热原检查法(精品课件)
热原检查法
热原检查法第一篇：热原检查法【关键词】热原检查法细菌内毒素检查法热原热原是微生物的代谢产物，系能引起恒温动物和人体体温异常升高的至热性物质。
当注入人体含有热原的量达0.01微克/千克以上的输液时，即可产生热原反应。
《中华人民共和国药典》同时收载了热原检查法（家兔法）和细菌内毒素检查法(鲎试剂法）对输液进行热原检查。
我们对我院临床使用的哈尔滨三精艾富西药业有限公司生产的10个批次0.9%氯化钠注射液液，进行了两种方法联合应用的尝试，收到了良好效果。
1资料与方法1.1研究对象哈尔滨三精艾富西药业有限公司生产的规格为500 ml0.9%氯化钠注射液，批号为:50307A、50411C、50513A、50716A、50910A、50910C、51008A、51116A、51128C、51215C。
1.2试验材料细菌内毒素国家标准品：批号为20056（100EU/支）,厂家为中国药品生物制品鉴定所。
鲎试剂：批号为0507250（0.25EU/ml），厂家为湛江安度斯生物公司。
健康合格家兔（雌兔无孕），1 ml刻度吸管，5 ml试管，20 ml玻璃注射器，肛温计，250 ℃电热恒温烤箱，漩涡混合器、电热恒温水浴箱。
(见表1) 表10.9%氯化钠注射液检查结果（略）1.3方法与结果将上述10批次哈尔滨三精艾富西药业有限公司的0.9%氯化钠注射液，分别按照《中华人民共和国药典》（2000版）附录规定的热原检查法（家兔法）和细菌内毒素检查法（鲎试剂法）的标准进行检查，结果见表1。
2讨论从以上检查结果不难看出，两种方法对同批次的产品进行检查，结果出现了偏差，通过临床跟踪调查，上述批次产品用于临床均未发生热原反应。
内毒素检查法（鲎试剂法）检查热原可靠性强，且操作简便，成本低，省时，省力，是热原检查的发展方向。
相比之下相对古老的热原检查法（家兔法）就显得操作繁琐，成本高，即费时又费力，家兔容易受周围环境、温度、噪声等干扰而影响检查结果。
卫生学检查技术—热原和细菌内毒素检查法
若均为（+），判定供试品不符合规定；
若2支供试品管中1支为(+)，1支为(−)，则另取4支复试，4 支中有1支为(+)即认为不合格。
四、注意事项
1．防止鲎试验用水被污染； 2．开启内毒素标准品和鲎试剂时，要将粘附在安瓿瓶上 的粉末尽可能弹落下去。用砂轮划过安瓿后，要用酒精 棉（最好能用沾异丙醇的无纺布，以避免产生假阳性结 果）擦拭，防止开启时玻璃屑落入安瓿内。开启内毒素 标准品时，要在安瓿曲颈上部，并尽可能保留较长的安 瓿颈，准确加入1.0ml鲎试验用水复溶。
（二）检查方法 即凝胶法和光度测定法。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集
反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。是中国药典的“仲裁” 方法。
二、仪器和试剂
37±1℃恒温水浴或适宜的恒温器具、超净工作台、漩涡混合器 、内毒素工作标准品、加样器、鲎试剂、鲎试验用水、pH调节剂等 。
鲎试剂
漩涡混合器
加样器
三、测定方法
实验流程
供试品
限值确定
最大有效稀释倍数（MVD）确定
供试品干扰实验
正式实验
结果判断
供试品内毒素检查：凝胶限度试验
编号
A B C D
内毒素浓度／被加入内毒 平行管
素的溶液
数
无／供试品溶液22λ／供试Fra bibliotek溶液2
2λ／检查用水
2
无／检查用水
2
A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为 阴性对照。λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml)。
将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃的恒温 器中，保温60±2分钟后，将试管取出，缓缓倒转180°，若 管内凝胶不变形，不从管壁脱落为阳性(+)，凝胶不能保持 完整并从管壁脱落为阴性(-)。
热原检查法
热原检查法中国鲎成为了国家二级保护动物，鲎试剂成为了紧俏资源。
作为一个注射剂制药企业的QC，不得不考虑以后怎么来应对，除了采用减少鲎试剂的用量外，可选择重组鲎试剂或采用重组C因子法，但结果的等效性研究这个拦路虎很难打到。
百无聊赖就翻开了《中国药典检测分析指南》2017年版的热原检查法，开卷有益，该版指南对人员检查的基本原理等进行了全面的阐述，现将学习内容进行总结。
1、热原相关的定义及来源1.1 相关定义热原是注射进入人体或动物体内后，能导致其体温升高的一类物质的总称。
可以直接导致体温升高的物质称为外源性热原，由外源性热原引起体内产生的致热物质称为内源性热原。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（LPS）。
当细菌死亡或自溶后便会释放内毒素。
LPS是高分子量的脂多糖。
思考：以上定义解释了注射剂为什么要进行热原检查或细菌内毒素检查。
1.2 热原的致热原理外源性物质进入人体，作用到单核细胞系统，刺激其分泌内源性致热原[主要有白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1）干扰素（INF）及肿瘤坏死因子（TNF）等]；内源性致热原作用于下丘脑提问调节中枢，使体温调定点上调，造成产热增加、散热减少，导致人体发热。
思考：干扰素、抗肿瘤药物等是否会影响热原的检查？1.3 外源性热原的来源1.3.1 外源性热原中微生物来源的包括：a) 革兰氏阳性菌细菌成分（脂阿拉伯甘露聚糖、蛋白、热休克蛋白A、脂磷壁酸等）；b) 革兰氏阴性菌细菌成分（脂质A、外膜蛋白、膜孔蛋白、陪伴蛋白等）；c) 革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌细胞壁成分（细胞表面蛋白、菌毛、脂肽、脂蛋白、肽聚糖、胞壁酰二肽等）；d) 革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌细胞外成分（毒素、超抗原等）；e) 非细胞性微生物（活病毒、真菌、酵母、疟原虫等）。
微生物产生的致热物质中，革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素致热性最强，其次是革兰氏阳性杆菌，革兰氏阳性球菌致热作用较弱，真菌、病毒致热作用更弱，因此，细菌内毒素被认为是自然界最强致热原。
热原检查法课件
选择适用的家兔3只作为一组
检 查 法
给每组家兔编号图
给设定的每组输入供试品资料
给设定的每组输入注射时间
测定其正常体温后15 min内，自 耳静脉缓缓注入规定剂量(参见表51,5-2.5-3)并温热至约38℃的供试品溶 液
用酒精棉球消毒
自耳静脉注入 供试品溶液图
然后每隔30 min按前法测其体温 1次，共测6次，以6次体温中最高的 一次减去正常体温，即为该家兔体 温的升高度数。
计算机测出家兔体温曲线升高值
家兔体温测 温装置
试验用的注射器、针头及一切和供试品接触 的器皿，应置烘箱中用250℃加热30 min
第五章 药品有害物质检查技术 第二节 药品的热原检查
《中国药典》热原检查方法是采用家
热
兔升温法进行检查。
原
本法系将一定剂量的供试品，静脉 注入家兔体内，
检
在规定时间内，
查
观察家兔体温升
的
高的情况，以判定
方
供试品中所含热原
法
的限度是否符合规 定。
挑选家兔
(健康无伤 体重1.7～3.0 Kg
家 雌兔应未孕) 兔 的 准 备
测体温
(30 mi/次，8次 38.0～39.6℃ 体温差<0.4℃)
饲养环
家兔处同一环境，实验室（图）和饲养室 （图）温差不得大于5℃，实验室温度在
境要求
17～25℃， 实验全过程中，室温变化不
热
得大于3℃，应避免噪音干扰
原
试
验
家兔体在38.0℃～39.6℃，各 兔间正常体温之差不得超过1℃。
肛温计插入深度和时间各兔相同(一 般 约 6 cm) ， 时 间 不 得 少 于 1min ， 30min 测 次 ， 一 般 测 2 次 ， 两 次 体 温 之 差 不 得 超 过 0.2℃ ， 以 此 两 次 体 温 的平均值作为该兔的正常体温。
药品的安全性检查-热原
热原
二、家兔检查法
3只兔：0.5小时测1次，共6次， 最高-最低＝升高的温度 结果：均升高在0.6℃以下 且升高的总数在1.3℃以下 认为符合规定。
药品的安全性检查——热原
热原
一、基本知识
（一）基本概念 热原(pyrogen)系指药品中含有的能引起体温升高的杂质，
主要为细菌性热原。 方法：家兔检查法，即将一定剂量的供试品，静脉注入家
兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限量是否符合规定。 （二）检查对象
供静脉滴注用的注射剂以及容易感染热原的品种。
热原的基本知识PPT课件
三、除去热原的方法
1.高温法
耐高温的注射器、针头或器皿，在洗涤干燥后， 于250℃加热30分钟以上，可以破坏热原。
2.蒸馏法
热原能溶于水但不挥发，因此制备注射用水时， 需经蒸馏，纯化水中的热原可被除去。
3.活性炭吸附法
活性炭对热原有较强的吸附作用，同时有助滤 、脱色作用，所以在注射剂中使用较广。常用 量为0.1%~0.5%，但应注意吸附可能造成主药 的损失。
7.超滤法
一般用3.0~15nm孔径的超滤膜除去部分热原。
8.其他
如采用离子交换法、反渗透法等，也可通过吸附 或滤过作用除去部分热原。
四、检查热原的方法
中国药典现行版本规定热 原检查采用：
（一）家兔法 （二）细菌内毒素检查法
（一）家兔法
《中国药典》现行版规定热原检查法系将一定 量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间 内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品 中所含热原的限度是否符合规定。
如室内空气、环境、人员卫生条件达不到要求， 操作时间过长、产品灭菌不及时或灭菌不合格等 均会增加微生物的污染而产生热原。
5.产品密闭不合格，在储存中被污染
（二）使用过程中的污染
临床使用的器具如输液器、注射针筒针头、配 药器具等的污染会带入热原，中心配药室或临 床科室配药过程，由于环境、操作、用品、混 入的其他药品等因素的污染也可能带入热原。
二、污染热原的途径
（一）生产过程中的污染
1.从溶剂中带入
是热原污染的主要途径，主要指配制注射液用的注射用水 ，尽管水本身并非使微生物良好的培养基，但易被空气或 含尘空气中的微生物污染。虽经蒸馏可将热原除去，但若 操作不当或蒸馏设备结构不合理，水蒸气中带有细小的水 滴则可将热原带入。
热原的检查方法
热原的检查方法热原检查方法是在工业生产过程中常用的一种方法，用于确定设备或系统中存在的热源。
热源是指能够产生热量的物体或系统，常见的热源包括燃烧炉、锅炉、发动机等。
热源检查的目的是为了确保设备或系统的正常运行，以及预防潜在的安全隐患。
一、热源检查的步骤热源检查通常需要遵循以下几个步骤：1. 确定热源：首先需要确定热源的位置和类型。
可以通过查看设备的技术参数或者进行实地勘察来确定热源的具体情况。
2. 检查外观：对于可见的热源，可以通过外观检查来判断其是否存在异常。
例如，观察燃烧炉的火焰是否正常，是否存在漏气的情况。
3. 检测温度：使用温度计等工具对热源进行温度检测。
温度过高或过低都可能是热源存在问题的表现。
4. 检查燃料供应：对于燃烧炉等需要燃料的热源，需要检查燃料供应是否正常，例如燃料是否充足、燃料是否完全燃烧等。
5. 检测排放物：对于烟囱、尾气等排放物进行检测，判断是否存在超标排放的情况。
6. 检查设备运行状态：观察设备的运行状态，包括噪音、振动、漏水等方面，判断设备是否正常工作。
7. 检查安全设施：检查热源周围的安全设施是否完善，例如防护罩、防火墙等。
二、热源检查方法的应用热源检查方法广泛应用于各个行业和领域。
以下是一些常见的应用场景：1. 工业生产：在工业生产过程中，热源是不可或缺的一部分。
通过对热源进行定期检查，可以保证设备的正常运行，提高生产效率。
2. 建筑工程：在建筑工程中，热源检查可以用于检测供暖设备的工作状态，确保居民的生活质量。
3. 能源行业：对于能源行业来说，热源是一种重要的能源形式。
通过对热源进行检查，可以确保能源的有效利用，降低能源浪费。
4. 环境保护：热源排放物的监测和控制是环境保护的重要内容之一。
通过热源检查方法，可以及时发现和解决热源排放问题，减少对环境的污染。
三、热源检查的意义热源检查对于保障设备和系统的正常运行具有重要意义。
以下是热源检查的几个重要意义：1. 安全保障：通过热源检查，可以及时发现和解决存在的安全隐患，保障工作人员和设备的安全。
热原检查法(兔法)
1.目的：建立产品中热原检查的标准操作规程。
2.范围：产品的热原检查。
3.责任：质量监督部。
4.内容：本法适用于《中国药典（1995年版）》附录中“热原检查法—兔法”。
4.1实验材料及用具：4.1.1天平：精度0.01或0.1mg 供试品称量用精度0.1或1mg 试剂称量用精度10g 家兔称重用4.1.2电热干燥箱：（50-300±1）℃。
4.1.3恒温水浴：（37-100±0.5）℃。
4.1.4热原测温仪或肛门体温计，精度0.1℃。
4.1.5家兔固定盒：盒的两侧有通气孔。
4.1.6实验用具：注射器、烧杯、三角瓶、大称量瓶、吸管、移液管、表面皿、玻璃棒、广口试剂瓶、金属制密封器（均需去热原）、时钟、直镊、脱脂棉或细软卫生纸。
4.1.7试剂：75％乙醇、凡士林或50％甘油、新蒸馏水（4小时内蒸馏）、灭菌注射用水（经热原检查，3只家兔中体温升高0.4℃的最多只有1只，且3只家兔体温升高总数低于1℃，或经细菌内毒素检查，含细菌内毒素低于0.5EU／m1）、无热原氯化钠（经250℃ 30分钟或200℃ 1小时或180℃ 2小时加热除热原）。
4.2溶液配制：供试品溶液。
4.2.1原料药：4.2.1.1精密称取适量，置烧怀、三角瓶或称量瓶中。
4.2.1.2按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水，搅拌使溶解。
4.2.2注射液：4.2.2.1用75％乙醇棉球消毒安瓶颈部，割开安瓶。
4.2.2.2精密量取一定量药液。
4.2.2.3按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水，混匀。
4.2.3注射用生理盐水：4.2.3.1称取无热原的氯化钠适量至烧杯或三角瓶中。
4.2.3.2加入供试品“注射用水”适量，配成0.9％的等渗溶液。
4.3实验动物：4.3.1健康无伤、体重1.7-3.0kg、同一来源、同一品系家兔，雌兔应无孕，一兔一笼，标兔号。
4.3.2新兔预选：4.3.2.1新兔经饲养7日后，进行预测体温，测温的条件与热原检查要求相同。
热原检查法课件
供试品溶液图
然后每隔30 min按前法测其体温 1次，共测6次，以6次体温中最高的 一次减去正常体温，即为该家兔体 温的升高度数。
计算机测出家兔体温曲线升高值
家兔体温测 温装置
试验用的注射器、针头及一切和供试品接触
的器皿，应置烘箱中用250℃加热30 min
家兔体温 检查确实
实验器具 的准备
注射器、针头等和供试品接 触的器皿， 应250℃加热30 min，或其他适宜的方法除去 热原。
选择适用的家兔3只作为一组
检 查 法
给每组家兔编号图
给设定的每组输入供试品资料
给设定的每组输入注射时间
测定其正常体温后15 min内，自 耳静脉缓缓注入规定剂量(参见表51,5-2.5-3)并温热至约38℃的供试品溶 液
测体温
(30 mi/次，8次 38.0～39.6℃ 体温差<0.4℃)
家 兔 的 准 备
饲养环 境要求
热 原 试 验 检 查 前 准 备
家兔处同一环境，实验室（图）和饲养室 （图）温差不得大于 5℃，实验室温度在 17 ～ 25℃， 实验全过程中，室温变化不 得大于3℃，应避免噪音干扰 家兔正常体温在 38.0℃～ 39.6℃，各 兔间正常体温之差不得超过1℃。 肛温计插入深度和时间各兔相同 ( 一 般 约 6 cm) ， 时 间 不 得 少 于 1min ， 30min 测次，一般测 2 次，两次体温 之差不得超过 0.2℃，以此两次体温 的平均值作为该兔的正常体温。
第五章
药品有害物质检查技术
第二节 药品的热原检查
热 原 检 查 的 方 法
《中国药典》热原检查方法是采用家 兔升温法进行检查。
本法系将一定剂量的供试品，静脉 注入家兔体内， 在规定时间内， 观察家兔体温升 高的情况，以判定 供试品中所含热原 的限度是否符合规 定。
YBB60232012热原检查法
YBB60232012热原检查法Reyuan JianchafaTests for Pyrogen本法系将供试液经静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
供试用家兔应符合热原检查法（中国药典2010年版二部附录ⅪD）中供试用家兔的要求。
试验前的准备应符合热原检查法（中国药典2010年版二部附录ⅪD）中试验前的准备要求。
供试品溶液的制备制备过程应按无菌操作法进行。
将供试品用纯化水冲洗干净后，用滤纸吸干，切成约0.5cm×3cm条状，置浸提容器内。
除另有规定外，供试品置高压蒸汽灭菌器内，在115℃保持30分钟，再按表1规定加入浸提液，使浸提液浸没供试品，按表2条件浸提，即得。
供试液应在制备后2小时内使用。
表1 供试品表面积或重量与浸提液的比例供试品厚度（mm）表面积或重量与浸提液体积的比例≤0.5 6cm2/ml＞0.5~1.0 3cm2/ml＞1.0 1.25cm2/ml不规则形状0.2g/ml表2 浸提条件浸提温度（℃）浸提时间（小时）37±1 24±237±1 72±250±2 72±270±2 24±2检查法取适用的家兔3只，测定其正常体温符合要求后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入温热至约38℃的供试品溶液，注射剂量为10ml/kg，然后每隔30分钟按前法测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度（℃）。
如3只家兔中有1只温度升高0.6℃或高于0.6℃，或3只家兔体温升高的总和达1.3℃或高于1.3℃，应另取5只家兔复试，检查方法同上。
结果判断在初试的3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超过1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或低于3.5℃，均判定供试品的热原检查符合规定。
2010版药典热原检查法ppt
ΔT2 ΔT1 ΔT3
3只家兔体温升高 均低于0.6℃，但体 温升高的总和达 1.3℃或1.3℃以上
情况1： T1 or T2 or T3≥0.6℃
情况2： T1+T2+T3≥1.3℃
复试需要5只兔子
初试 判断合格
ΔT2 ΔT1 ΔT3 ΔT2 ΔT2 ΔT4 ΔT1 ΔT3 ΔT1＜ 0.6℃ 同时具备 ΔT2＜ 0.6℃ ΔT3＜ 0.6℃ ΔT1+ ΔT2+ ΔT3 ＜ 1.4℃ ΔT1 ΔT5 ΔT3
做完试验后的兔子…
若供试品判定为符合规定: 至少应休息48小时后可重复使用 对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的 供试品在5天内可重复使用1次 若供试品判定为不符合规定: 则组内全部家兔不再使用。
试验前准备
前1-2天： 同一环境 17～25℃ 温差≤3 ℃
家兔在检查前至少2小时开始停止给食，直至检查完毕。 检查用器皿 除热原 应置干烤箱中用250℃加热30分 钟，也可用其他适宜方法。
取适用的家兔3只，测定其正常体温后15分钟内，自家兔耳 静脉缓缓注入规定剂量并预热至38℃的供试品溶液，然后：
第1次 第2次 测体温 第5次 第6次 测体温
兔 子 ×3
测体温
30min
……
测体温
30min
兔体温升高的温度：
ΔT升高=Tmax-T正常结果断判断复试ΔT2 ΔT1 ΔT3
3只家兔中，有1只 家兔体温升高0.6℃ 或0.6℃以上
未曾用于热原检查的 供试品判定为符合规定 但组内升温达0.6℃的 3周内未曾使用的
应在检查供试品前3～7日内预测体温,进行挑选。
挑选试验的条件
第1次 测体温 第2次 测体温 第7次 第8次 测体温
热原检查法
热原检查法标准操作规程家兔法1.实验材料及用具1.1天平精度0.01mg或0.1 mg供试验称量用精度0.1 mg或1 mg试剂称量用精度10g家兔称量用1.2电热干燥箱，250℃以上，受热均匀。
1.3恒温水浴1.4热原测温仪或肛门体温计，精度0.1℃。
1.5家兔固定盒，盒两侧有通气孔。
1.6实验用具注射器、烧杯、三角瓶、大称量瓶、吸管、移液管、表面皿、玻璃棒、广口试剂瓶、直镊、金属制密封器（均需除热原）、时钟、脱脂棉。
1.7试剂75%乙醇、凡士林或50%甘油、生理盐水、灭菌注射用水（经细菌内毒素检，含细菌毒素低于0.25EU/mI）无热原氯化钠（经250℃30分钟或200℃1小时或180℃2小时加热原）。
2.供试品溶液的制备2.1原料药2.1.1精密称定适量，置烧杯、三角瓶或称量瓶中。
2.1.2按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水或无热原生理盐水，搅拌使溶解。
2.2注射液2.2.1用75%乙醇棉球消毒安瓶颈部。
2.2.2精密量取一定量药液。
2.2.3按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水或无热原生理盐水，混匀。
3实验动物3.1健康无伤害、体重1.7kg以上至4.0kg左右同一来源、同一品系、合格的实验用兔，雌兔应孕，1兔1笼，标兔号。
3.2新兔预选3.2.1新兔经同一饲料饲养7日后，进行预测体温，测温的条件与热原检查要求相同。
3.2.2测量体温时，测温仪探头或肛门温度计插入肛门的深度各兔应相同约6cm，测温时间不得少于1.5分钟。
3.2.3每隔30分钟测温1次，共8次。
3.2.48次体温均在38.0℃～39.6℃（一般多选用38.4～39.4℃）的范围内，且最高最低体温差数不超过0.4℃的家兔，可供3周内实验用。
3.2.5录选新兔编号、登记入兔史记录卡，未被录选家兔，可饲养7日再预测体温1次，如仍不符合要求则淘汰。
兔史记录卡内容应包括日期、体重、性别、供试品名、正常体温、温差结果。
3.3家兔的重复使用3.3.1供试品判定为符合规定的家兔，至少应休息48小时，方可供下一次实验用。
热原检查法
热原检查法标准操作规程家兔法1 •实验材料及用具1 -1天平精度0.01 mg或0.1 mg供试验称量用精度0.1 mg或1 mg试剂称量用精度10g家兔称量用1 -2电热干燥箱，250°C以上，受热均匀。
1.3恒温水浴1.4热原测温仪或肛门体温计，精度O.rc。
1.5家兔固定盒，盒两侧有通气孔。
1.6实验用具注射器、烧杯、三角瓶、大称量瓶、吸管、移液管、表面皿、玻璃棒、广口试剂瓶、直锡、金属制密封器（均需除热原）、时钟、脱脂棉。
1.7试剂75%乙醇、凡士林或50%甘油、生理盐水、灭菌注射用水（经细菌内毒素检，含细菌毒素低于0.25EU/ml）无热原氯化钠（经250°C30分钟或200°C 1小时或180°C2小时加热原）。
2•供试品溶液的制备2.1原料药2.1.1精密称定适量，置烧杯、三角瓶或称量瓶中。
2.1.2按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水或无热原生理盐水，搅拌使溶解。
2.2注射液2.2.1用75%乙醇棉球消毒安瓶颈部。
2.2.2精密量取一定量药液。
2.2.3按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水或无热原生理盐水，混匀。
3实验动物3.1健康无伤害、体重1.7kg以上至4.0kg左右同一来源、同一品系、合格的实验用兔，雌兔应孕，1兔1笼，标兔号。
3.2新兔预选3.2.1新兔经同一饲料饲养7日后，进行预测体温，测温的条件与热原检查要求相同。
3.2.2测量体温时，测温仪探头或肛门温度计插入肛门的深度各兔应相同约6cm，测温时间不得少于1.5分钟。
3.2.3每隔30分钟测温1次，共8次。
3.2.48次体温均在38.0°C〜39.6°C （一般多选用38.4〜39.4°C ）的范围内，且最高最低体温差数不超过0.4°C的家兔，可供3周内实验用。
3.2.5录选新兔编号、登记入兔史记录卡，未被录选家兔，可饲养7日再预测体温1次，如仍不符合要求则淘汰。
热原检查法
※热原检查法药检文摘日期:2004-8-11热原检查法1绪言热原也称为发热性物质（日本药局方）''英文叫做Pyrogen，即能够引起恒温动物体温异常升高的物质总称。
与注射剂有关的发热性物质研究可追溯到16世纪。
直到18世纪丹麦生理学家panum的研究中断定，“发热物质是一种对热稳定，溶于水，不溶于乙醇，由活的细菌中来的一类物质，而且微量静注后就能引起高热反应”。
1923年，Seibert肯定地证实了所有注射剂的发热原因是通过革兰氏阴性菌所产生的一种可滤过的高热稳定的热原污染结果。
随后Rademaker进一步证实了Seibert的发现，并进一步强调避免细菌污染的重要性。
之后的共同研究确立了使用家兔检测注射剂及水中致热物质的方法。
这个结果导致了官方的重视，20年后，美国药典于1942年USP12）进行了收载''其后，各国药典相继收载，CHP→1953年''BP→1953年''JP→1951年第6版药局方''半个多世纪来，热原检查法在保证注射剂的安全用药方面发挥了重要作用。
2热原与热原反应热原即发热性物质，目前普遍认为是由革兰氏阴性菌所产生的内毒素（脂多糖），广义说，是所有引起恒温动物体温异常升高物质的总称。
除内毒素引起发热外，还包括病毒，干扰素以及其它种种发热物质。
热原反应是指临床输液反应，如果将携带超量热原物质的注射液静脉输入人体，通常在05-2h 内引起机体严重的临床反应。
表现为：机体外周皮肤血管收缩，停止排汗，散热减少，发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐，严重时可出现昏迷、休克、死亡等一系列临床症状，体温通常可上升至40℃左右。
3热原的本质在自然界，热原分布很广，可以说无处不在，无处不有，关于热原本质的研究，目前在世界范围内，主要存在二种观点。
一种观点是：热原的本质就是革兰氏阴性-菌所产生的细菌内毒素，就注射剂来讲，其输液反应主要来源于细菌内毒素。
热原检查法-程春雷PPT参考课件
3
热原的种类
4
热原检查法简介-2
热原反应
因输注药液引起病人发热、寒战、头痛、昏 迷、休克甚至死亡等反应。热原经静脉注入人 体后15分钟即能产生强烈的发热反应，重者昏 迷甚至危及生命
5
热原检查法简介-3
２、对家兔体重取消了上限3.0kg，同时取消家兔使用 次数不超过１０次的规定。（与国外药典一致、提高 家兔利用率、灵敏度不受影响）
16
修订背景
３、增加了升温达0.6 ℃的家兔应休 息2 周以上新要求。（防止假阳性）
4、实验环境要求更加严格：实验室 与饲养室温度相差由不大于 5 ℃改 为3 ℃
3、 ____*
2005版 体重1.7~3.0kg
——
每一家兔的使用次数，用 于一般药品的检查，不应 超过10次。
*三部仍规定，对血液制品、抗毒素和其他同一过敏 原的供试品在5天内可重复使用1次。
11
2010 版与2005版区别
2010版
2005版
4、在做热原检查前1-2日 在作热原检查前1-2日
112010版2005版4在做热原检查前12日在作热原检查前12日5温度相差不得大于3且应控制在1725指实验室和饲养室实验室和饲养室的温度相差不得大于5实验室的温度应在17256实验室温度变化不得大于3应注意实验室温度变化不得大于32010版与2005版区别122010版与2005版区别2010版2005版7应防止动物骚动防止动物骚动8置于宽松适宜的装置于适宜的装置中9深度一般约6cm时间不得少于15分钟时间不得少于1分半10且同组各兔间正常体温之差不得超过1且各兔间正常体温之差不得超过1132010版2005版11与供试品接触的试验用器皿应无菌通常采用干热灭菌法250加热30分钟也可采用其他适宜的方法试验用器的注射器针头及一切与供试品溶液接触的器皿应置烘箱中用250加热30分钟也可采用其他适宜的方法除去热原2010版与2005版区别142010版2005版123只家兔体温升高总和低于13三部未变仍为1413高于06低于353只家兔体温升高总和低于1406以上352010版与2005版区别151热原实验是一个整体的动物实验易受许多因素的影响
1142热原检査法
表 2-2 耳 用 制 剂 、鼻 用 制 剂 、库 肤 给 药 制 剂 、 吸入制剂抑菌效力判断标准
A 细菌
B
A 真菌
B
减 少 的 lg 值
2d
7d
14d
28d
2
3
—
NI
—
—
3
NI
—
一
2
NI
—
—
1
NI
注 ：N I : 未 增 加 ，是 指 对 前 一 个 测 定 时 间 ，试 验 菌 增 加 的 数 量 不 超 过 0. 5 lg 。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细 菌 内 毒 素 的 量 用 内 毒 素 单 位 （E U )表 示 ，1 E U 与 1 个 内 毒 素 国 际 单 位 （I U ) 相 当 。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成， 用 于 标 定 、复 核 、仲 裁 鲎 试 剂 灵 敏 度 、标 定 细 菌 内 毒 素 工 作 标 准 品 的 效 价 ，干 扰 试 验 及 检 查 法 中 编 号 B 和 C 溶 液 的 制 备 、凝 胶 法 中 鲎 试 剂 灵 敏 度 复 核 试 验 、光 度 测 定 法 中 标 准 曲 线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基 准 标 定 其 效 价 ，用 于 干 扰 试 验 及 检 查 法 中 编 号 B 和 C 溶液 的 制 备 、凝 胶 法 中 鲎 试 剂 灵 敏 度 复 核 试 验 、光 度 测 定 法 中 标 准曲线可靠性试验。 细 菌 内 毒 素 检 查 用 水 应 符 合 灭 菌 注 射 用 水 标 准 ，其内毒 素 含 量 小 于 0_ 015EU/ml( 用 于 凝 胶 法 ）或 0. 005EU/ml(用 于 光 度 测 定 法 ），且 对 内 毒 素 试 验 无 干 扰 作 用 。 试验所用的 器皿需经 处理，以去除可能存在的外源性内 毒 素 。耐 热 器 皿 常 用 干 热 灭 菌 法 （250°C、3 0 分 钟 以 上 ）去 除 ，也 可 采 用 其 他 确 证 不 干 扰 细 菌 内 毒 素 检 査 的 适 宜 方 法 。 若 使 用 塑 料 器 具 ，如 微 孔 板 和 与 微 量 加 样 器 配 套 的 吸 头 等 ， 应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供 试 品 溶 液 的 制 备 某 些 供 试 品 需 进 行 复 溶 、稀释或在 水 性 溶 液 中 浸 提 制 成 供 试 品 溶 液 。必 要 时 ，可调节被测溶液 ( 或 其 稀 释 液 ）的 p H 值 ，一 般 供 试 品 溶 液 和 鲎 试 剂 混 合 后 溶 液 的 p H 值 在 6 .0 〜 8 .0 的 范 围 内 为 宜 ，可 使 用 适 宜 的 酸 、 碱 溶 液 或 缓 冲 液 调 节 p H 值 。酸或碱 溶 液 须用 细 菌 内 毒 素 检 査 用 水 在 已 去 除 内 毒 素 的 容 器 中 配 制 。缓 冲 液 必 须 经 过 验 证 不含内毒素和干扰因子。 内毒 素 限 值 的 确 定 药 品 、生 物 制 品 的 细 菌 内 毒 素 限 值 (L )一般按以下公式确定：
热原检查法
※热原检查法药检文摘日期:2004-8-11 热原检查法1绪言热原也称为发热性物质（日本药局方）''英文叫做Pyrogen，即能够引起恒温动物体温异常升高的物质总称。
与注射剂有关的发热性物质研究可追溯到16世纪。
直到18世纪丹麦生理学家panum的研究中断定，“发热物质是一种对热稳定，溶于水，不溶于乙醇，由活的细菌中来的一类物质，而且微量静注后就能引起高热反应”。
1923年，Seibert肯定地证实了所有注射剂的发热原因是通过革兰氏阴性菌所产生的一种可滤过的高热稳定的热原污染结果。
随后Rademaker进一步证实了Seibert的发现，并进一步强调避免细菌污染的重要性。
之后的共同研究确立了使用家兔检测注射剂及水中致热物质的方法。
这个结果导致了官方的重视，20年后，美国药典于1942年USP12）进行了收载''其后，各国药典相继收载，CHP→1953年''BP→1953年''JP→1951年第6版药局方''半个多世纪来，热原检查法在保证注射剂的安全用药方面发挥了重要作用。
2热原与热原反应热原即发热性物质，目前普遍认为是由革兰氏阴性菌所产生的内毒素（脂多糖），广义说，是所有引起恒温动物体温异常升高物质的总称。
除内毒素引起发热外，还包括病毒，干扰素以及其它种种发热物质。
热原反应是指临床输液反应，如果将携带超量热原物质的注射液静脉输入人体，通常在05-2h内引起机体严重的临床反应。
表现为：机体外周皮肤血管收缩，停止排汗，散热减少，发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐，严重时可出现昏迷、休克、死亡等一系列临床症状，体温通常可上升至40℃左右。
3热原的本质在自然界，热原分布很广，可以说无处不在，无处不有，关于热原本质的研究，目前在世界范围内，主要存在二种观点。
一种观点是：热原的本质就是革兰氏阴性-菌所产生的细菌内毒素，就注射剂来讲，其输液反应主要来源于细菌内毒素。
热原检查法ppt课件
英国药典
≥1.5kg
不限，雌兔 应无孕
20-23℃
—
中国药典
时间
3-7天
给药
N
测量次数
8次 30min/次
选择条件
8次体温均在38.0-39.6℃之间， 且最高与最低体温相差≤0.4℃， 个体间体温差≤1℃ 体温不超过39.8℃，个体间体温 差 ≤ 1℃
美国药典
7天内
N
8次 30min/次 10次 30min/次，舍 去前2次
热原检查法的定义
本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试 品中所含热原的限度是否符合规定
实验耗材去热原
试验用的注射器、针头及 一切和供试品溶液接触的耐高 温器皿,应置烘箱中用250℃加 热30分钟（英国药典200℃1h） 不耐高温器皿可置于30％ 双氧水中浸泡4h，再用细菌内 毒素检查用水充分冲洗，60℃ 烘干备用
新方法原理
外热原 人体（分泌内热原） 体温调节中枢 发热
细胞（分泌内热原）
新方法主要以应用动物来源或人源细胞模拟人体，通过检测内源性热原（主要为细胞因子，如 IL-6、IL-1、TNF-α）在体外进行热原检测。
新方法国外研究现状
国外对新方法的研究始于20世纪80年代，国际发达 国家实验室，包括英国国家生物制品检定所NIBSC、
热原的危害
热原反应：热原进入机体后的数分钟至1小时内,突然发冷、 寒战、面色苍白、四肢冰冷、烦躁不安等症状。持续时间约 0.5~1小时。寒战消失后,随即高热,但也有无寒战期而突然高 热者。病人体温迅速上升,在2~4小时体温上升至高峰,一般在 39~40℃,严重者高达41℃以上,病人面色潮红、头痛、恶心、 呕吐。严重者瞻妄、昏迷,甚至死亡。
发热查课件共19页文档
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still病
诊断标准
每日发热至少2 周以上, 伴有关节炎, 同时伴随以下一 项或更多症状: 1.短暂、非固定的红斑样皮疹; 2. 全身淋巴 结肿大; 3.肝脾肿大; 4.浆膜炎。
应排除下列情况: 1.银屑病; 2. > 8岁HLA-B27阳性男 性关节炎; 3.一级亲属有HLA-B27相关疾病( 强直性脊柱炎、 与附着点炎症相关的关节炎、急性前色素膜炎或骶髂关节 炎); 4. 2 次RF阳性, 2次间隔为3 个月。
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可能的诊断
病毒感染（麻疹、风疹）
支持点：急性起病，发热伴皮疹 浅表淋巴结肿大
不支持点：病程长达半月 无呼吸道症状 血象WBC升高，以中性粒为主
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可能的诊断
still 病
支持点：反复高热至少2周 发热后一般情况较好 散在点状红疹，且随发热出没，抗过敏治疗无效 WBC升高，以中性粒为主，CRP增高 淋巴结肿大，RF（-），血培（-），抗生素效果不好
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可能的诊断
川崎病
支持点：发热，T39-40℃，持续7-14天或更长，抗生素无效 皮肤症状（荨麻疹样皮疹） 颈部淋巴结肿大
不支持点：无眼结合膜充血 无周围肢体的变化（掌跖红斑，硬性水肿） 无唇充血皲裂，口腔黏膜充血，草莓舌
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可能的诊断
淋巴瘤
支持点：急性起病，发热 散在于颈部、腋下、腹股沟等处的淋巴结肿大（表
结缔组织疾病： SLE、still病、川崎病、风湿热等
肿瘤： 白血病、淋巴瘤、恶性组织细胞病、其他恶性肿瘤
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可能的诊断
败血症
支持点：急性起病、高热伴寒战、多个淋巴结肿大 散在红色丘疹 血象：WBC升高，以中性粒为主，CRP增高
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英国药典
≥1.5kg
不限，雌兔 应无孕
20-23℃ 变化≤3℃
—
中国药典
时间
3-7天
给药
N
美国药典 7天内
N
测量次数
选择条件
8次 30min/次
8次体温均在38.0-39.6℃之间， 且最高与最低体温相差≤0.4℃，
个体间体温差≤1℃
8次 30min/次
体温不超过39.8℃，个体间体温 差≤1℃
英国药典
3只体温升高总和＞2.65℃
复试及结果判断:
•
实验步骤
合格
不合格
中国药典
另取5只动物进行 复试，试验方法同
初试
复试5只动物中体温升高≥0.6℃的动物 数不超过1只，合并初试三只动物，体
温升高总和≤3.5℃
复试5只动物中体温升高＞0.6℃的动 物超过1只；或合并初始、复试8只动
物体温升高总和＞3.5℃
3.每隔30min按前法测量其体温1次,共测6次。
4.以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数，当动 物升温为负值时，以0℃计算。
初试结果判断:
合格
复试
不合格
中国药典 美国药典
三只动物体温升高均低 三只动物出现体温升高高于0.6 ℃ ，
于0.6℃，且三只动物体 或者三只动物体温升高总和高于
热原与细菌内毒素的区别
热原物质包括了细菌内毒素，细菌内毒素是众多热原物质 中的一种，也是最主要的一种。
一般来说内毒素是热原,但热原不仅仅包括内毒素。不是每 一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂 多糖都有热原活性。在药品生产质量管理规范（GMP）条 件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在 细菌内毒素意味着不存在热原。
第三节 热原检查法
热原的定义
热原（pyrogen）系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化 学热原等。
这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的尸体 及其代谢产物。大多数微生物都能产生热原，致热能力最强的是 革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌 则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。它的化学结构 是脂多糖和微量蛋白的复合物
热原检查法的定义
本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试 品中所含热原的限度是否符合规定
实验耗材去热原
试验用的注射器、针头及 一切和供试品溶液接触的耐高 温器皿,应置烘箱中用250℃加 热30分钟（英国药典200℃1h）
不耐高温器皿可置于30％ 双氧水中浸泡4h，再用细菌内 毒素检查用水充分冲洗，60℃ 烘干备用
温升高总和低于1.3℃
1.3℃
三只动物体温升高均 低于0.5℃
三只动物出现体温升高数高于 0.5℃
体温升高≥0.6℃的动物数 量超过1只
—
ห้องสมุดไป่ตู้
英国药典
3只体温升高总和 ≤1.15℃
1.15℃ ＜3只体温升高总和≤2.65℃ 2.80℃ ＜ 6只体温升高总和≤4.30℃ 4.45℃ ＜ 9只体温升高总和≤5.95℃
热源的性质
热原除具有很强的致热性外，还具有下列性质： 耐热性：180℃2小时以上或250℃30min以上才能彻底破坏热原。因 此，玻璃制品如生产过程中所用的容器和注射时使用的注射器等，均可 用高温破坏热原。 水溶性：热原能溶于水，可用大量无热原注射用水冲洗以除去热原。 不挥发性：热原本身不挥发，但可随水蒸汽雾滴带入蒸馏水中，故用 蒸馏法制备注射用水时，蒸馏水器应有隔离装置。 滤过性：热原体积极小,直径1~50nm,可通过普通滤器进入滤液中。 不耐强酸、强碱、强氧化剂：热原能被盐酸、硫酸、氢氧化钠、高锰 酸钾、重铬酸钾等所破坏。
初试
1.试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中，使其适应试验环境，饲 养温度与环境温度相差≤±3℃。
2.每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次（英国药典测4次，但前2次舍 去），两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作为该兔的正常 体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃的范围内，且各兔间正 常体温之差不得超过1℃。两次体温的平均值作为兔的正常体温。 2、测定 其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量（10ml/kg）并温热 至约38℃的供试品溶液.
热原的危害
热原反应：热原进入机体后的数分钟至1小时内,突然发冷、 寒战、面色苍白、四肢冰冷、烦躁不安等症状。持续时间约 0.5~1小时。寒战消失后,随即高热,但也有无寒战期而突然高 热者。病人体温迅速上升,在2~4小时体温上升至高峰,一般在 39~40℃,严重者高达41℃以上,病人面色潮红、头痛、恶心、 呕吐。严重者瞻妄、昏迷,甚至死亡。
1-3天
10ml/kg生 理盐水
（38.5℃）
10次
30min/次，舍 去前2次
体温在38.0-39.8℃之间，个体 间体温差≤1℃
注意事项
1. 抓取兔子的正确方法：一手抓持兔颈背部皮毛，一手托起兔臀部。 2. 在热原检查前1～2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室
和饲养室的温度相差不得大于3℃，在试验全部过程中，应注意室温变化不得 大于3℃。 3. 应避免噪音干扰。 4. 整个试验操作过程应尽量轻柔，避免激惹动物，造成体温大幅波动，影响结 果。 5. 家兔在试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中,直至试验完毕。 6. 读取体温：一手拿住体温计尾部，使眼与体温计保持同一水平，然后慢慢地 转动体温计 ，从正面看到水银柱时就可读出相应的温度值 ，切记不可用手 碰触水银球端 7. 静脉给药前需将供试品温热至38℃（美国药典37±2℃，英国药典38.5℃）， 注射要缓慢。
美国药典
另取5只动物进行 合并初试、复试8只动物，体温升高超 合并初试、复试8只动物，体温升高
复试，试验方法初 过0.5℃的动物数≤3只，或者超过3只， 超过0.5℃的动物数＞3只，体温升高
实验动物的选择
—
体重
性别
条件
饲养温度 试验温度
中国药典 美国药典
＞1.7kg ≥2.0kg
不限，雌兔 应无孕
使用7天预养期未见异常的未试动 物，或已试的符合热原规定的动 物。
17-25℃
不限，雌兔 不使用3天内已试动物，不使用热 20-23℃ 应无孕 原试验不合格的动物。
变化≤3℃
选定温度 ±3℃