荧光(荧光显微镜和荧光分光光度计)教学提纲
实验七、荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜使用资料教程
3. 暗视野显微镜观察蛙血细胞（示范）
4. 观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（HE染色）
五、注意事项
1. 荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观 察。
Laser Scanning Confocal Microscope
一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理
1. 普通荧光显微镜的不足
2. 使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅 图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使 用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微 镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下 方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧 光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以 外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是 层次区别的PI AMCA Hoechst 33258 FITC Acridine Orange Acridine Yellow CY3 TRITC Propidium Iodide
激发波长 372 350 365 490 490 470 552 541 530
发射波长 456 450 465 520 590 550 565 572 615
2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理
采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的 光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光 路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到 探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明 针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相 对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的 透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自 焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上 方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光 逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光 点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕 上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。
荧光分析第一章讲课
荧光强度与浓度的关系
荧光强度与浓度成正比
线性范围
在一定范围内，荧光物质的荧光强度 与其浓度成正比，可用于定量分析。
荧光分析方法适用的浓度范围，超出 此范围可能导致荧光强度与浓度关系 偏离线性。
荧光猝灭
当荧光物质浓度过高时，由于分子间 的相互作用，可能导致荧光强度降低， 即荧光猝灭现象。
图像处理系统
将观察到的荧光图像转换为数字信号，并进行处理和 分析
其他辅助设备
荧光标准品
用于荧光分析的定量和定性分析，常用荧光染料或荧光标记物
样品前处理设备
用于样品的提取、纯化、浓缩等前处理步骤，以保证分析的准确性 和可靠性
数据处理和分析软件
用于荧光数据的处理、分析和可视化，提高分析效率和准确性
其他辅助设备
荧光分析第一章讲课
目
CONTENCT
录
• 荧光分析概述 • 荧光分析的基本原理 • 荧光分析的仪器与设备 • 荧光分析的实验方法与技术 • 荧光分析的应用实例 • 荧光分析的优缺点及发展前景
目
CONTENCT
录
• 荧光分析概述 • 荧光分析的基本原理 • 荧光分析的仪器与设备 • 荧光分析的实验方法与技术 • 荧光分析的应用实例 • 荧光分析的优缺点及发展前景
荧光光谱的测定与解析
荧光光谱仪的组成与原理
01
了解荧光光谱仪的基本组成，如光源、单色器、样品室、检测
器等，并掌握其工作原理。
荧光光谱的测定步骤
02
熟悉荧光光谱测定的基本步骤，包括仪器的预热、样品的放置、
光谱的扫描等。
荧光光谱的解析方法
03
荧光显微镜的原理和使用方法课件
目录
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的原理 • 荧光显微镜的使用方法 • 荧光显微镜的维护与保养 • 荧光显微镜的应用实例
01
荧光显微镜简介
荧光显微镜的发展历程
01
02
03
荧光显微镜的起源
19世纪末，随着光学和化 学的发展，荧光显微镜开 始出现。
荧光显微镜的发展
荧光灯泡表面不可直接触摸，清洁时 应使用软布或手套。
清洁载物台
用干燥的软布擦拭载物台，避免污渍 和划痕。
荧光灯泡的更换与保养
更换荧光灯泡
当荧光灯泡亮度降低或出现闪烁时，应更换荧光灯泡。更换时应关闭电源，并按照说明书正确操作。
保养荧光灯泡
荧光灯泡应在低电流下使用，避免频繁开关灯，以延长使用寿命。
常见故障排除与维修
20世纪初，荧光显微镜技 术逐渐成熟，并广泛应用 于生物学、医学等领域。
荧光显微镜的改进
随着科技的进步，现代荧 光显微镜在分辨率、成像 质量、自动化等方面不断 得到提升。
荧光显微镜的基本组成
光源
发出特定波长的光，激 发样品中的荧光物质。
滤色片
选择性地透过特定波长 的光，阻挡其他波长的
光。
物镜
将样品中的荧光图像放 大，并传递给目镜或摄
电源故障
检查电源插头是否松动，电源线 是否破损。如有问题，应更换电
源线或修理电源插座。
图像模糊
可能是镜头污染或载物台移动造成 的。应清洁镜头和载物台，确保其 表面干净无痕。
荧光灯泡不亮
可能是灯泡损坏或电路故障。应检 查灯泡是否正常，如有问题应更换 ；同时检查电路是否正常，如有故 障应及时维修。
05
荧光显微镜的调试
第六章荧光分光光度法
公式成立前提条件：εbc=A<0.05
即：当试样浓度较低时（c<0.05/εb），C与F方成 线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生 无辐射去激活，造成线性偏离。）
第三节 荧光分光光度计
一、基本结构示意图
样品池
光源 激发光单色器
荧光单色器
特点：1 ．光源方向与检测方向成直角； 2 ．二个单色器。
二、问答题
试述分子荧光产生的过程。 试述分子荧光强度与浓度的关系式，并 说明公式成立的前提条件及原因。 分别说明荧光分光光度计两个单色器的 作用，以及将光路设计成直角方向的原 因。 为什么可见光分光光度计的光路是直线 方向，而荧光分光光度计的光路是直角 方向？
荧光分析的激发光谱和 发射光谱分别提供了哪 些定量分析信息？核黄 素的激发光谱（实线） 和发射光谱（虚线）如 图所示，对核黄素进行 荧光定量分析时，最佳 的激发光波长和荧光波 长各为多少？ 为什么？
激发态 无辐射跃迁 亚稳态（三重态） 荧 光 磷 光 基态
最常见的光致发光：荧光和磷光。
两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-9～ 10-6秒，磷光寿命10-3～10秒。 荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的 原子产生，本章介绍分子荧光。 由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光 谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可 见光区。
二、激发光谱和发射光谱
⒈ 激发光谱
固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度 (F) 所作的光谱曲线。
【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。
F
300
350
400
λ(nm)
⒉ 发射光谱 固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F 所作的光谱曲线。
现代仪器分析-荧光分析教案
学习好资料欢迎下载题目：荧光分析法教学目的与要求：（1）掌握分子荧光、磷光和化学发光的产生机理；掌握激发光谱和发射光谱特征。
（2）掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧光（磷光）强度影响因素。
（3）熟悉荧光（磷光）分析法的特点及疋里测定方法。
（4）了解磷光分析法的类型。
（5）熟悉荧光、磷光和化学发光分析仪器的结构。
内容与时间分配：①荧光分析原理：120mi n；②荧光仪器：20min；③分析方法：40min；④磷光分析简介：20mi n；重点与难点：1、荧光的产生；2、荧光光谱与激发光谱；3、荧光与分子结构4、影响因素5、分析方法PPT教具准备:学习好资料欢迎下载荧光分析法（fluorometry ）灵敏度高，紫外—可见法10”g/ml待测物质：分子荧光原子荧光激发光：紫外可见荧光红外可见荧光X—射线荧光1、基本原理利用目一波长得光照射试样，使试样吸收这一辐射，然后再发射出波长相同或较长得光，若这种再发射约在10-9秒内发生，称为荧光，利用荧光得强度和特性对物质进行定性、定量分析，称为荧光分析法。
当分子轨道中电子吸收光子跃迁，若电子跃迁后，处于自旋方向相反得状态，则总自旋量子数S= 0，体系的多重性M=2S+1既为激发态的单线态（此分子在磁场中不产生能级裂分）若电子跃迁后，处于自旋方向相同的状态，则总自旋量子数S=1/2+1/2=1,体系的多重性M=2S+1=3即为三线态（在磁场中，三线态的电子能级产生裂分，一条线可分裂成三条线。
三线态的能量较相应单线态的能量低）。
［电子由单T单跃迁，所需E<E2（单T三）由于单 > 三的跃迁使禁阻的，所以摩尔吸光系数£小］分子在室温基本处于电子跃迁的级态，吸收了可见-紫外光后，基态分子只能跃迁到激发单线态的各个不同振-转能阶，而不能直接跃迁到激发三线态的各个振-转能级（自旋禁阻定律）紫外-可见光照射物质，基态分子不断跃迁到激发态，则分子的紫外吸收应逐渐减小至消失，但事实上物质分子能够连续吸收紫外-可见光，说明存在一条或多条从分子激发态往基态的途径。
荧光检测操作规程
荧光检测操作规程1. 引言荧光检测是一种常用的生物学实验技术，广泛应用于分子生物学、细胞生物学、药物研发等领域。
本文档旨在介绍荧光检测的基本操作规程，包括实验前准备、仪器操作、数据分析等方面的内容，以帮助实验人员正确进行荧光检测实验并获得可靠的结果。
2. 实验前准备在进行荧光检测实验之前，需要进行一些实验前准备工作。
2.1 实验材料准备准备充足的实验材料，并保证其质量和纯度。
常用的实验材料包括荧光探针、试剂盒、实验动物样品等。
根据具体实验要求，选择适当的实验材料。
2.2 仪器设备准备确保荧光检测所需的仪器设备正常运行。
常用的仪器设备包括荧光显微镜、荧光分光光度计、流式细胞仪等。
在实验开始前，检查仪器设备的状态，确保其正常工作。
2.3 样品处理准备对样品进行适当的处理和准备。
根据实验要求选择适当的样品处理方法，如提取样品总RNA、制备蛋白质样品等。
确保样品处理的准确性和实验结果的可靠性。
3. 仪器操作在进行荧光检测实验时，需要正确使用仪器设备，并根据实验要求进行仪器操作。
3.1 荧光显微镜操作荧光显微镜是用于观察荧光信号的重要仪器。
在操作荧光显微镜时，需要注意以下几点：•打开荧光显微镜前，确保其内部和镜头表面已经清洁，避免灰尘等杂质对观察结果的影响。
•根据实验要求选择合适的荧光探针，并进行标记处理。
•将标记好的样品加到载玻片上，加入适当的显微镜缓冲液。
•将载玻片放入荧光显微镜载物台上，调节适当的放大倍数和曝光时间。
•观察荧光显微镜图像，记录相关数据或拍摄图像。
3.2 荧光分光光度计操作荧光分光光度计是用于荧光信号检测和定量的重要仪器。
在操作荧光分光光度计时，需要注意以下几点：•打开荧光分光光度计前，先进行空白校准，以消除仪器背景信号的影响。
•根据实验要求选择适当的荧光探针，并进行标记处理。
•将标记好的样品加入荧光分光光度计样品池中，调节适当的激发波长和发射波长。
•测量样品的荧光强度，并记录测量结果。
荧光显微镜使用方法和荧光显微镜操作规程
荧光显微镜使用办法和荧光显微镜操纵规程之老阳三宣布时间:2011-06-15荧光显微镜使用办法和荧光显微镜操纵规程荧光显微镜是光学显微镜中的一种.关头字：荧光显微镜使用办法荧光显微镜操纵规程荧光显微镜使用荧光显微镜使用办法和荧光显微镜操纵规程1. 用窗帘遮蔽光线,封闭房间内的灯光,除去显微镜的防尘罩,确保显微镜灯室通风良好、无遮盖.装上汞灯灯箱,并转动灯箱卡圈上的拨杆,将灯箱与镜臂连接.2. 将汞灯灯箱的电源插头拔出荧光电源箱后的插座,再将荧光电源箱的插头拔出220V外接电源.3. 打开电源开关,电压表显示出电源电压,如电源电压动摇不大于额外电压值的±5%,即可按下启动开关点燃汞灯,如因天气太冷或电压不稳定等原因,一次启动未点燃汞灯,可以多揿动几次.待超高压汞灯弧光达到稳定状态并达到最大发光效率,即可开始任务.4. 灯泡的调中：（1）任选一块标本放在载物台上.（2）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路,转动滤色片组转换手轮,将紫光（Ｖ）或蓝光（Ｂ）或绿光（Ｇ）激发滤色片组转入光路,并将10×荧光物镜转入光路.（3）调节粗微调手轮,将标本像调焦清晰.（4）前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆,使视场光栏成像清晰,转动视场光栏拨杆将视场光栏收小,调节视场光栏调中螺钉使视场光栏居中,然后再将视场光栏开至最大.（5）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移入光路,前后调节灯箱上的聚光镜拨杆,使汞灯的弧光在视场内成像清晰.（6）调整灯箱上的灯泡水平调节螺钉和垂直调节螺钉,使汞灯的弧光居中.（7）调整反光镜水平调节螺钉和垂直调节螺钉,使光源的反射像与汞灯的弧光分隔.（8）转动聚光镜旋钮把聚光镜移出光路,此时视场照明均匀.5. 荧光不雅察：（1）将荧光染色标本放到载物台上.（2）将10×平场物镜或40×荧光物镜转入光路,调节载物台纵横移动手轮,将标本移入光路.（3）转动滤光片转换拨轮,将荧光染色标本所需要的激发滤光片组转入光路.激发滤光片组编号刻在滤片组转换拨轮上.滤光片选择正确与否,是荧光显微镜能否得到正确应用的关头.选用滤光片时,必须遵守斯托克斯定律：激发滤光片的透射波长＜双色束别离器的透射波长＜阻断滤光片的透射波长.由于激发滤光片、双色束别离器和阻断滤光片,出厂时已按其用途和自己的光学特性进行了严格的组合匹配,在不雅察和摄影时,只需选择滤光片组即可.（4）调节粗调手轮,当看清荧光图像轮廓后,再用微调手轮调焦,直至看到清晰的荧光图像.（5）当需要得到较强的荧光图像时,可转动聚光镜旋钮把聚光镜移入光路,可获得较明亮的荧光图像.（6）当需要使用40×或100×荧光物镜不雅察时,应在标本和物镜间加上甘油,油中不克不及有影响不雅察的小泡或杂质.使用时可使甘油慢慢浸润一会儿,然后轻轻左右来回转动物镜转换器以排除气泡.6. 荧光显微摄影——显微镜摄像头由于荧光图像一般均较明场不雅察暗得多,所以进行荧光显微摄影需要较长的曝光时间,在曝光时应注意避免仪器震动.荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分需要,由于荧光很易褪色减弱,要即时摄影记录结果.办法与普通显微摄影技术基底细同.因紫外光对荧光猝灭作用大。
荧光显微镜操作手册说明书
荧光显微镜操作手册说明书荧光显微镜是一种重要的显微镜，常用于生物医学研究、细胞生物学、遗传工程和药物研发等领域。
本操作手册将详细介绍荧光显微镜的使用方法和注意事项，以帮助用户正确、高效地操作荧光显微镜。
在开始操作之前，请确保仔细阅读本手册，并按照指示进行操作。
材料准备在使用荧光显微镜之前，需要准备以下材料：1. 标本或样品：根据实验的需要，准备好荧光标记的细胞、组织或其他待观察的物质。
2. 封片：将标本放置在封片上，以便于放置到显微镜观察。
3. 荧光染料：根据实验需求，选择适当的荧光染料，并按照说明书的要求进行染色。
操作步骤以下是荧光显微镜的基本操作步骤：1. 准备显微镜：a. 检查显微镜是否处于正常工作状态，确保电源连接正常。
b. 调整光源的亮度，以便于观察样品。
c. 确认滤光片的波长与荧光染料的激发波长相匹配。
2. 样品安装：a. 将封片放置在显微镜的物镜台上，并通过样品夹固定。
b. 调节物镜的焦距，以获得清晰的视野。
3. 荧光设置：a. 根据荧光染料的激发波长，选择合适的滤光片，并将其安装在显微镜上。
b. 调节荧光染料的激发光源，确保样品被充分激发。
4. 观察：a. 使用目镜对准感兴趣的区域，并调节放大倍数，以获得所需的放大效果。
b. 使用荧光滤光片，观察样品的荧光发射情况。
c. 调节显微镜的对焦，以获得清晰的图像。
注意事项为了保证操作的准确性和安全性，请遵守以下注意事项：1. 操作前请佩戴个人防护装备，如实验手套和护目镜。
2. 避免直接暴露在荧光光源下，以免眼睛受伤。
3. 调节荧光染料激发光源的强度时，逐渐增加光线强度，以避免损坏样品。
4. 操作完成后，请关闭显微镜和荧光光源，并将其清洁干净。
维护保养及时进行维护保养可以延长荧光显微镜的使用寿命和保证其正常工作。
以下是一些建议的维护保养步骤：1. 定期清洁显微镜的透镜和物镜，避免灰尘和污垢的影响。
2. 注意橡胶密封件的保养，防止老化和松动。
荧光分光光度计使用操作步骤PPT.
• ！！Attention：Data Start/End需与 “Instrument”选项中设置一致，否则所得 到的数据点会逐渐减少，而无法作图。
（4）参数设置好后，点击“确定”。
4、设置文件存储路径
（1）点击扫描界面右侧“Sample”
，如
图4。
图4 Sample选项的界面
• （2）样品命名“Sample name”。
图6 关闭运行软件
• （2）约十分钟后，关闭仪器主机电源，即按下仪 器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）。 （目的是仅让风扇工作，使Xe灯室散热）。
• （3）关闭计算机。
寻找激发波长的方法
测试前，激发波长未知，可以按照以下步骤寻找激发波长。
谢谢观看！ 安全管理工作职责
评价蒸发过程的两个主要技术经济指标：能耗即操作费用与设备投资。对于多效蒸发装置来说，需考虑操作费与设备费总和为最小的 原则来权衡最佳的效数。在单效蒸发过程中，每蒸发1kg的水需要消耗1kg以上的加热蒸汽，在规模生产中，蒸发大量的水分时则必需 消1、耗认大识量生的活加中热常蒸见汽变。质为食了物节的省特加征热。蒸汽的消耗，可采用多效蒸发。 43． 、班吃主了任有应毒结的合动植《物学，生也管会理这规样章中制毒度，汇这编种》叫对做本有班毒学动生植进物行食校物园中安毒全。教育，做到经常、及时、有针对性。 当(7)溶洗液澡雾时化间成不雾宜滴过时长，，必一须般向半分小散时液左滴右供。给洗一后定不的在能澡量堂，内用久来留克。服在形成新的更多表面的表面张力和拈滞力。 Ⅲ一由个于 公溶司液的中老液总位来高到度某所专产营生店的，静他压想力给而主引管起销的售沸的点副升总高配。一液辆层车高。度他过看高了，一静款压车力后增觉大得，很溶不液错沸，腾 价蒸格发方需面要也克没服问这题种。静这压时力销后售才人能员进说 一：步“蒸 既发然，你会都导满致意沸了点，升那高我。们就可以办手续了。”
荧光(荧光显微镜和荧光分光光度计)
7 荧光分光光度计
荧光分光光度计工作原理： 由光源氙狐灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发 光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光 物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照 射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放 大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动 的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅， 固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波 长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱 （emission spectrum），简称荧光光谱。
药物筛选 荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一 荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断 信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP 分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光 探针 。
标记的蛋白质进行细胞内的活体观察
（3） 荧光原位杂交 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是用标记的核 酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期 核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。
荧光技术
韩东洺 细胞生物学科 2014-11-5
2015年6月15日
1 荧光和荧光素 利用较短波长的光(激发光)照射样品，使样品 受到高能量激发，产生较长波长的荧光(发射光)， 用来观察和分辨样品中产生荧光的物质的成分和位 置。
2 常见荧光素：
（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)
6 使用荧光显微镜的注意事项
（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改 变程序。 （2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压 汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗 室，再开始观察标本。 （3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。 （4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强 度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光 也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。
操作手册荧光显微镜使用方法说明书
操作手册荧光显微镜使用方法说明书一、概述荧光显微镜是一种高级显微镜，采用荧光技术来增强样本的分辨率和对比度，广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。
本操作手册旨在为用户提供荧光显微镜的正确使用方法和注意事项。
二、准备工作1. 确保荧光显微镜已经连接好电源并打开开关。
2. 检查样本是否准备完毕，确保样本已标记荧光染料。
3. 确认荧光显微镜的荧光滤光片组件已安装并与荧光染料相匹配。
4. 检查其它辅助设备，如计算机和相机连接线是否插入正确。
三、基本操作步骤1. 调节镜筒高度，使样本平面与物镜焦平面相等，获得清晰的图像。
2. 选择适当的目镜和物镜，插入物镜并旋转使其锁定。
3. 调节瞳孔间距，将左眼和右眼的视觉合并为一个图像。
4. 调节荧光照明强度，选择适当的亮度以保证荧光信号的检测。
5. 观察样本，在目镜中寻找荧光信号，调节焦距和聚焦，以获得最佳的视觉质量。
6. 调节荧光滤光片，根据染料的激发光和发射光波长选择相应的滤光片。
四、注意事项1. 使用前请确保已仔细阅读用户手册，并按照操作指南使用设备。
2. 避免荧光照明强度过高，以免损坏样本或减少荧光信号的可见性。
3. 定期清洁荧光显微镜的光学元件，以保持良好的成像质量。
4. 在操作过程中避免触摸镜片和荧光滤光片，以免污染或划伤。
5. 使用后，请关闭荧光显微镜并断开电源，以节约能源并延长设备寿命。
五、故障排除1. 如果荧光信号非常弱，请检查荧光滤光片是否正确安装并且与染料匹配。
2. 如果图像模糊或不清晰，请确保样本调焦正确，并检查物镜是否清洁。
3. 如果荧光显微镜无法打开或没有电源供应，请检查电源线是否连接稳定。
4. 如果设备出现其它问题，请参考用户手册或联系厂商技术支持。
六、安全警示1. 使用荧光显微镜时，请注意避免直接观察强烈的荧光光源，以免对眼睛造成伤害。
2. 在操作荧光显微镜时，请保持仪器的稳定，并避免碰撞或摔落。
七、维护保养1. 定期进行荧光显微镜的清洁和维护，清除灰尘和污垢。
荧光分光光度计课件
定期校准与维护
定期校准
按照仪器说明书要求，定期进行校准，以确保仪器准确性。
维护保养
根据仪器使用情况，定期进行保养，包括清洗光学元件、更换滤光 片、清洁机械部分等。
联系专业人员
如遇到无法解决的问题，应联系专业人员进行维修。
05 荧光分光光度计的实验技术与应用
CHAPTER
荧光光谱的测量技术
荧光光谱的测量技术
激发光谱的测量
通过测量荧光物质在不同波长激发光下的 发射光谱，可以了解荧光物质的性质和结 构。
通过改变激发光的波长，测量荧光发射光 谱的变化，可以得到荧光物质的激发光谱 。
发射光谱的测量
同步荧射光谱。
特点
具有高灵敏度、高分辨率和高精度等 优点，广泛应用于化学、生物学、医 学和环境科学等领域。
工作原理
激发光源
通常采用高压氙灯或激光器作为激发 光源，能够发出紫外或可见光。
激发光照射样品
激发光照射到样品上，使样品中的荧 光物质吸收光能并跃迁至激发态。
荧光发射与光谱分离
荧光物质从激发态回到基态时释放出 荧光，通过光谱分离技术将不同波长 的荧光分开。
数据采集与分析
数据采集
启动测量程序，开始采集数据，记录荧光光谱图及相关参数。
数据处理
对采集到的数据进行平滑处理、背景扣除等操作，以提高数据质量。
结果分析
根据测量需求对数据进行进一步分析，如荧光量子产率计算、动力 学分析等。
04 荧光分光光度计的维护与保养
CHAPTER
日常保养
清洁仪器表面
每天使用后，用软布擦拭仪器表面，保持清洁。
通过比较不同浓度的标准荧光物质的量子产率，可 以得到荧光物质的量子产率。
原子荧光分光光度计现场培训内容
现场培训内容一、仪器操作和软件使用仪器软件的安装，选项/仪器及用户参数的设置。
仪器的基本工作原理及所需试剂的浓度及配制方法（参照原子荧光分析方法手册）。
仪器的操作规程、仪器条件的选择、各项参数的设置、软件各项功能的使用。
二、仪器使用注意事项1、仪器的外部使用条件：实验室温度在15度至30度之间，湿度小于75%。
应配备精密稳压电源且电源应有良好接地。
仪器台后部距墙面应50厘米距离，便于仪器的安装与维护。
2、对气体、器皿和试剂的要求：氩气纯度大于99.99%，配备标准氧气减压表。
玻璃器皿应清洗干净用酸浸泡且为原子荧光专用。
试剂的纯度应符合要求，储备液应定期更换，使用液和还原剂应现用现配。
3、更换元素灯时一定要关闭主机电源。
4、注意开机的顺序为计算机、仪器主机、顺序注射或双泵。
5、仪器使用前应检查二级气液分离器（水封）中是否有水。
6、测量前仪器应运行预热一小时。
7、测量过程中不能进行其它软件操作。
8、注意反应过程中气液分离器中不能有积液。
9、样品必须澄清不能有杂质，不能进浓度过高的标准和样品（As<100ppb、Hg<10ppb）。
三、仪器的日常维护1、更换元素灯和调光的方法。
2、拆装原子化器及更换炉芯、炉丝的方法。
3、进样系统各种管路的作用与更换。
4、蠕动泵压块压力的调节方法，泵管定期滴加硅油；不测量时应打开压块，不能长时间挤压泵管。
5、拆装注射器及清洗的方法，定期检查注射器连接是否松动并拧紧（仅限9系列仪器）。
6、测量结束后一定用纯水清洗进样系统。
7、注意运行清洗程序时只能进纯水，绝对不能进其它试剂（仅限9系列仪器）。
8、试验结束后一定将仪器及台面清理干净，避免腐蚀仪器。
9、定期开机运行仪器（每周一次）。
四、简单故障的排除1、通讯失败的处理方法：按照规定的开机顺序开机重试。
检查串口电缆是否连接好，重装操作系统或仪器操作软件。
2、测量过程中死机地处理方法：软件干扰，卸载或关闭可能产生干扰的软件（如杀毒软件等）。
实验荧光显微镜的使用演示文稿
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反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜
标本
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汞灯
激发滤色镜
反射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜
紫外线 保护罩
激发滤色镜 孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
分色镜
汞灯
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荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
DAPI
372
456
AMC A
350
450
Hoe chst 33258
365
465
FITC
490
520
Acridine O range 4 9 0
590
Acridine Ye llow
470
550
C Y3
552
565
TRITC
541
572
Propidium Iodide 5 3 0
转变为高能状态，再回到低能状态时释放出 的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
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荧光的性质
保持固有的荧光特性
n荧光波长＞激发波长
n荧光强度极小于激发光的强度
n有不同程度的衰减 n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效 率
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暗场聚光镜
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汞灯箱
激发滤色镜
透射荧光显微镜原理
目镜
透射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
物镜
暗场聚光镜
荧光(荧光显微镜和荧光分光光度计)学习资料共45页文档
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26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
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27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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荧光(荧光显微镜和荧光分光光度计) 学习资料
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 15、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
荧光显微镜的原理和使用方法2讲课文档
其中在365nm和435nm处有两个高峰。
• 滤色镜系统:荧光显微术的滤色镜，按用途或功能， 主要分为下列两类：
• 激发滤色镜（exciter filter）:激发滤色镜的作 用，在于为被检样品的荧光染料提供最佳波段的 激发光。荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰 值），利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用 其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激 发高峰）的激发滤色镜，以便从汞灯发出的广谱 光波中，选择透过最宜波段的光线供用。
汞灯的构件，中间为一球形石英玻璃管，有两个 钨电极，内充汞滴和少量氩氖混合气体。汞灯装 在牢固的灯室中，有调中、聚焦和集光装置。使 用中严禁频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，不可
切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭后， 不能立刻点亮，经5～10mi的发射光谱为200～600nm，
• 细胞内大部分物质经短光波照射后，可发出较弱 的自发性荧光。有些细胞成分与能发出荧光的有 机化合物——荧光染料结合。激发后呈现一定颜 色的荧光，借以对组织进行细胞化学的观察和研 究。
• 2.1 荧光显微镜的基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号的不同，结构
各异，但主要构件，基本相同。
• 光源:采用高压汞灯。汞灯能以最小的表面发出最 大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳定。
透射式荧光显微镜效果图
透射式荧光显微镜光路图
• 2．落射式荧光显微镜 ：这是近代发展起来的新 式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下
落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器 和收集荧光的物镜(图2―6)。光路中需加上一个 双色束分离器，它与光铀呈45°角，激发光被反 射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧
光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发
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荧光光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯
滤色系统： 激发滤色片：置于光源与物镜之间，用于选择激发光范 围，只有能激发荧光染料发光的特定波长 的光通过。 阻挡滤色片：物镜和目镜之间，选择性通过特异的荧 光，呈现专一的荧光色彩。
光路
透射荧光显微镜光路(a)
（二）盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用 干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起 不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利 通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在 标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重 迭或杂质掩盖，影响判断。
荧光分光光度计的基本结构是 : 光源 单色器或滤光片 样品池 单色器或滤光片 检测器荧光分光 Nhomakorabea度计原理图
注意事项：
（1） 注意开机顺序。 （2） 注意关机顺序。 （3） 为延长仪器使用寿命，扫描速度、负高
压、狭缝的设置一般不宜选在高档。 （4） 关机后必须半小时（等氙灯温度降下）
方可重新开机。
8 荧光技术的应用
（四）封裱剂 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮
度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和 0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。
（五）镜油 一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜
油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石 蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
荧光技术
韩东洺 细胞生物学科
2014-11-5
1 荧光和荧光素
利用较短波长的光(激发光)照射样品，使样品 受到高能量激发，产生较长波长的荧光(发射光)， 用来观察和分辨样品中产生荧光的物质的成分和位 置。
2 常见荧光素：
（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) （3）四甲基异硫氰酸罗丹明
6 使用荧光显微镜的注意事项
（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改 变程序。
（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压 汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗 室，再开始观察标本。
（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。
（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强 度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光 也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。
(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) （4）镧系 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）
（6）多甲藻叶绿素蛋白 （peridinin chlorophyll protein， PerCP）
（7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）
（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“-”—无或可见微 弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明 亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。
7 荧光分光光度计
荧光分光光度计工作原理：
由光源氙狐灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发 光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光 物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照 射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放 大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动 的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅， 固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波 长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱 （emission spectrum），简称荧光光谱。
落射荧光显微镜光路(b)
透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反
射进入物镜。
5 荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸 收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁， 厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
3 合适荧光素的选择：
(1)具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 (2)荧光效率高，标记后下降不明显。 (3) 荧光色泽与背景色泽对比鲜明。 (4)标记后能保持生物学活性和免疫活性。 (5)标记方法简单、快速。 (6)安全无毒
4 荧光显微镜（fluorescence microscope）
荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一 些附件(如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器和阻断 滤片等)的基础上组成的。
（1） 免疫荧光技术 用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的
物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术 对其进行分析的方法。
将抗原或抗体与荧光染料连接，用于检测相应特异性的 抗体或抗原的方法称“直接免疫荧光技术(direct immunofluorescent technique)”。
当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器的光栅固定在最适 当的荧光波长处，只让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的 激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录的光谱即激发光谱 （emission spectrum）。
当进行样品溶液的定量分析时，将激发光单色器固定在所 选择的激发光波长处，将荧光单色器调节至所选择的荧光波长 处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节 省时间， 保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始 就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后 才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。
（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标 本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间防止封 裱剂蒸发。