第 8 讲 DNA RNA 蛋白质操作技术(1)
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26
DNA连接酶： DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用
T4DNA ligase. （一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘 性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。 （二）来源－噬菌体T4感染E. coli分离的一种单链多 肽酶、MW.68KD。 （三）催化反应：
只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之 象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。
3. 将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠 （同正常一样），最后产下多利。
这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。
胚胎细胞克隆: 体细胞克隆
12
13
在这个过程中： 1.“基因剪刀” DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像
79
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90
91
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掌握
1. 几种抗生素的英文缩写 2. 多克隆位点的概念 3. 大肠杆菌蓝白斑筛选原理 4. 普通PCR的扩增原理和过程
93
Thank you!
94
水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 可以阻止四环素进入细胞。 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之
失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物） 失活
（5）hygr
潮霉素β磷酸转移酶 使潮霉素β失活。
33
3. 多 克 隆 位 点 （ multiple cloining site，MCS）
①拷贝数多，10-200个，分子量小。 ②复制不受宿主细菌复制系统的限制，其拷贝数猛增 至 1000-3000之多，该性质多基因工程技术十分有利。
32
2. 抗生素抗性基因：
（genotype）
编码产物
功能（phenotype）
（1）Ampr （2）tetr （3）camr
酶 1个膜蛋白 乙酰转乙酶
下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出 绿色荧光的蛋白质，即绿色荧光蛋白。随后，马丁•沙尔菲在利用绿色荧光 蛋白做生物示踪分子方面做出了贡献；钱永健让科学界更全面地理解绿色 荧光蛋白的发光机理，他还拓展了绿色以外的其他颜色荧光蛋白，为同时 追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。
（1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体
3.按载体来源分
4.按克隆片段得大小 （克隆能力）分
病毒载体＋
(1)<1kb (2)<10kb (3)<22kb (4)<50kb (5)0.1-0.4Mb (6)0.5-2Mb
PUC8 PBUDCE41 YE
(1)M13 (2)plasmid (3)λphage (4)casmid (5)BAC (6)YAC
54
2500 V, ~6 ms
55
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59
20 世 纪 80 年 代 ， Kary B. Mullis 发明 该 技 术 。 1993 获 得 Nobel Prize。
Kary B. Mullis (1944 -)
/
60
61
8
3. 当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融 合。突破是线性的，即从研究开发新一代的科技 成果取代原有一代科技成果。融合是非线性的， 即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品， 造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。如： XX的技术集成。
基因工程既是科学又是技术，既是突破，又 是融合。她是分子遗传学，生物化学，细胞学， 细胞生物学，分子生物学相互渗透，交叉融合、 突破的结果。
一根“缝纫针”，使二者连在一起
3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比使乘客，车子
把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息， 春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治 疗（IL2/LAK→抗癌）。
14
15
“基因剪刀”－限制性内切酶的发明
（1）20世纪40－60年代，科学家们就为 基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大 的dsDNA束手无策，无从下手把它切成单个 基因片断。
hptII gene
XhoI (9677)
CaM V 3'UTR
M CS(854-953)
SalI (949)
Link e r(9 5 4 -9 9 8 ) nLUC(9 9 9 -2 2 4 6 )
LB
Pst I (2252)
Kanmycin resistance gene
p C AMBIA1 3 0 0 -n LU C
49
50
51
The Nobel Prize in Chemistry 2008
“for the discovery and development of the green
fluorescent protein, GFP”
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien 钱永健
9
多利
1997.2.23，Nature杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯 林研究所和PPL生物技术公司已经成功克隆了一只名叫 多利的绵羊（1997－2003/7/12）。这一消息的公布， 全世界震惊的程度不亚于原子弹在长崎和广岛的爆炸， 在全球引起了轩然大波，以至世人惊呼：不要让科学疯 狂！
为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢?
（二）功能 基因工程中主要用于逆转录mRNA→cDNA （complementory DNA）。
（三）商品化逆转录酶有两种 ①AMV（禽成髓细胞瘤） ②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。
28
载体
一．载体的概念： 1.要把一个有用的基因通过基因工程手段送
到受体细胞，需要运载工具携带外源基因进入受 体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子； （2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。 （3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）
27
三、逆转录酶
（一）概述 逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的DNA 聚合酶。是由Baltimove和Mizutan于1970年分别各自 发现的，这两个小组论文同时在同一期Nature上，可 见其意义。该酶在逆转录病毒（retro virus）生产循 环中起主宰作用。
62
63
64
65
66
67
68
69
70
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PCR仪
72
PCR仪
琼脂糖凝胶电泳
3-4 小时
最终产物
紫外光观察 73
74
75
76
77
78
Log Target DNA
PCR 产物积累规律
Theoretical
Real Life
Cycle
PCR扩增中的“平台效应”，导致常规PCR技术对 最终产物总量定量的不可靠性。
19
命名原则: HindⅢ
Haemophilus influenzae d菌株 流感嗜血杆菌d菌株的第3种酶
属 种 菌株 序
① 第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写；
② 第2、3个字母是细菌种名的前两个字母，要小 写；
上述字母都是用斜体。
③ 接着是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书
写；
④ 如果同一菌株有不同的内切酶时，按发现次序
第八讲 分子生物学研究方法
--DNA、RNA及蛋白质操作技术（1）
刘志鹏
1
2
内容
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA 基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
3
没有学习的创新是白日梦， 没有创新的学习是噩梦。
4
实验室的两个基本原则
1.学会对照 CK+ CK2.学会调整
5
6
7
科学技术发展的综合化
1. 19世纪中叶以前，科学与技术是 分离的，它们各有独自文化传统，它们的 发展往往是脱节的。
2. 科学回答“是什么”“为什么”， 技术回答“做什么”“怎么做”。当今科 技发展已经密不可分，科学里包含技术， 技术里体现科学。
分别 用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……表示。
20
识别序列：
每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切 割的特异序列，称为限制性位点或切点（4~8bp）。
识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
即反向重复结构，其两侧核苷酸排列呈回文对称的 序列。
BamHⅠ
GGA TCC CCT AGG
21
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时， 产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的 DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
原因是此克隆非彼克隆，多利取自功能彻底分化的成年
动物乳腺细胞，即体细胞。它推翻了遗传学上一条上百
年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个
体。
10
11
多利诞生的过程 为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以
及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基因备用。 2. 取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一
30
载体的构成
31
1. Ori－复制起始点（origin，ori） （1）决定质粒自我增殖和拷贝数的主要元件。 （2）使繁殖后细胞维持一定量的拷贝数。 （3）一个质粒只含一个ori，构成一个独立的复制子。 （4）穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两 类细胞中都能扩增。 （5）基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产 品。 松弛复制子的特点
11800 bp
RBS-S-3'
HindIII (2894)
Eco RV (8282)
RB
pBR322 ori bom site
NotI (6932) ClaI (6314)
pV S 1 -RE P
NotI (4110)
STA region
NotI (5642)
35
1、常用种类
大肠杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞
2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以 插入或克隆DNA片段统称为vector。
3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子， 是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。
29
分类依据
载体的分类
类
别
克隆扩增或表达
举例
1.按功能分成
（1）克隆载体
√
（2）表达载体
√
PBR322 PCDN3
2.按进入受体细胞类 型分
17
18
限制酶的切割位点：
限制性对dsDNA 2条链同时切割产生3种不同切 口：
1．形成平头末端（flush或bluntend） 2. 形成5’－粘性末端 （5’-cohesive end即3’延伸末端） 3. 形成3’－粘性末端（3’-cohesive end）
粘性末端（sticky end）—限制酶切割产生2个突 出的末端称之，作用是放在一起自发形成双链。
是多个限制酶识别的一段DNA顺序，以 便插入外源基因或DNA片段.
34
Eco RI (1)
NcoI (317)
CaMV 35S
Eco RV (10906) XhoI (10771)
CaMV 35S
Eco RV (753) Sac I (859) KpnI (865) BamHI (870) XhoI (941)
（2）当时的酶学知识已有相当的发展， 但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。
16
（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血 杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯 化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工 程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基 因工程奠定了最为重要的技术基础。
宿主细胞
2、导入方式
转化（transformation）细菌 转染（transfection） 真核生物 转导（transduction） 噬菌体、病毒
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40
41
42
43
44
45
蓝白斑筛选
46
47
48
宿主（DH5r）和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们 同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基 因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因 区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
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DNA连接酶： DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用
T4DNA ligase. （一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘 性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。 （二）来源－噬菌体T4感染E. coli分离的一种单链多 肽酶、MW.68KD。 （三）催化反应：
只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之 象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。
3. 将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠 （同正常一样），最后产下多利。
这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。
胚胎细胞克隆: 体细胞克隆
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在这个过程中： 1.“基因剪刀” DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像
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掌握
1. 几种抗生素的英文缩写 2. 多克隆位点的概念 3. 大肠杆菌蓝白斑筛选原理 4. 普通PCR的扩增原理和过程
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Thank you!
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水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 可以阻止四环素进入细胞。 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之
失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物） 失活
（5）hygr
潮霉素β磷酸转移酶 使潮霉素β失活。
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3. 多 克 隆 位 点 （ multiple cloining site，MCS）
①拷贝数多，10-200个，分子量小。 ②复制不受宿主细菌复制系统的限制，其拷贝数猛增 至 1000-3000之多，该性质多基因工程技术十分有利。
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2. 抗生素抗性基因：
（genotype）
编码产物
功能（phenotype）
（1）Ampr （2）tetr （3）camr
酶 1个膜蛋白 乙酰转乙酶
下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出 绿色荧光的蛋白质，即绿色荧光蛋白。随后，马丁•沙尔菲在利用绿色荧光 蛋白做生物示踪分子方面做出了贡献；钱永健让科学界更全面地理解绿色 荧光蛋白的发光机理，他还拓展了绿色以外的其他颜色荧光蛋白，为同时 追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。
（1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体
3.按载体来源分
4.按克隆片段得大小 （克隆能力）分
病毒载体＋
(1)<1kb (2)<10kb (3)<22kb (4)<50kb (5)0.1-0.4Mb (6)0.5-2Mb
PUC8 PBUDCE41 YE
(1)M13 (2)plasmid (3)λphage (4)casmid (5)BAC (6)YAC
54
2500 V, ~6 ms
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20 世 纪 80 年 代 ， Kary B. Mullis 发明 该 技 术 。 1993 获 得 Nobel Prize。
Kary B. Mullis (1944 -)
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3. 当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融 合。突破是线性的，即从研究开发新一代的科技 成果取代原有一代科技成果。融合是非线性的， 即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品， 造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。如： XX的技术集成。
基因工程既是科学又是技术，既是突破，又 是融合。她是分子遗传学，生物化学，细胞学， 细胞生物学，分子生物学相互渗透，交叉融合、 突破的结果。
一根“缝纫针”，使二者连在一起
3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比使乘客，车子
把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息， 春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治 疗（IL2/LAK→抗癌）。
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“基因剪刀”－限制性内切酶的发明
（1）20世纪40－60年代，科学家们就为 基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大 的dsDNA束手无策，无从下手把它切成单个 基因片断。
hptII gene
XhoI (9677)
CaM V 3'UTR
M CS(854-953)
SalI (949)
Link e r(9 5 4 -9 9 8 ) nLUC(9 9 9 -2 2 4 6 )
LB
Pst I (2252)
Kanmycin resistance gene
p C AMBIA1 3 0 0 -n LU C
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The Nobel Prize in Chemistry 2008
“for the discovery and development of the green
fluorescent protein, GFP”
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien 钱永健
9
多利
1997.2.23，Nature杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯 林研究所和PPL生物技术公司已经成功克隆了一只名叫 多利的绵羊（1997－2003/7/12）。这一消息的公布， 全世界震惊的程度不亚于原子弹在长崎和广岛的爆炸， 在全球引起了轩然大波，以至世人惊呼：不要让科学疯 狂！
为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢?
（二）功能 基因工程中主要用于逆转录mRNA→cDNA （complementory DNA）。
（三）商品化逆转录酶有两种 ①AMV（禽成髓细胞瘤） ②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。
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载体
一．载体的概念： 1.要把一个有用的基因通过基因工程手段送
到受体细胞，需要运载工具携带外源基因进入受 体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子； （2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。 （3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）
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三、逆转录酶
（一）概述 逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的DNA 聚合酶。是由Baltimove和Mizutan于1970年分别各自 发现的，这两个小组论文同时在同一期Nature上，可 见其意义。该酶在逆转录病毒（retro virus）生产循 环中起主宰作用。
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63
64
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68
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71
PCR仪
72
PCR仪
琼脂糖凝胶电泳
3-4 小时
最终产物
紫外光观察 73
74
75
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Log Target DNA
PCR 产物积累规律
Theoretical
Real Life
Cycle
PCR扩增中的“平台效应”，导致常规PCR技术对 最终产物总量定量的不可靠性。
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命名原则: HindⅢ
Haemophilus influenzae d菌株 流感嗜血杆菌d菌株的第3种酶
属 种 菌株 序
① 第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写；
② 第2、3个字母是细菌种名的前两个字母，要小 写；
上述字母都是用斜体。
③ 接着是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书
写；
④ 如果同一菌株有不同的内切酶时，按发现次序
第八讲 分子生物学研究方法
--DNA、RNA及蛋白质操作技术（1）
刘志鹏
1
2
内容
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA 基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
3
没有学习的创新是白日梦， 没有创新的学习是噩梦。
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实验室的两个基本原则
1.学会对照 CK+ CK2.学会调整
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科学技术发展的综合化
1. 19世纪中叶以前，科学与技术是 分离的，它们各有独自文化传统，它们的 发展往往是脱节的。
2. 科学回答“是什么”“为什么”， 技术回答“做什么”“怎么做”。当今科 技发展已经密不可分，科学里包含技术， 技术里体现科学。
分别 用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……表示。
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识别序列：
每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切 割的特异序列，称为限制性位点或切点（4~8bp）。
识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
即反向重复结构，其两侧核苷酸排列呈回文对称的 序列。
BamHⅠ
GGA TCC CCT AGG
21
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时， 产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的 DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
原因是此克隆非彼克隆，多利取自功能彻底分化的成年
动物乳腺细胞，即体细胞。它推翻了遗传学上一条上百
年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个
体。
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多利诞生的过程 为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以
及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基因备用。 2. 取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一
30
载体的构成
31
1. Ori－复制起始点（origin，ori） （1）决定质粒自我增殖和拷贝数的主要元件。 （2）使繁殖后细胞维持一定量的拷贝数。 （3）一个质粒只含一个ori，构成一个独立的复制子。 （4）穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两 类细胞中都能扩增。 （5）基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产 品。 松弛复制子的特点
11800 bp
RBS-S-3'
HindIII (2894)
Eco RV (8282)
RB
pBR322 ori bom site
NotI (6932) ClaI (6314)
pV S 1 -RE P
NotI (4110)
STA region
NotI (5642)
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1、常用种类
大肠杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞
2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以 插入或克隆DNA片段统称为vector。
3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子， 是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。
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分类依据
载体的分类
类
别
克隆扩增或表达
举例
1.按功能分成
（1）克隆载体
√
（2）表达载体
√
PBR322 PCDN3
2.按进入受体细胞类 型分
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限制酶的切割位点：
限制性对dsDNA 2条链同时切割产生3种不同切 口：
1．形成平头末端（flush或bluntend） 2. 形成5’－粘性末端 （5’-cohesive end即3’延伸末端） 3. 形成3’－粘性末端（3’-cohesive end）
粘性末端（sticky end）—限制酶切割产生2个突 出的末端称之，作用是放在一起自发形成双链。
是多个限制酶识别的一段DNA顺序，以 便插入外源基因或DNA片段.
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Eco RI (1)
NcoI (317)
CaMV 35S
Eco RV (10906) XhoI (10771)
CaMV 35S
Eco RV (753) Sac I (859) KpnI (865) BamHI (870) XhoI (941)
（2）当时的酶学知识已有相当的发展， 但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。
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（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血 杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯 化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工 程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基 因工程奠定了最为重要的技术基础。
宿主细胞
2、导入方式
转化（transformation）细菌 转染（transfection） 真核生物 转导（transduction） 噬菌体、病毒
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37
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40
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43
44
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蓝白斑筛选
46
47
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宿主（DH5r）和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们 同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基 因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因 区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。