胶体金试纸条的制备PPT
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胶体金检测试纸生产工艺
胶体金检测试纸生产工艺本项目主要从事犬、猫传染病抗体胶体金检测试纸的生产，以微孔滤膜为固相载体，膜上包被已知抗体，待加入检测样本后，经毛细管虹吸作用或微孔滤膜的渗滤作用，使标本中的抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再通过胶体金标记物与复合物反应，可形成肉眼可见的红色产物。
目前应用最为广泛的胶体金免疫技术有侧向横流模式，又称金标免疫层析法（ImmUnOgoIdChrOmatograPhyASsay,GICA ）O金标免疫层析法试纸条主要是通过毛细管虹吸作用反应,它由以下几部分组成:样品垫、胶体金垫、NC 膜（硝酸纤维素膜）、吸水滤纸、以及PVC 底板，NC 膜（硝酸纤维素膜）上包括一条检测线（T 线）和一条质控线（C 线）一次层叠起来，如下图所示：图3 金标免疫层析法示意图在吸水材料的牵引下，待测抗原在试条上向上走，首先与金标抗体结合成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物上行到检测线时，被测抗原的另一结合位点与包被在此处的单抗结合，形成两个抗体结合一个抗原（双抗体夹心）的金标复合物，因有金颗粒在此沉积，故T 线显红色。
未结合抗原的金标抗体上行到C 线时，与“抗金标抗体”结合，所以C 线也显红色。
检测结果判定：T 线与C 线均显线，表明检测结果为阳性；C 线显线，T 线不显，表明结果为阴性。
若C 线不显线，则检测结果无效。
工艺流程如下所示：NC«（跚咬纤假素膜）PVC 底板 测试线（TtK 1）M 析方向样品稀释液噪声：N ；一般固体废物：不合格品(S1)；废防粘纸(S2)；边角料(S3)；废包装物(S4)；危险废物：废一次性滴管(S5)玻璃器具清洗废水(S6)；玻璃器具淋洗废水(S7)；超声波清洗废水(S8)、超声波冲洗废水(S9)o图4胶体金检测试纸生产过程示意图工艺流程简述： (1)检测：外购硝酸纤维素膜、金结合垫、吸水垫、样品垫均人工目视进行检验。
①硝酸纤维素膜：人工目视干燥后的包被膜表面应洁净、无污染、破损等，如有，需用笔标出。
《胶体金检测技术》ppt幻灯片
培训资料
12
培训资料四、B-激动剂检测卡快速筛查尿样的方法介绍以盐酸克伦特罗胶体金快速检测卡为例一 .适用范围：主要用于定性检测，测定动物尿液，如猪尿、牛尿、羊尿等样品中盐酸克伦特罗的残留。整个检测过程只需要5~10分钟左右，灵敏度为3 ng/ml(3ppb) 。 也就是说当尿液中盐酸克伦特罗的残留大于或等于3 ng/ml 时，检测卡才 能检测到。
培训资料
23
培训资料六、发展方向(Developing)1.标记技术的探索顺磁粒子标记、量子点标记
免疫反应信号转化为电子信号模式
mndad/-CenjuyateSwhatratePeristaltiepurmP
2.生物传感器
wit.(b)(o)
oistansNc sbnste
培训资料
Sample Well
培训资料
20
培训资料五、常见问题及注意事项1.使用前将检测卡和待检样本恢复至室温2.保持干燥，避免受潮，打开包装请尽快使用试纸条中的NC膜受潮后，尿样在上面无法正常泳动，无法到达吸水纸的位置；胶金垫上的金标抗体受潮后会变性，从而失去原有的生理性功能，影响抗原抗体的选择性反应。因此，试纸条必须保持干燥，从包装袋中取出后要尽快使用。3.检测时，避免阳光直射和电风扇、空调的风直吹
免疫胶体金快速检测技术
农业部饲料质量监督检验测试中心(西安)
主要内容一、免疫胶体金技术的发展历史二、 胶体金检测卡的基本原理及构造三、 免疫胶体金层析法检测原理及应用四、S-激动剂检测卡快速筛查尿样的方法介绍五、 常见问题分析与注意事项六、 免疫胶体金技术的发展的方向
培训资料
2
培训资料一 、免疫胶体金技术的发展史1. 1939年(英，植物) Kausche 和Ruska 把烟草叶病毒吸附在金颗粒上，在电子显微镜下观察呈现高电子密度的细状颗粒，开启了免疫胶体金技术的研究。2. 1971年(美，微生物) Faulk 和Taylor 首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直于检测沙门菌的表面抗原。3 . 1974年(奥) Romano 等将胶体金标记在马抗人IgG 上，实现了间接免疫金染色法。同年Bauer 等报道将胶体金标记在凝集素上的应用。
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培训资料四、B-激动剂检测卡快速筛查尿样的方法介绍以盐酸克伦特罗胶体金快速检测卡为例一 .适用范围：主要用于定性检测，测定动物尿液，如猪尿、牛尿、羊尿等样品中盐酸克伦特罗的残留。整个检测过程只需要5~10分钟左右，灵敏度为3 ng/ml(3ppb) 。 也就是说当尿液中盐酸克伦特罗的残留大于或等于3 ng/ml 时，检测卡才 能检测到。
培训资料
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培训资料六、发展方向(Developing)1.标记技术的探索顺磁粒子标记、量子点标记
免疫反应信号转化为电子信号模式
mndad/-CenjuyateSwhatratePeristaltiepurmP
2.生物传感器
wit.(b)(o)
oistansNc sbnste
培训资料
Sample Well
培训资料
20
培训资料五、常见问题及注意事项1.使用前将检测卡和待检样本恢复至室温2.保持干燥，避免受潮，打开包装请尽快使用试纸条中的NC膜受潮后，尿样在上面无法正常泳动，无法到达吸水纸的位置；胶金垫上的金标抗体受潮后会变性，从而失去原有的生理性功能，影响抗原抗体的选择性反应。因此，试纸条必须保持干燥，从包装袋中取出后要尽快使用。3.检测时，避免阳光直射和电风扇、空调的风直吹
免疫胶体金快速检测技术
农业部饲料质量监督检验测试中心(西安)
主要内容一、免疫胶体金技术的发展历史二、 胶体金检测卡的基本原理及构造三、 免疫胶体金层析法检测原理及应用四、S-激动剂检测卡快速筛查尿样的方法介绍五、 常见问题分析与注意事项六、 免疫胶体金技术的发展的方向
培训资料
2
培训资料一 、免疫胶体金技术的发展史1. 1939年(英，植物) Kausche 和Ruska 把烟草叶病毒吸附在金颗粒上，在电子显微镜下观察呈现高电子密度的细状颗粒，开启了免疫胶体金技术的研究。2. 1971年(美，微生物) Faulk 和Taylor 首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直于检测沙门菌的表面抗原。3 . 1974年(奥) Romano 等将胶体金标记在马抗人IgG 上，实现了间接免疫金染色法。同年Bauer 等报道将胶体金标记在凝集素上的应用。
实验胶体金、免疫荧光15页PPT
胶体金免疫层析
实验所用试剂全为干试剂，多个 试剂被结合在一个约 6mm*70mm的塑料板条上，试 纸条两端附有吸水材料，成为单 一试条，实验过程短，是“床边 检试剂采用双抗体夹心一步法 技术，以胶体金为指示标记，检测尿液 中HCG浓度。
原理
A
B
A
B
A
B
实验方法
将试纸条从冰箱中取出，置室温 下放置一定时间，让其充分复温。
取出试纸条，将有箭头的一端插 入尿液中，其深度不得超过标志 线，约5s后取出平放，5min内 观察结果。
结果判断
TC
阳性 阴性 无效
实验结果
结果报告
待测标本HCG检测
性
阳性：两条紫红色条带出现。一条 位于测试区（T）内，另一条位于质 控区（C）。表明已怀孕
对照线与检测线均不出现色带，表明 发生检测错误应重试；当HCG浓度很 高时检测线很明显，对照线可能变得 很弱，为正常结果；
子宫肿瘤、葡萄胎或更年期病人，因 尿中HCG含量较高，可能会出现阳性 结果。
注意事项
（1）打开层析条包装后应在1h 内应用。
（2）将层析条插入样品中，样 品的液面不能超过试剂条的标记 线。
16、云无心以出岫，鸟倦飞而知还。 17、童孺纵行歌，斑白欢游诣。 18、福不虚至，祸不易来。 19、久在樊笼里，复得返自然。 20、羁鸟恋旧林，池鱼思故渊。
实验胶体金、免疫荧光
实验七、胶体金、免疫荧光
实验内容
一步金法早早孕妊娠诊断
一步金法早早孕妊娠诊断
实验原理 实验方法 实验结果与讨论 思考题
思考题
1、试述一步金法早早孕妊娠 诊断实验原理
2、金标法的优缺点？
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
胶体金介绍ppt课件-PPT课件
3、PVC板 PVC板是用来承载膜、金子、 辅料等成分的底板，它是试纸 条的骨架。 PVC板的标准：板上的粘性 要适中；板的长度要合乎规格； 板的硬度也要达到一定的标准。
评价一个试剂的标准
评价一个试剂好坏的标准有： 1、灵敏度 2、特异性 3、背景 4、吸样和上样 5、和对照试剂比较 6、市场反馈 7、检验机构的评价
结果判读
怀孕
与常规诊断方法相比
优点 快速：全部检测过程仅需 3-10分钟。 简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专 业人员，携带方便，可随时随地进行。 廉价：单个测试条成本极低 可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可立 刻拿到结果，不必等待。 稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。 检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液， 因而适合各种检查 缺点 定量问题 灵敏度问题
试纸条组成结构
胶体金垫 样品垫 控制线（C线） 吸水滤纸
PVC底板
层析方向 测试线 （T线）
NC膜（硝酸纤维素膜）
胶体金层析法一般原理介绍
（双抗体夹心）
（以HCG检测为例）
视频
早早孕产品形式
图片
形式
试纸条
卡型
笔型
电子验孕笔
价格
最经济
3-5元
5-10元
>$5.0
（国外价格）
使用方法
1.试纸：将试纸条标： “MAX”一端浸入尿液，尿液液面请勿 超过标志线，待尿液爬至观察区后取出试纸条平放。3-5分钟 观察结果，10分钟后无效。 2.用吸管吸取尿液，加入4滴到检测卡的加样孔中，3-5分钟观察 结果，10分钟后无效。 3.将尿液滴加到试纸上或直接淋在检测笔的吸尿棒上，尿液爬上 后平放，10分钟观察。
胶体金技术简介 ppt课件
稳定性好：金标试剂稳定，可长期室温保存
检测标本种类多：既可用于测血清/血浆/全血，又可用于测 尿或唾液,或处理后的组织等固体样品
6
免疫层析法应用领域
类别 人类医学
农牧业 环境 食品安全
应用领域
检测的物质
各级医院,血站,CDC,防 疫站,诊断中心；家庭
自检；商检系统；边检 口岸；公安系统.
女性妊娠（hCG,LH等)
传染病（乙肝五项、艾滋,、梅毒、流感等） 肿瘤标志物（AFP、、粪便血红蛋白等）
心梗系列(肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶）
毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒等）
畜牧兽医站, 商检系统, 传染病（禽流感、兽瘟疫等）
边检口岸,农牧类院系
和研究所
病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）
环保监测部门,研究机 有害物质超标 构
喷点法与浸泡法的比较 (AJQ3000喷头)
1.释放快慢 2.液体量不同，干燥快慢，边缘
效应 3.生产方便性
20
样品垫
材料选择
各成分的作用 1.缓冲溶液的作用 (PH) 2.盐的作用 3.大分子蛋白BSA\PVP 4.表面活性剂 Tween-20,TritonX-100
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吸水纸
吸水效率 进口与国产纸的差异
一步法
固相系统,常温保存
开发周期长,使用方便
20-40nm 胶体金 大孔径膜 侧向流动
免疫渗滤法
多步法
液体/固相系统 液体需要冷冻保存 开发周期短,使用不方便
10-15nm 胶体金 小孔径膜 竖向流动
4
免疫层析法技术优势:简单/现场/快速
1.打开包装取出试纸条 2.直接插入待测样品中 3. 目测读出结果（3-10分钟内）
胶体金试纸条的制备_图文
4、5 号管颜色无变化与对照颜色一致，最低蛋白量即为4 号管的蛋白量。
最终结合（McAb）
• 取100ml金溶液，调整pH值至8.2 • 调整滤过和离心的抗体溶液（0.1μg/μl）至
pH8.2 • 当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的
抗体（蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定 量），大约5分钟加完 • 在金标溶液中加入10ml滤过的10％BSA至 终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。
• 在兽医疫病检测中的应用
Bhakar等应用相应的单抗标金，建立了阿米巴虫抗原检测方法。Kameyama 等以牛病腹泻病毒的 NS3 蛋白制备单克隆抗体，并用胶体金标记单抗制备胶 体金试纸，用于牛病毒性腹泻抗原的检测。Kang等以同样方式建立了猪轮状 病毒胶体金抗原检测方法，并用于腹泻仔猪轮状病毒的鉴别诊断。Li等应用 实验室制备的两种 PRRSV 单抗，以双单抗夹心的模式，组装成 PRRSV 抗 原检测试纸，作为 PRRSV 感染的诊断工具。
135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法.
吸收垫(Absorbent Pad)：
提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸 收纸；
吸收纸的作用： 主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及 使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。
片材：
不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了 产品的货架期。
• ⑤乙醇—超声波还原法(1980年)可合成6～10nm大小的金 颗粒；
• ⑥硼氢化钠还原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒 ；
• ⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成3～17nm大 小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
最终结合（McAb）
• 取100ml金溶液，调整pH值至8.2 • 调整滤过和离心的抗体溶液（0.1μg/μl）至
pH8.2 • 当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的
抗体（蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定 量），大约5分钟加完 • 在金标溶液中加入10ml滤过的10％BSA至 终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。
• 在兽医疫病检测中的应用
Bhakar等应用相应的单抗标金，建立了阿米巴虫抗原检测方法。Kameyama 等以牛病腹泻病毒的 NS3 蛋白制备单克隆抗体，并用胶体金标记单抗制备胶 体金试纸，用于牛病毒性腹泻抗原的检测。Kang等以同样方式建立了猪轮状 病毒胶体金抗原检测方法，并用于腹泻仔猪轮状病毒的鉴别诊断。Li等应用 实验室制备的两种 PRRSV 单抗，以双单抗夹心的模式，组装成 PRRSV 抗 原检测试纸，作为 PRRSV 感染的诊断工具。
135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法.
吸收垫(Absorbent Pad)：
提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸 收纸；
吸收纸的作用： 主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及 使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。
片材：
不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了 产品的货架期。
• ⑤乙醇—超声波还原法(1980年)可合成6～10nm大小的金 颗粒；
• ⑥硼氢化钠还原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒 ；
• ⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成3～17nm大 小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
PEDV胶体金试纸条制备
PEDV胶体金试纸条制备胶体金(colloidal gold)是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，利用它在碱性环境下带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团相互吸引而形成牢固结合，可以将胶体金与抗体蛋白以及其他一些蛋白相结合，进行示踪研究。
目前已成为继荧光素、放射性同位素和酶之后，在免疫标记技术中较为常用的一种非放射性示踪剂。
1971年，Faulk和Taylor首先报道了将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。
1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。
之后，胶体金作为以后总新型免疫标记技术发展很快。
1978年，Geohegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细胞表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色(immunogold staining，IGS)，但是所需的胶体金颗粒必须大于20nm，并且标记物浓度要高，才能获得阳性结果。
1981年Danscher等用银显影方法增强了金颗粒的可见度，并提高了灵敏度。
1983年Holgate等将免疫金染色与银显影技术相结合，称之为免疫金银染色法(immunogold silver staining，IGSS)。
由于IGS和IGSS两种方法具有试剂制备简便，特异性强、灵敏度高、应用范围广，并可以用于双重和多重标记等特点，被广泛应用于医学和细胞生物学研究领域，是目前免疫组织化学技术中常用的敏感方法之一。
近年来胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色(dot IGS／IGSS)以及斑点金免疫渗滤测定法(dot immunogold filtration assay，DIGFA)等多种标记免疫检测方法。
本实验中应用柠檬酸钠还原法制备颗粒大小为20nm．30nm大小的胶体金，用于与制备纯化的抗体相结合，为制备检测·猪流行性下痢(PEDv)病毒试纸条做准备。
胶体金试纸条的制备
结合垫(Conjugate pad)：
玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材 质，多种规格，批间稳定。
结合垫的作用主要为：
- 吸附一定量的金标结合物颗粒； - 吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上； - 保持金标结合物颗粒的稳定性； - 保证金标结合物颗粒定量完全释放等。
玻璃纤维膜/聚酯纤维膜
胶体金免疫层析试纸模式双抗体夹心模式疫病抗原检测竞争模式小分子物质检测spa蛋白g模式疫病抗体检测双抗体夹心模式判定检测线质控线阳性显色显色阴性不显色显色竞争模式判定检测线质控线阳性不显色显色阴性显色显色spag蛋白模式判定检测线质控线阳性显色显色阴性不显色显色在兽药残留检测中的应用zhang等用克伦特罗制备的单克隆抗体标记胶体金作为检测探针然后将偶联bsa的克伦特罗作为t线以竞争模式组装成试纸用于样品的克伦特罗残留检测为我国食品安全检测提供了有效的工具
4、5 号管颜色无变化与对照颜色一致，最低蛋白量即为4 号管的蛋白量。
最终结合（McAb）
• 取100ml金溶液，调整pH值至8.2 • 调整滤过和离心的抗体溶液（0.1μg/μl）至
pH8.2 • 当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的
抗体（蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定 量），大约5分钟加完 • 在金标溶液中加入10ml滤过的10％BSA至 终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
16
2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
胶体金试纸条的制备 ppt课件
颗粒； • ⑥硼氢化钠还原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒； • ⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成3～17nm大
小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
注意事项
（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。
（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白
质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由 5μg～45μg另设对照管），各取等体积顺序加入 一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述 各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表顺序进行。
发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3 号管虽 然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
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2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
呈色
橙色 橙红 红色 紫色
λmax
518nm 522nm 525nm 535nm
小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
注意事项
（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。
（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白
质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由 5μg～45μg另设对照管），各取等体积顺序加入 一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述 各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表顺序进行。
发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3 号管虽 然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
16
2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
呈色
橙色 橙红 红色 紫色
λmax
518nm 522nm 525nm 535nm
胶体金试纸条检测技术PPT课件
寄生虫疾病：血吸虫病、旋毛虫病、囊虫病、恙 虫病。
细菌性疾病：霍乱弧菌、类鼻疽。
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H5亚型AIV尿 囊液阳性结果
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快乐工作，快乐生活！ 感谢您的聆听！ ！
欢迎批评指导！！
2019
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胶体金试纸条示意图
样品垫
连接垫 （胶体金垫）
质检线
吸收垫
背衬 （底板）
检测线
硝酸纤维素膜
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9
测定
测定时将试纸条下端浸入液体 标本中，下端吸水材料即吸取 液体向上端移动，流经C处时使 干片上的免疫金复合物复溶， 并带动其向膜条渗移。
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10
测定
若 标 本 中 有 待 测 特 异 抗 原 ， 即 可与免疫金复合物中的抗体结 合，此抗原抗体复合物流至测 试区即被固相抗体捕获，在膜 上显出红色反应线条（T）。
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11
测定
过剩的免疫金复合物继续前行， 至 参 照 区 与 固 相 抗 小 鼠 IgG 结 合（免疫金复合物中的单克隆 抗 体 为 小 鼠 IgG）， 而 显出红 色质控线条（R）。
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测定
阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
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胶体金快速诊断技术的特点
✓质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状 各异。
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胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带 负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电 吸引而形成牢固结合。
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2019
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胶体金试纸条示意图
样品垫
连接垫 （胶体金垫）
质检线
吸收垫
背衬 （底板）
检测线
硝酸纤维素膜
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9
测定
测定时将试纸条下端浸入液体 标本中，下端吸水材料即吸取 液体向上端移动，流经C处时使 干片上的免疫金复合物复溶， 并带动其向膜条渗移。
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10
测定
若 标 本 中 有 待 测 特 异 抗 原 ， 即 可与免疫金复合物中的抗体结 合，此抗原抗体复合物流至测 试区即被固相抗体捕获，在膜 上显出红色反应线条（T）。
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测定
过剩的免疫金复合物继续前行， 至 参 照 区 与 固 相 抗 小 鼠 IgG 结 合（免疫金复合物中的单克隆 抗 体 为 小 鼠 IgG）， 而 显出红 色质控线条（R）。
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12
测定
阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
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13
胶体金快速诊断技术的特点
✓质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状 各异。
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6
胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带 负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电 吸引而形成牢固结合。
胶体金试纸条检测技术PPT课件
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6
胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带 负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电 吸引而形成牢固结合。
胶体金标记技术（Immunogold labeling technique）是以胶体金作为示踪标记物应 用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。
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二、胶体金试纸条诊断技术的原理
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H5亚型AIV尿 囊液阳性结果
阴性对照
H5ＡIV细胞 毒阳性结果 阴性对照
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谢谢观看!
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最常用的是双抗夹心法检测抗原检测线质检线吸收垫样品垫硝酸纤维素膜连接垫胶体金垫底板测定时将试纸条下端浸入液体标本中下端吸水材料即吸取液体向上端移动流经c处时使干片上的免疫金复合物复溶若标本中有待测特异抗原即可与免疫金复合物中的抗体结合此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体捕获在膜上显出红色反应线条t
胶体金试纸条诊断技术
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1
一、简 介
胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析 技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗 滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫 学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素 （ HCG） 的 测 定 和 乙 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 （HBsAg）等检测。
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4
胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功 能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质 等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非 共价结合，形成胶体金标记物。
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5
➢胶体金的质量判定标准
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免疫胶体金技术 简介
Immune colloidal gold technique 2015-1-27
LOGOBiblioteka 目录1❖胶体金技术的发展
2 胶体金技术的种类
3❖
胶体金的合成
4 胶体金的标记与纯化
5 胶体金免疫层析法试 剂的组成
6 胶体金免疫层析试纸的 检测模式
7 胶体金免疫层析试纸的 应用
胶体金免疫层析（Gold Immune – Chromatographic Assay, GICA）技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术 发展而来的，其本质为一种固相反应的 ELISA,并用胶体 金来代替底物显色。
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
❖胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
16
2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
呈色
橙色 橙红 红色 紫色
λmax
518nm 522nm 525nm 535nm
胶体金的质量鉴定
❖透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度
❖理想的金颗粒大小 基本相等，均匀一致， 无椭圆形及多角形的 金颗粒存在。
❖优质金颗粒和劣质金颗粒
❖劣质金外形不均 一，且非球形，有
凝集现象，颗粒间 变异系数较大 。
❖胶体金的蛋白标记
❖双电层结构保证了胶体金的稳 定性，使金颗粒始终以悬浮状态 存在。
合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。
➢ 1974------实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了
间接免疫金染色法
胶体金技术的种类及优点
快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前
胶体金调整正确的pH值
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一 般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢 固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至 待标记蛋白质的等电点略偏碱。
免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型
的免疫标记技术。
胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包
被过程。
胶体金技术的发展
➢ 1939-----雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电
子显微镜下观察金离子呈高电子密度。
➢ 1971------作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结
❖ ⑤乙醇—超声波还原法(1980年)可合成6～10nm大小的金 颗粒；
❖ ⑥硼氢化钠还原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒 ；
❖ ⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成3～17nm大 小的金颗粒。
胶体金合成
❖制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
❖胶体金溶液通常由呈单一分散 状态的金颗粒组成，金颗粒直径 在 1-100nm 之间，而稳定的金溶 液则要求金颗粒维持在某一固定 直径不变。
❖蛋白通常带有多种电荷， 当蛋白带正电时，能与胶 体金所带的负电荷相互作 用；而蛋白中的疏水氨基 酸能通过疏水作用将蛋白 结合至金颗粒表面；有些
金标样本程序
将胶体金调整至正确的pH值 确定最小蛋白含量 最终结合（标记） 纯化
➢不足：
金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控 制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂 的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。
其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料 的开发与应用。
最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能 制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生 产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的 GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其 精密度和准确性均符合定量测定要求。
注意事项 （1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸 。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 （4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一 片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜 ，标记结合物为免疫金。
❖A：金标记 抗体 ❖B：标本中 的抗原 ❖C：包被抗 体
免疫层析法( immunochromatogra-phy，
ICA)
是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定， 与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法 中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层 析作用的横流 （lateral flow） )向另一端移动。移动 过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或 者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被 分离，❖然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体 金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。
胶体金的合成
❖ ①白磷还原法(1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒； ❖ ②白磷还原法(1925年)经改良后，可合成5～12nm大小的
金颗粒；
❖ ③抗坏血酸还原法(1958年)可合成6～13nm大小的金颗粒 ；
❖ ④柠檬酸三钠还原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm 、60nm大小的金颗粒；
免疫胶体金技术的特点
➢ 优点：
❖ 检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果； ❖ 不需仪器设备，操作人员不需特殊训练； ❖ 试剂稳定，适用于单份测定； ❖ 无污染； ❖ GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室
即有条件开发生产。 ❖ 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。
❖成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing， POCT）中广为应用的方法。
Immune colloidal gold technique 2015-1-27
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2 胶体金技术的种类
3❖
胶体金的合成
4 胶体金的标记与纯化
5 胶体金免疫层析法试 剂的组成
6 胶体金免疫层析试纸的 检测模式
7 胶体金免疫层析试纸的 应用
胶体金免疫层析（Gold Immune – Chromatographic Assay, GICA）技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术 发展而来的，其本质为一种固相反应的 ELISA,并用胶体 金来代替底物显色。
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
❖胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
16
2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
呈色
橙色 橙红 红色 紫色
λmax
518nm 522nm 525nm 535nm
胶体金的质量鉴定
❖透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度
❖理想的金颗粒大小 基本相等，均匀一致， 无椭圆形及多角形的 金颗粒存在。
❖优质金颗粒和劣质金颗粒
❖劣质金外形不均 一，且非球形，有
凝集现象，颗粒间 变异系数较大 。
❖胶体金的蛋白标记
❖双电层结构保证了胶体金的稳 定性，使金颗粒始终以悬浮状态 存在。
合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。
➢ 1974------实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了
间接免疫金染色法
胶体金技术的种类及优点
快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前
胶体金调整正确的pH值
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一 般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢 固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至 待标记蛋白质的等电点略偏碱。
免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型
的免疫标记技术。
胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包
被过程。
胶体金技术的发展
➢ 1939-----雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电
子显微镜下观察金离子呈高电子密度。
➢ 1971------作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结
❖ ⑤乙醇—超声波还原法(1980年)可合成6～10nm大小的金 颗粒；
❖ ⑥硼氢化钠还原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒 ；
❖ ⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成3～17nm大 小的金颗粒。
胶体金合成
❖制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
❖胶体金溶液通常由呈单一分散 状态的金颗粒组成，金颗粒直径 在 1-100nm 之间，而稳定的金溶 液则要求金颗粒维持在某一固定 直径不变。
❖蛋白通常带有多种电荷， 当蛋白带正电时，能与胶 体金所带的负电荷相互作 用；而蛋白中的疏水氨基 酸能通过疏水作用将蛋白 结合至金颗粒表面；有些
金标样本程序
将胶体金调整至正确的pH值 确定最小蛋白含量 最终结合（标记） 纯化
➢不足：
金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控 制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂 的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。
其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料 的开发与应用。
最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能 制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生 产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的 GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其 精密度和准确性均符合定量测定要求。
注意事项 （1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸 。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 （4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一 片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜 ，标记结合物为免疫金。
❖A：金标记 抗体 ❖B：标本中 的抗原 ❖C：包被抗 体
免疫层析法( immunochromatogra-phy，
ICA)
是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定， 与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法 中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层 析作用的横流 （lateral flow） )向另一端移动。移动 过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或 者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被 分离，❖然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体 金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。
胶体金的合成
❖ ①白磷还原法(1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒； ❖ ②白磷还原法(1925年)经改良后，可合成5～12nm大小的
金颗粒；
❖ ③抗坏血酸还原法(1958年)可合成6～13nm大小的金颗粒 ；
❖ ④柠檬酸三钠还原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm 、60nm大小的金颗粒；
免疫胶体金技术的特点
➢ 优点：
❖ 检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果； ❖ 不需仪器设备，操作人员不需特殊训练； ❖ 试剂稳定，适用于单份测定； ❖ 无污染； ❖ GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室
即有条件开发生产。 ❖ 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。
❖成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing， POCT）中广为应用的方法。