DNA、RNA及蛋白质操作技术
现代分子生物实验技术PPT(上)
3. Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数(Log值）存在线 性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数， 横坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准 曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
• 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合 适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有 重nomic library: a storable collection of cellular clones that contains copies of every sequence in the whole genome inserted into a suit基因, 也可以克隆调控基因, 有利于研究基因的结构、功 能和调控机理。
常用的琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液 Tris-乙酸 （TAE） 工作溶液 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA 贮 存 液（1000 ml） 50×: 242g Tris 57.1ml冰乙酸 100ml0.5mol/L EDTA （pH8.0） 10×: 108g Tris 15.5ml85%磷酸（ 1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0） 5×: 54g Tris 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0）
核酸电泳技术要点
• 制备凝胶：准确称取琼脂糖粉末，以电泳缓冲液（ TAE/TBE）溶解，微波加热至沸腾，待温度降至约60℃ 时，加EB液，混匀后，迅速倒入预先制好胶槽内。 • 电泳：随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分 子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的 DNA可以5-20 V/cm电压电泳。
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
TRIzol法同时提取RNA,DNA,蛋白质
TRIzol法同时提取RNA,,蛋白质TRIzol法同时提取RNA,,TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\\．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收；用异丙醇沉淀有机相可回收。
TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。
对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。
分离的总RNA无和污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。
在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。
共纯化的可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。
可用于Western Blotting。
规格：100ml 黄色透明液体储存条件：2-8℃避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。
如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。
忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。
预防RNase污染注意事项：1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。
2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。
分子生物学研究法上DNARNA及蛋白质操作技术分子生物精选全文
可编辑修改精选全文完整版第五章分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。
因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分，只不过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。
事实上，这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。
本章将在回顾重组DNA技术发展史的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆、表达分析技术及蛋白质组学、单核苷酸多态性分析等现代生物学领域里最广泛应用的实验技术和方法。
5. 1 重组DNA技术史话近半个多世纪来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，概括地说，主要有三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
但是，由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。
事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。
因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease，RE）和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接，所以，科学家认为，这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件（表5-1）。
高中生物中图版(2023)生物技术实践第六单元蛋白质和DNA技术 第6章第2节
第二节DNA片段的扩增——PCR技术一、DNA在细胞内的复制1．所需的酶：解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。
2．引物：一段RNA。
3．原料：四种脱氧核苷酸。
4．原则：碱基互补配对原则。
二、PCR技术的过程1．把PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2＋等成分加入到微量离心管中。
2．把离心管置于95℃的高温中，使DNA碱基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成为两条单链。
3．将离心管置于55℃的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。
4．再将离心管转置于72℃的环境中，在DNA聚合酶的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端进行顺次连接，从而形成两条新的子链。
这样高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤便构成了PCR过程的一个循环。
三、实验操作1．准备(1)为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
(2)如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为95℃、55℃和72℃，然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。
2．扩增3．检测利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。
即：DNA的浓度(μg/mL)＝错误!×稀释倍数。
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、DNA复制(体内)与PCR技术(体外)体内复制PCR反应不同点解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至95 ℃左右，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA 单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次温度体内温和条件高温(可变)相同点①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料③都需要一定的缓冲溶液④子链延伸的方向都是从5′端到3′端①解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。
第 8 讲 DNA RNA 蛋白质操作技术(1)
23
24
25
26
DNA连接酶： DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用
T4DNA ligase. （一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘 性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。 （二）来源－噬菌体T4感染E. coli分离的一种单链多 肽酶、MW.68KD。 （三）催化反应：
只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之 象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。
3. 将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠 （同正常一样），最后产下多利。
这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。
胚胎细胞克隆: 体细胞克隆
12
13
在这个过程中： 1.“基因剪刀” DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
掌握
1. 几种抗生素的英文缩写 2. 多克隆位点的概念 3. 大肠杆菌蓝白斑筛选原理 4. 普通PCR的扩增原理和过程
93
Thank you!
94
水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 可以阻止四环素进入细胞。 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之
失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物） 失活
（5）hygr
潮霉素β磷酸转移酶 使潮霉素β失活。
33
3. 多 克 隆 位 点 （ multiple cloining site，MCS）
①拷贝数多，10-200个，分子量小。 ②复制不受宿主细菌复制系统的限制，其拷贝数猛增 至 1000-3000之多，该性质多基因工程技术十分有利。
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
DNA，RNA，蛋白实验操作步骤v2
DNA提取仔细看试剂盒说明书！使用前：1.在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇（加入量看瓶标签）2.若缓冲液GA或GB有沉淀，37℃水浴溶解，摇匀后使用简要步骤如下：1.冻存全血37℃快速融化，取200μL血液加20μL Proteinase K溶液，混匀。
2.加200μL缓冲液GB，颠倒混匀数次，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心。
3.加200μL无水乙醇，振荡混匀15s，可能会有絮状沉淀，瞬时离心。
4.将所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3（吸附柱放入收集管），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
5.向CB3中加入500μL缓冲液GD（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
6.向CB3中加入600μL漂洗液PW（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。
7.重复步骤6.8.将CB3放回收集管，12000rpm（~13400g）离心2min，弃废液。
将CB3置于室温放置数分钟，以挥发残留的乙醇。
9.将CB3转入一1.5mL Ep管，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm（~13400g）离心2min，备用。
DNA/RNA浓度测定使用仪器：ND-1000使用方法：1.保持检测区域的清洁。
准备无RNA酶水，使用前润洗点样区1-2次。
2.打开软件，在点样区滴加1μL无RNA酶水，选择核酸种类（DNA/RNA），设置blank。
3.滴加1μL待测样本，记录浓度和纯度。
4.用纸巾擦去样品，再用无RNA酶水清洗1-2次。
5.关闭软件，关闭电脑，将机器盖上防尘布。
DNA PCR扩增反应体系：模板DNA 500ng10*buffer 2.5 μL25mM MgCl2 1.5 μL2.5mM dNTP 2μL10μM引物各0.4μLTaq酶0.25μL补水至25ul反应条件：95℃3min，（94℃30s，60℃30s，72℃30s），35个循环，72℃5minPCR产物2%琼脂糖凝胶电泳1.小胶（1/4）25mL ,中胶（1/2）50 mL ,大胶 100 mL。
DNARNA及蛋白质操作技术
DNARNA及蛋白质操作技术DNA操作技术DNA操作技术广泛应用于生物学研究、医学诊断、犯罪侦查等领域。
下面将介绍几种常见的DNA操作技术。
1.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种重要的DNA操作技术，可以迅速扩增目标DNA序列。
PCR的主要步骤包括：变性、退火和延伸。
首先，将DNA样本加热至95℃，使DNA双链解离为单链；然后，降温至退火温度，引物与目标DNA序列特异性结合；最后，在延伸温度下，DNA聚合酶沿DNA模板合成新的DNA链。
通过不断重复这个循环，可以将目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。
2.DNA测序DNA测序是确定DNA序列的技术。
最早的DNA测序方法是Sanger测序，它利用带有不同标记的ddNTP和dNTP，在DNA合成过程中随机终止，得到不同长度的DNA片段。
这些片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据标记的位置确定序列。
近年来，新一代测序技术的出现大大提高了测序速度和准确性，比如Illumina测序技术。
3.DNA克隆DNA克隆是将目标DNA序列插入载体DNA中的过程。
典型的DNA克隆技术包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
首先，用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，产生能相互配对的粘性末端；然后，用连接酶将两者连接起来；最后，将连接物转化到宿主细胞中，宿主细胞通过复制连接物，使其扩增。
DNA克隆广泛应用于基因工程、蛋白表达和基因治疗等领域。
RNA操作技术RNA是生物体内转录出的中间产物，包括mRNA、rRNA、tRNA等不同类型。
下面将介绍几种常见的RNA操作技术。
1.RNA提取RNA提取是从生物体中分离纯化RNA的过程。
常用的RNA提取方法包括酚-氯仿法、离心柱法和磁珠法等。
其中，酚-氯仿法是最常用的方法，通过酚等有机溶剂和氯仿共同沉淀DNA和蛋白质，使RNA在上清液中得到富集。
2.RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）RT-PCR是将RNA转录为cDNA，并利用PCR扩增cDNA的技术。
分子生物学考点整理1
分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。
四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。
根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。
这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。
二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。
2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。
3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。
5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。
重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。
分子学：DNARNA技术 (2)
重组DNA技术发展史上的重大事件 三大成就： 一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携 带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白 质，解决了遗传的物质基础问题；
二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模 型和半保留复制机制,解决了基因的自我复 制和世代交替问题；
三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法 则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐 明了遗传信息的流动与表达机制。
• 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及 EcoRI 、 HindIII 、 BamHI 、 SalI 、 XhoI 、 PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的 单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3 个位点插入外源基因，会导致tetr失活。
大肠杆菌 pSC101 质粒载体 示意图。
具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同 粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片 段直接克隆到pUC8质粒载体上。
5、 pGEM-3Z质粒
长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗 性基因和一个lacZ'基因。
含有两个噬菌体启动子（T7和SP6），为 RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别 位点。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的 外源基因便会转录出相应的mRNA。
优点：
更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322 基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的 氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了 许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由 于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，
平均每个细胞即可达500~700个拷贝。
可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构 中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ‘基因，所 编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用 X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
现代分子生物学课后答案(朱玉贤_第
第五章分子生物学研究法（上）------DNA RNA及蛋白质操作技术1. 简述PCR技术。
课本P165.2 .简述核酸的凝胶电泳。
答：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。
某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。
在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。
将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极 -正极移动。
在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide 染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
3. 什么是south 杂交？指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程第七章基因的表达与调控（上）---- 原核基因表达调控模式1.简述代谢物对基因表达调控的两种方式。
① 转录水平上的调控(transcriptional regulation) ；② 转录水平上的调控(post-transcriptional regulation) ，包括mRNA 加工成熟水平上的调控(differen,tial processing of RNA transcript和翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。
3.简述乳糖操纵子的调控模型。
A、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列0, —个启动子P和一个调节基因I。
B、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。
用Trizol提取DNA,RNA及蛋白质的方法及注意事项
TRIZOL试剂警告：接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤。
接触皮肤之后立即用去垢剂和水冲洗。
若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）。
收到药品后，在室温下存储。
以已证明TRIZOL在常温下可稳定储存12个月。
说明：TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。
该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液，它发展自Chomczynski 和Sacchi的RNA一步抽提法。
在细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。
离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。
RNA只留在水相中。
转移水相后，用异丙醇沉淀回收RNA。
除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也可以用后续沉淀方法回收。
用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。
DNA 的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有用。
这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织（低至50-100mg，高至≥1g）和细胞（低至5×106，高至＞107）都有良好的效果。
其简单的操作方法允许同时处理大量样品。
整个过程可在1小时内完成。
用TRIZOL提出的总RNA 不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern 电泳分析、斑点杂交、poly (A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
在PCR和扩大DNA酶Ⅰ梯度分离中，建议使用一个内含子中的两个引物。
TRIZOL简化了各种类型的大分子及小分子RNA的分离。
例如，从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA 条带,（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb（28S）和2kb（18S）核糖体RNA 的条带，以及介于0.1到0.3kb（tRNA, 5S）的小分子RNA的条带。
所分离的RNA 稀释于TE时A260/A280之比大于等于1.8。
谨防RNase的污染：在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase。
由于其活性难以抑制，因此只能直接避免其引入。
第十二章DNA RNA 蛋白质
双水相分离法
原理：利用两种多聚物，或多聚物与盐在水相中的不相容性，可以 从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离、纯化蛋白质，同时起到浓缩 蛋白质的作用。 该法较温和，一般不会使蛋白质变性失活，可在室温下进行， 双水相中聚合物还可提高蛋白质的稳定性。 最常用的多聚物是聚二乙醇和葡聚糖。 影响因素：聚合物分子量及浓度、溶液pH、离子强度、盐类型及浓 度等的影响。 接下来一般采用Bradford方法测定蛋白质，以免PEG的影响
蛋白质样品的分离
聚沉： 聚沉剂主要是无机盐类（如氯化锌、氯化铝、硫酸盐等） 和聚合无机盐（聚合铝、聚合铁等）。为促进聚沉的产生， 可以降温至20℃以下进行；调整pH至3~6；提高离子浓度； 增加颗粒数量；增加多价金属离子等方法。 离心： 对于低粘度介质中的细菌，2000~3000g、10~15min；对 于高粘度的溶液，则需更高的速度和更长的时间，如细胞 碎片，12000g、30~45min；对于蛋白质沉淀，5000g、 30min或15000g、10min 过滤： 孔径一般为0.2um或0.45um，常压或减压过滤。
超滤法
原理：在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，
依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子 物质通过，大分子物质和微粒子如蛋白质、水溶性高聚物、细菌等被滤膜 阻留，从而达到分离、分级、纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术。
优缺点：
1、超滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对热 敏感的物质，如药物、酶、果汁等的分离、分级、浓缩与富集。 2、超滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无 污染，是一种节能环保的分离技术。 3、超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的 浓缩均非常有效。 4、超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，因此分离装置简单、流程短、 操作简便、易于控制和维护。 5、超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶 液，一般只能得到10～50%的浓度。
Trizol法提取RNA、DNA及蛋白质
Trizol法提取RNA、DNA及蛋白质1、向组织或细胞中加入1ml TRIZOL，吹打混匀，室温静置5min；2、加入TRIZOL 1/5(200ul)氯仿，振荡混匀，室温静置3min，4°C 12000g离心15-20min；注：上层水相可以通过异丙醇沉淀RNA，中间层通过乙醇能使DNA沉淀析出，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白质。
RNA提取3、将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10 minutes;4、4°C，然后离心12,000 g ，10 minutes，去上清留沉淀；5、加入1ml 75%乙醇（RNase-free）洗涤沉淀，votex 5s；6、4°C， 12,000 g ，离心10 minutes，去上清留沉淀；7、加入1ml无水乙醇洗涤，votex 5s ，4°C， 12,000 g ，离心10 minutes，去废液留沉淀；8、晾干；9、加入50ulRNase free ddH2O溶解；10、测浓度，-80℃保存。
DNA提取3、将上层水相转移干净，这对分离DNA很关键；4、加入300ul无水乙醇/1ml TRIZOL，颠倒混匀，室温静置3min；5、4°C，2,000 g ，离心5 minutes；6、转移上清液，用于蛋白提取；7、加入1ml柠檬酸钠/无水乙醇（0.1M柠檬酸钠10%乙醇，pH8.5）洗涤，室温孵育30min（不时轻轻颠倒混匀）；8、4°C， 2,000 g ，离心5 minutes，去废液留沉淀；9、重复步骤7和8；10、加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀，室温孵育10-20min（不时轻轻颠倒混匀）；11、4°C， 2,000 g ，离心5minutes，去上清留沉淀；12、无水乙醇洗涤，votex 5s，4°C， 2,000 g ，离心10 minutes；13、晾干；14、加入50ul ddH2O或TE溶解，测浓度，冰箱保存。
细胞转染的方法和基本原理
细胞转染的方法和基本原理细胞转染是生物学研究中常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质引入到靶细胞中。
本文将介绍细胞转染的方法和基本原理。
一、细胞转染的方法1. 化学法转染：化学法转染是最常用的细胞转染方法之一。
通过利用化学物质如聚乙烯亚胺（PEI）或脂质体等，将外源DNA或RNA 包裹成复合物，与细胞膜结合后进入细胞。
这种方法操作简单、成本低廉，适用于多种细胞类型。
但转染效率较低，对细胞有一定毒性。
2. 病毒载体转染：病毒载体转染是一种高效的细胞转染方法。
病毒载体可以将外源基因嵌入病毒基因组中，然后通过感染细胞的方式将基因导入细胞内。
常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒等。
这种方法转染效率高，适用于多种细胞类型，但需要特殊设备和技术，同时也有一定的生物安全风险。
3. 电穿孔法转染：电穿孔法利用高压脉冲作用于细胞膜，破坏细胞膜结构，从而使外源DNA或RNA进入细胞。
这种方法操作简单，转染效率较高，但对细胞有一定的毒性，并且只适用于某些特定的细胞类型。
4. 基因枪法转染：基因枪法是一种生理穿孔法，通过利用高压气体或火药驱动基因枪，将外源DNA或RNA以微粒形式直接射入细胞。
这种方法适用于多种细胞类型，转染效率较高，但需要特殊设备和技术，并且对细胞有一定的毒性。
二、细胞转染的基本原理细胞转染的基本原理是通过一定的方法将外源DNA、RNA或蛋白质引入靶细胞，使其在细胞内表达或功能发挥。
转染后的细胞可以用于研究基因功能、蛋白质表达及相互作用等。
细胞转染的基本原理可以分为三个步骤：吸附、内化和表达。
1. 吸附：在化学法转染中，外源DNA或RNA会与载体相结合形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合。
在病毒载体转染中，病毒载体会与细胞膜表面的受体结合。
吸附是转染的第一步，直接影响转染效率。
2. 内化：吸附后，外源DNA、RNA或蛋白质需要进入细胞内部。
在化学法转染中，复合物通过细胞膜的内吞作用或直接渗透进入细胞质。
DNA操作的基本技术
RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经 过复性处理后，形成异源双链旳过程
一、Southern 印迹可用于分析基因 拷贝数旳变化
• 由E. M. Southern在1975年提出 • 可用于分析基因拷贝数旳变化 • 基本操作过程涉及
* DNA序列分析措施旳演变和发展
• 20世纪70年代 – 双脱氧链终止法：F. Sanger – 化学裂解法：A. Maxam和W. Gilbert
• 20世纪80年代 – PCR及自动测序技术
一、DNA序列分析有双脱氧链终止法和 化学裂解法
• （一）Sanger双脱氧链终止法利用2′，3 ′ 双脱氧核苷酸掺入中
酵母单杂交技术旳基本原理
三、蛋白质-RNA相互作用也可采用酵母 三杂交系统进行分析
• 酵 母 三 杂 交 系 统 （ yeast three-hybrid system）于1996年由等首先报道
（一）用于蛋白质-RNA相互作用分析旳酵母 三杂交系统需要杂合RNA
酵母三杂交基本原理
（二）酵母三杂交系统应用范围广泛
• 可进行与特定蛋白结合旳未知RNA旳筛选； • 拟定RNA-蛋白质相互作用旳构造域； • 鉴定、分离能够辨认具有主要生理功能
RNA旳RNA结合蛋白。
蓝 ddC
ddT
荧光标识
DNA合成
毛细管电泳
测序成果展示
二、DNA序列分析能够揭示基因和 基因组一级构造变化
• 经过DNA序列分析能够鉴定基因和基因组 旳变异
• 经过DNA序列测定分析人工重组旳基因 • 经过DNA序列测定对定点突变进行确认
第四节
DNA芯片技术
DNA、RNA和蛋白质的生物合成
DNA 的 复 制 过 程
引
解
发
螺
酶
旋
酶
聚
修
松
单
连
合
复
弛
链
接
酶
酶
酶
结酶合源自蛋白1. 引物酶识别复制起点， 引导解螺旋酶到正确位点
2. 解螺旋酶解开双螺旋
3. DNA聚合酶合成新的DNA链
5. 四种脱氧核苷三磷酸为底物
4. 按碱基互补原理合成DNA链
6. 释放焦磷酸
7-12. DNA片段的合成和链的延伸
单相复制
噬菌体Φ×174—滚环复制
3'
33''
5'
5' 5'
② 真核生物
线形双链DNA，含有多个复制子；双向复制。
2. 复制速度 3. 真核生物的DNA在全部复制完成之前，起点不再 重新开始复制；原核生物中，起点可连续发动复制
14.1.6 在RNA指导下的DNA的合成
1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合 酶，该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核 苷酸顺序(其中U与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信 息流转录的方向相反，故称为反转录。
13. 连接酶
14. 单链结合蛋白
15. 松弛酶
16. DNA的复制
14.5.1 原核生物与真核生物 DNA复制的特点比较
1. 复制的起点和单位
复制单位：复制子，生物体内能独立行使复制 功能，进行独立复制的DNA单位。
ori
① 原核生物
由一个复制子组成 双向复制
大肠杆菌，θ结构
大肠杆菌：θ结构
3. mRNA前体的转录后加工
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ampr
pBR322 4.36 kb
优点是具有较小的分子量（4363 bp）。能携带6-8 kb
的外源DNA片段，操作较为便利。
有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。
有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积
1000~3000个拷贝，便于制备重组体DNA。
4、pUC质粒载体（包括四个部分）：
具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体 （vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制 子都可以作为基因导入的载体。
（二）基因克隆的载体
1、pSC101质粒载体 • 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、 HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等 7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、 BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr 失活。
多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程
单核苷酸5‘-磷酸基团向核酸链的3’-OH发起进攻
RE 切割随机DNA分子（假定4种碱基在DNA中均匀 分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n 来计 算，如一个6碱基切割酶平均每4096 bp核DNA有一 个酶切位点（46），而一个4碱基切割酶平均每256 bp核DNA就有一个酶切位点（44）。
pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ‟基
因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用
X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。
具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末
端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到
pUC8质粒载体上。
5、 pGEM-3Z质粒 长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和 一个lacZ'基因。 含有两个噬菌体启动子(T7和SP6)，为RNA聚合酶的 附着提供了特异性识别位点。加入T7或SP6 RNA聚合
• 来自pBR322质粒的复制起点（ori）
• 氨苄青霉素抗性基因（ampr） • 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）启动子及编码 α-肽链的DNA序列。特称为lacZ‟基因 • 位于lacZ‟基因5‟-端的一段多克隆位点（MCS）， 外源基因插入破坏lacZ ‟基因功能
pUC18 2.69 kb
列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。
1965 Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家 证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。
1966
Nirenberg，Uchoa，Khorana，Crick等人破译了全
部遗传密码。
1967
第一次发现DNA连接酶
1970
Smith，Wilcox和Kelley分离了第一种限制性核酸 内切酶，Temin和Baltimore从RNA肿瘤病毒中发 现反转录酶。
优点：
更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上
构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗
性 基 因 及 复 制 起 点 ， 其 分 子 小 了 许 多 ， pUC8 为
2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC 质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达 500~700个拷贝。
酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。
6、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）
由人工构建的具有原核和真核两种不同复制起点
和选择标记，可在不同的寄主细胞内存活和复制的
质粒载体。 这类质粒载体可保证外源DNA序列在不同物种 (原核和真核)的细胞内得到扩增，用途广泛。
7、pBluescript噬菌粒载体 pBluescript是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒 载 体 ， 简 称 为 pBS （ +/- ） ， 如 今 则 更 多 地 叫 作 pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。
（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分
子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一
种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的
重要实验手段。
一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向 适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁
LacZ编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的α-肽，
IPTG（异丙基- β-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，
所合成的β-半乳糖苷酶α-肽与宿主细胞编码的缺陷型
β-半乳糖苷酶互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，水
解培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖
苷），生成蓝色的溴氯吲哚。 含X-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA 分子的菌落为白色。
重组DNA实验中常见的主要工具酶
酶 类 功 能 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接 成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双 链中的缺口 反转录酶 多核苷酸激酶 末端转移酶 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补 原则合成DNA链 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端 （进行末端标记实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3„末端加上多聚或单核苷酸
• SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照
SacI→KpnI的方向转录；
• （+/ -）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取
向。
• f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬
菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意
义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒
1972-1973
1975-1977
1978 1980 1981
1982 1983 1984 1986 1988 1989 1992 1994
美、英批准使用第一例基因工程药物——胰岛素， Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 获得第一例转基因植物。 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 GMO首次在环境中释放。 Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。 DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠—“Oncomouse”。 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定 （315kb）。 第一批基因工程西红柿在美国上市。
1957
1959-1960
A．Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
Uchoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决 定了蛋白质分子中的氨基酸序列。
1961
Nirenberg破译了第一个遗传密码；Jacob和Monod
提出了调节基因表达的操纵子模型。
1964
Yanofsky和Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序
Boyer，Berg等人发展了DNA重组技术，于72年 获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌 基因克隆。 Sanger与Maxam和Gilbert等人发明了DNA序列 测定技术，1977年完成了全长5387bp的噬菌体 φ174基因组测定。 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人 脑激素和人胰岛素。 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专 利化。 Palmiter和Brinster获得转基因小鼠，Spradling 和Rubin得到转基因果蝇。
能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开
DNA分子。
第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发
现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分
子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。
图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及 其酶切末端。
图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体
没有Rop蛋白，RNA 1基因就不能起始转录。
3、pBR322质粒载体来自由三个不同来源的部分组成的：
第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉 素抗性基因（AmpR）； 第 二 部 分 来 源 于 pSC101 质 粒 的 四 环 素 抗 性 基 因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复 制起点（ori）。
ori
ColE1 6.64 kb
BelI
RF2 O
MscI
ClaI
ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系
前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经
RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，起始DNA
合成。 RNA 1在RNA 2的5‟末端，转录方向相反，因此能通过 氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseH加工RNA 2， 使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始。
繁殖和表达。
根癌土壤农杆菌（Agrobaoterium tumefaciens）侵染植 物细胞后能将其Ti（tumor inducing）质粒上的一段 DNA（T-DNA）插入到被侵染细胞的基因组，并能稳 定地遗传给后代，植物的遗传转化（植物基因工程）
技术随之得到迅速发展。
5. 1 重组DNA技术史话
载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ 基因的无意义链DNA。
(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7
噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上 的外源基因的转录； (ii)具有单链噬菌体f1的复制起点和一个来自ColE1质 粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有无辅
胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主
染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停
止。 • 松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细 胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个，占细胞 总DNA的50%左右。