗点样区1-2次。
2.打开软件，在点样区滴加1μL无RNA酶水，选择核酸种类（DNA/RNA），设置blank。
3.滴加1μL待测样本，记录浓度和纯度。
4.用纸巾擦去样品，再用无RNA酶水清洗1-2次。
5.关闭软件，关闭电脑，将机器盖上防尘布。
DNA PCR扩增反应体系：模板DNA 500ng10*buffer 2.5 μL25mM MgCl2 1.5 μL2.5mM dNTP 2μL10μM引物各0.4μLTaq酶0.25μL补水至25ul反应条件：95℃3min，（94℃30s，60℃30s，72℃30s），35个循环，72℃5minPCR产物2%琼脂糖凝胶电泳1.小胶（1/4）25mL ,中胶（1/2）50 mL ,大胶 100 mL。
医学免疫学实验：DNA、RNA及蛋白质操作技术
液氮研磨，匀浆，加Trizol试剂，进一步破碎 细胞并溶解细胞成分
氯仿抽提，离心，分离水相和有机相
收集水相
异丙醇沉淀，得到比较纯的RNA
RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD 260 和OD280 来判断
• OD 为1时， 相当于浓度为40μg/mL 260
• OD 260 /OD280 如果在1.8-2.0，表示所提制备 2. 多聚（A）RNA的分离与纯化 3. 双链cDNA 的合成
1）单链cDNA 的合成：反转录法 2）第二条cDNA 的合成：碱解或酶解
（RNaseH）法除去RNA分子
4. ds- cDNA与载体DNA 相连
1）人工接头：要求具平端ds- cDNA，酶切时 可能导致某些cDNA链断裂
3. 代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达 亦不相同
4. 不均匀性在同一个cDNA中，不同类型的cDNA分子的数 目是大不相同的，尽管它们获得表达（一般选用的载体都是表达 型的）
• 细菌转化常用方法： CaCl2 法和电击法
Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法
➢ 培养生命活动旺盛的菌体 菌种分纯活化，扩大培养，处于对数生长后期
➢ 沉淀菌体 冰水浴中预冷10分钟，4℃离心
➢ 化合物处理 含CaCl2 无菌预冷缓冲液处理
➢ DNA分子转化感受态细胞
电穿孔转化法
基本原理：
利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进 行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的 有效吸收。
• 再用低盐溶液会蒸馏水洗脱mRNA。 • 经过两次寡聚（dT）-纤维素柱后可得到较高纯度
的mRNA.
cDNA的合成
• 主要包括第一链和第二链cDNA的合成。 • 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录成
DNARNA及蛋白质操作技术
DNARNA及蛋白质操作技术DNA操作技术DNA操作技术广泛应用于生物学研究、医学诊断、犯罪侦查等领域。
下面将介绍几种常见的DNA操作技术。
1.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种重要的DNA操作技术，可以迅速扩增目标DNA序列。
PCR的主要步骤包括：变性、退火和延伸。
首先，将DNA样本加热至95℃，使DNA双链解离为单链；然后，降温至退火温度，引物与目标DNA序列特异性结合；最后，在延伸温度下，DNA聚合酶沿DNA模板合成新的DNA链。
通过不断重复这个循环，可以将目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。
2.DNA测序DNA测序是确定DNA序列的技术。
最早的DNA测序方法是Sanger测序，它利用带有不同标记的ddNTP和dNTP，在DNA合成过程中随机终止，得到不同长度的DNA片段。
这些片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据标记的位置确定序列。
近年来，新一代测序技术的出现大大提高了测序速度和准确性，比如Illumina测序技术。
3.DNA克隆DNA克隆是将目标DNA序列插入载体DNA中的过程。
典型的DNA克隆技术包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
首先，用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，产生能相互配对的粘性末端；然后，用连接酶将两者连接起来；最后，将连接物转化到宿主细胞中，宿主细胞通过复制连接物，使其扩增。
DNA克隆广泛应用于基因工程、蛋白表达和基因治疗等领域。
RNA操作技术RNA是生物体内转录出的中间产物，包括mRNA、rRNA、tRNA等不同类型。
下面将介绍几种常见的RNA操作技术。
1.RNA提取RNA提取是从生物体中分离纯化RNA的过程。
常用的RNA提取方法包括酚-氯仿法、离心柱法和磁珠法等。
其中，酚-氯仿法是最常用的方法，通过酚等有机溶剂和氯仿共同沉淀DNA和蛋白质，使RNA在上清液中得到富集。
2.RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）RT-PCR是将RNA转录为cDNA，并利用PCR扩增cDNA的技术。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
DNA分子通过RNA指导蛋白质的合成人教版高一年级生物课堂教辅PPT
4.转录的过程示意图
5.结果:通过转录,DNA分子上的遗传信息传递到 mRNA 上,然后 mRNA 通 过核孔进入细胞质。
二、遗传信息的翻译 1.遗传密码 (1)密码子:科学家把mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的核苷酸称为一 个密码子。 (2)表示方法:通常以密码子中的碱基表示遗传密码。 (3)密码子总个数:64个。 (4)负责编码20种氨基酸的密码子个数:61个。
5.过程 第1步 mRNA进入细胞质,与核糖体结合。携带甲硫氨酸(Met)的tRNA,通 过与碱基AUG互补配对,进入第一位置。
第2步 携带异亮氨酸(Ile)的 tRNA 以同样的方式进入第二位置。
第3步 甲硫氨酸通过与异亮氨酸形成肽键而转移到占据第二位置的 tRNA上。
第4步 核糖体读取下一个密码子,原来占据第一位置的tRNA离开核糖体, 占据第二位置的tRNA进入第一位置,一个新的携带甘氨酸(Gly)的tRNA进 入第二位置,继续肽链的合成。
预习反馈 1.判断正误。 (1)转录的产物只是mRNA。( × ) (2)一种基因只能以某条链为模板进行转录,而承载有多个基因的完整DNA 分子的两条链都有可能成为转录的模板。( √ ) (3)DNA都具有双链结构,RNA都是单链结构,没有碱基对。( × ) (4)细胞中的RNA合成过程不会在细胞核外发生。( × ) (5)细胞中有多种tRNA,一种tRNA只能转运一种氨基酸。( √ ) (6)一个tRNA分子中只有一个反密码子。( √ ) (7)mRNA在核糖体上移动翻译出蛋白质。( × ) (8)在蛋白质合成过程中,密码子都决定氨基酸。( × )
(1)图中①⑤⑥分别表示什么物质? 答案 DNA RNA聚合酶 RNA (2)②与③表示的是同一种物质吗?它们的主要区别是什么? 答案 不是,②是脱氧核苷酸,③是核糖核苷酸。②含有脱氧核糖,③含有核 糖。
现代分子生物学课后答案(朱玉贤_第
第五章分子生物学研究法（上）------DNA RNA及蛋白质操作技术1. 简述PCR技术。
课本P165.2 .简述核酸的凝胶电泳。
答：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。
某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。
在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。
将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极 -正极移动。
在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide 染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
3. 什么是south 杂交？指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程第七章基因的表达与调控（上）---- 原核基因表达调控模式1.简述代谢物对基因表达调控的两种方式。
① 转录水平上的调控(transcriptional regulation) ；② 转录水平上的调控(post-transcriptional regulation) ，包括mRNA 加工成熟水平上的调控(differen,tial processing of RNA transcript和翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。
3.简述乳糖操纵子的调控模型。
A、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列0, —个启动子P和一个调节基因I。
B、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。
DNArna实验知识点
DNArna实验知识点1. 引言DNArna实验是生物学研究中常用的一种实验方法，通过转录过程将DNA转化为RNA，进一步揭示基因的功能和表达方式。
本文将介绍DNArna实验的基本原理、实验步骤以及相关技术。
2. 基本原理DNArna实验基于中心法则，即DNA通过转录作用形成RNA，然后通过翻译作用转化为蛋白质。
转录是DNA信息传导的第一步，通过RNA聚合酶酶催化下，DNA的双链解旋并与核苷酸配对形成mRNA。
这一过程的关键是选择性地复制DNA的部分区域，从而决定了转录产物的种类和数量。
3. 实验步骤DNArna实验主要包括DNA提取、逆转录、PCR扩增、细胞培养和蛋白质检测等步骤。
下面将介绍每个步骤的具体操作：步骤1：DNA提取•从目标生物体中提取DNA，常用方法包括酚/氯仿法、离心法等。
这一步骤的目的是从细胞中分离出DNA，并去除其他的细胞成分。
步骤2：逆转录•将DNA转化为cDNA（亦称为逆转录过程），这一步骤主要依靠逆转录酶的作用。
逆转录酶能够将RNA-DNA复合物中的RNA分子替换为DNA 分子，生成cDNA。
步骤3：PCR扩增•使用聚合酶链反应（PCR）扩增cDNA。
PCR是一种体外合成DNA的技术，能够快速而特异地扩增目标DNA序列。
通过PCR扩增，可以大量复制目标基因序列，为后续的分析和检测提供充足的材料。
步骤4：细胞培养•将PCR扩增得到的cDNA插入到目标细胞中，培养出细胞系，以便进一步分析其基因表达情况。
细胞培养的条件需要根据具体实验目的进行优化，并确保细胞的生长和表达状态。
步骤5：蛋白质检测•使用蛋白质检测技术，如Western blotting或ELISA等，对目标蛋白质进行检测。
这些技术能够定量和鉴定目标蛋白质的表达水平，从而对基因的功能进行进一步分析。
4. 相关技术DNArna实验的基本步骤可以结合多种相关技术进行优化和扩展。
以下列举一些常用的相关技术：•单细胞分析：利用单细胞技术，可以研究细胞间的差异性，揭示单个细胞的基因表达状况，并探索细胞发育和疾病发展的机制。
现代分子生物学(第四版)朱玉贤课件 PPT 第1章 绪论
主要教材与参考书
1.《现代分子生物学》 第3版（2007）朱玉贤、李毅、郑晓峰
2. 现代生物学精要(Instant Notes)系列 《分子生物学》第二版（2002）刘进元 《Molecular Biology》2e P.C.turner,et al 3. Principles of Biochemistry
1994 Gilman Rodbell 美国
1995
Lewis Nusslein-Volhard Wieschaus
美国 德国 美国
建立DNA测序方法
诺贝尔生理医学奖
建立和发展了单克隆抗体技术
诺贝尔生理医学奖
发现可移动癌基因
诺贝尔化学奖 诺贝尔生理医学奖
G蛋白在细胞内信息传导中的作用 诺贝尔生理医学奖
发现了控制果蝇体节发育的基因
诺贝尔生理医学奖
年份
科学家
Doherty 1996 Zinkernagel
国籍
澳 瑞士
1997 Prusiner
美
Furchgott
美
1998
Ignarro Murad
1999 Blobel
美
Carlsson
德
2000 Greengard
预计到2020年，生物医药占全球药品的比重 将超过1/3，生物质能源占世界能源消费的比 重将达5%左右，生物基材料将替代10%-20%的 化学材料。
生物制造、生物能源、生物环保等一 批新兴产业正在快速形成。
据Ernst＆Young研究报告，2010年生 物环境、生物工业处理、生物海洋技术世界市 场规模将达到 134亿美元、327亿美元、288 亿美元。
生物植物DNA、RNA及蛋白的提取与分析ppt课件
讨论？
1、样品不纯 2、样品降解 3、样品得率低 4、样品电泳时检测不到条带
一、DNA样品不纯
原 因
1. DNA中含有蛋白、糖类、 酚类杂质
2. DNA在溶解前，有酒精残 留，酒精抑制后续酶解反
对
应
策
3. DNA中残留有金属离子
1. 重新抽提DNA，去除蛋 白、糖类、酚类等杂 质
2. 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发后再溶解
3. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 4. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高
灭菌 5. 将DNA分装保存于缓冲液中，避免
复冻融
三、DNA提取量少
原 因
1. 实验材料不佳或量少
2. 破壁或裂解不充分 对
3. 沉淀不完全
策
4. 洗涤时DNA丢失
1. 尽量选用新Байду номын сангаас（幼嫩）的材料 2. 液氮研磨充分，适当延长裂
干燥溶解
注意事项
1. 所有用品均需要高温高压，以灭活 残余的DNA酶。
2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。 3. 在提取过程，应尽量在温和的条件
下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混 匀过程要轻缓, 以保证得到较长的 DNA。
DNA的质量检测
电泳 带型单一无拖尾现象 点样孔无残留杂质
TRI Reagent提取步骤
1. 研钵研杵预冷后,加入少量样品用液N迅速研 磨成冰粉状
2. 将样品（样品量不超过100mg)移入1.5mlEP管 中,迅速加入1mlTRI Reagent混匀,室温静置 5min
3. 加0.2ml氯仿,剧烈振荡15S,室温静置10min 4. 4℃,12000g,15min;取上清于另一EP管中，加
生物课件植物dna、rna及蛋白的提取与分析
通过将蛋白质离子化并测量其质量，对蛋白质进行鉴定和定量分析。
DNA、RNA及蛋白在生物科学研究中的应用
基因组学研究
通过对基因组进行测序和分析， 研究基因组的组成、结构和功能，
揭示生物体的遗传特征和进化关 系。
转录组学研究
通过对mRNA进行定量分析，研究 基因的表达调控机制，揭示生物体 的生理和病理过程。
优化提取条件
可以通过调整试剂浓度、温度 、时间等参数来优化提取效果
。
02
CHAPTER
植物RNA的提取
RNA提取的基本原理
核酸是生物体内重要的遗传物质，RNA作为核酸的一种，在生物体的生命活动中 起着重要的作用。RNA提取的基本原理是利用RNA在细胞中的稳定性和其在碱 性环境下易与蛋白质分离的特性，将RNA从细胞中分离出来。
选择合适的分离方法
根据实际情况选择合适的离心分离或膜分 离等方法，以提高蛋白质的纯度和分离效 果。
04
CHAPTER
DNA、RNA及蛋白的分析 与应用
DNA、RNA及蛋白的分析方法
基因组测序
通过高通量测序技术，对整个基因组 进行测序，获取基因组的序列信息。
荧光定量PCR
利用荧光染料或荧光标记的特异性探 针，对DNA片段进行定量分析。
根据实验目的和要求选择新鲜、健康的植 物组织，以保证提取的蛋白质质量和数量 。
优化实验条件
根据实际情况对实验条件进行优化，如温 度、pH值、离子强度等，以提高蛋白质 的提取效率和纯度。
控制破碎条件
破碎细胞时要注意控制破碎时间和力度， 避免过度破碎导致蛋白质降解。
注意操作细节
在去除杂质和浓缩干燥过程中要注意操作 细节，避免损失和污染。
生物课件植物DNA、RNA及蛋白的提取与分析
03
吸附法
利用硅藻土或玻璃纤维等介质吸附DNA，再通过洗涤和 洗脱得A的稳定性
DNA分子在细胞核中以染色质或去氧 核糖核酸（DNA）的形式稳定存在， 通过适当的裂解条件可以将其释放出 来。
细胞裂解
DNA纯化
硅藻土法
将植物组织研磨后与硅藻土混合，离心后取 上清液，再通过离心分离得到RNA。
D
植物RNA提取的原理
01
植物组织中的RNA与蛋白质结合形成核蛋白复合物，需 要在酸性或碱性条件下将其分离。
02
利用不同的化学物质与RNA结合，通过离心分离得到纯 化的RNA。
03
在提取过程中需要去除DNA和蛋白质等杂质，以保证提 取到的RNA纯度。
植物RNA提取的应用
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02
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基因表达分析
提取到的RNA可用于反转 录成cDNA，进行基因表 达分析。
转录组学研究
提取到的RNA可用于测序 分析，研究植物的转录组 学。
分子生物学实验
提取到的RNA可用于分子 生物学实验，如实时荧光 定量PCR、Northern blot等。
03 植物蛋白的提取
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04 DNA、RNA及蛋白的分析
DNA、RNA及蛋白的分析方法
DNA分析方法
生物进化研究
通过对不同物种的DNA、 RNA和蛋白质进行分析， 了解生物进化历程和物种 间的亲缘关系。
DNA ,RNA及蛋白质操作技术
（二）基因克隆的载体
1、pSC101质粒载体
• 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、 HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等 7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、 BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr 失活。
pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基 因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用 X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。
具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末 端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到 pUC8质粒载体上。
5、 pGEM-3Z质粒
第五章 分子生物学研究法 （上）DNA、RNA及蛋白质操作技术
扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你
的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象， 否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本 的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否 则，你就不可能走在别人的前面。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转 化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点 突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。
图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及 其酶切末端。
图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体
多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程
单核苷酸5‘-磷酸基团向核酸链的3’-OH发起进攻
RE 切割随机DNA分子（假定4种碱基在DNA中均匀 分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n 来计 算，如一个6碱基切割酶平均每4096 bp核DNA有一 个酶切位点（46），而一个4碱基切割酶平均每256 bp核DNA就有一个酶切位点（44）。
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DNA连接酶： DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用
T4DNA ligase. （一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘 性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。 （二）来源－噬菌体T4感染E. coli分离的一种单链多 肽酶、MW.68KD。 （三）催化反应：
只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之 象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。
3. 将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠 （同正常一样），最后产下多利。
这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。
胚胎细胞克隆: 体细胞克隆
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在这个过程中： 1.“基因剪刀” DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像
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掌握
1. 几种抗生素的英文缩写 2. 多克隆位点的概念 3. 大肠杆菌蓝白斑筛选原理 4. 普通PCR的扩增原理和过程
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Thank you!
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水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 可以阻止四环素进入细胞。 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之
失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物） 失活
（5）hygr
潮霉素β磷酸转移酶 使潮霉素β失活。
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3. 多 克 隆 位 点 （ multiple cloining site，MCS）
①拷贝数多，10-200个，分子量小。 ②复制不受宿主细菌复制系统的限制，其拷贝数猛增 至 1000-3000之多，该性质多基因工程技术十分有利。
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2. 抗生素抗性基因：
（genotype）
编码产物
功能（phenotype）
（1）Ampr （2）tetr （3）camr
酶 1个膜蛋白 乙酰转乙酶
下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出 绿色荧光的蛋白质，即绿色荧光蛋白。随后，马丁•沙尔菲在利用绿色荧光 蛋白做生物示踪分子方面做出了贡献；钱永健让科学界更全面地理解绿色 荧光蛋白的发光机理，他还拓展了绿色以外的其他颜色荧光蛋白，为同时 追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。
（1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体
3.按载体来源分
4.按克隆片段得大小 （克隆能力）分
病毒载体＋
(1)<1kb (2)<10kb (3)<22kb (4)<50kb (5)0.1-0.4Mb (6)0.5-2Mb
PUC8 PBUDCE41 YE
(1)M13 (2)plasmid (3)λphage (4)casmid (5)BAC (6)YAC
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2500 V, ~6 ms
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20 世 纪 80 年 代 ， Kary B. Mullis 发明 该 技 术 。 1993 获 得 Nobel Prize。
Kary B. Mullis (1944 -)
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3. 当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融 合。突破是线性的，即从研究开发新一代的科技 成果取代原有一代科技成果。融合是非线性的， 即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品， 造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。如： XX的技术集成。
基因工程既是科学又是技术，既是突破，又 是融合。她是分子遗传学，生物化学，细胞学， 细胞生物学，分子生物学相互渗透，交叉融合、 突破的结果。
一根“缝纫针”，使二者连在一起
3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比使乘客，车子
把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息， 春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治 疗（IL2/LAK→抗癌）。
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“基因剪刀”－限制性内切酶的发明
（1）20世纪40－60年代，科学家们就为 基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大 的dsDNA束手无策，无从下手把它切成单个 基因片断。
hptII gene
XhoI (9677)
CaM V 3'UTR
M CS(854-953)
SalI (949)
Link e r(9 5 4 -9 9 8 ) nLUC(9 9 9 -2 2 4 6 )
LB
Pst I (2252)
Kanmycin resistance gene
p C AMBIA1 3 0 0 -n LU C
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The Nobel Prize in Chemistry 2008
“for the discovery and development of the green
fluorescent protein, GFP”
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien 钱永健
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多利
1997.2.23，Nature杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯 林研究所和PPL生物技术公司已经成功克隆了一只名叫 多利的绵羊（1997－2003/7/12）。这一消息的公布， 全世界震惊的程度不亚于原子弹在长崎和广岛的爆炸， 在全球引起了轩然大波，以至世人惊呼：不要让科学疯 狂！
为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢?
（二）功能 基因工程中主要用于逆转录mRNA→cDNA （complementory DNA）。
（三）商品化逆转录酶有两种 ①AMV（禽成髓细胞瘤） ②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。
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载体
一．载体的概念： 1.要把一个有用的基因通过基因工程手段送
到受体细胞，需要运载工具携带外源基因进入受 体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子； （2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。 （3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）
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三、逆转录酶
（一）概述 逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的DNA 聚合酶。是由Baltimove和Mizutan于1970年分别各自 发现的，这两个小组论文同时在同一期Nature上，可 见其意义。该酶在逆转录病毒（retro virus）生产循 环中起主宰作用。
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PCR仪
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PCR仪
琼脂糖凝胶电泳
3-4 小时
最终产物
紫外光观察 73
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Log Target DNA
PCR 产物积累规律
Theoretical
Real Life
Cycle
PCR扩增中的“平台效应”，导致常规PCR技术对 最终产物总量定量的不可靠性。
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命名原则: HindⅢ
Haemophilus influenzae d菌株 流感嗜血杆菌d菌株的第3种酶
属 种 菌株 序
① 第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写；
② 第2、3个字母是细菌种名的前两个字母，要小 写；
上述字母都是用斜体。
③ 接着是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书
写；
④ 如果同一菌株有不同的内切酶时，按发现次序
第八讲 分子生物学研究方法
--DNA、RNA及蛋白质操作技术（1）
刘志鹏
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内容
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA 基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
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没有学习的创新是白日梦， 没有创新的学习是噩梦。
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实验室的两个基本原则
1.学会对照 CK+ CK2.学会调整
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科学技术发展的综合化
1. 19世纪中叶以前，科学与技术是 分离的，它们各有独自文化传统，它们的 发展往往是脱节的。
2. 科学回答“是什么”“为什么”， 技术回答“做什么”“怎么做”。当今科 技发展已经密不可分，科学里包含技术， 技术里体现科学。
分别 用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……表示。
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识别序列：
每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切 割的特异序列，称为限制性位点或切点（4~8bp）。
识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
即反向重复结构，其两侧核苷酸排列呈回文对称的 序列。
BamHⅠ
GGA TCC CCT AGG
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如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时， 产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的 DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
原因是此克隆非彼克隆，多利取自功能彻底分化的成年
动物乳腺细胞，即体细胞。它推翻了遗传学上一条上百
年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个
体。
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多利诞生的过程 为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以
及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基因备用。 2. 取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一
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载体的构成
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1. Ori－复制起始点（origin，ori） （1）决定质粒自我增殖和拷贝数的主要元件。 （2）使繁殖后细胞维持一定量的拷贝数。 （3）一个质粒只含一个ori，构成一个独立的复制子。 （4）穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两 类细胞中都能扩增。 （5）基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产 品。 松弛复制子的特点