胶体金试纸条的制备共38页
胶体金试纸条检测技术PPT课件
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胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带 负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电 吸引而形成牢固结合。
胶体金标记技术（Immunogold labeling technique）是以胶体金作为示踪标记物应 用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。
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二、胶体金试纸条诊断技术的原理
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H5亚型AIV尿 囊液阳性结果
阴性对照
H5ＡIV细胞 毒阳性结果 阴性对照
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谢谢观看!
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快乐工作，快乐生活！ 感谢您的聆听！ ！
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2019
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最常用的是双抗夹心法检测抗原检测线质检线吸收垫样品垫硝酸纤维素膜连接垫胶体金垫底板测定时将试纸条下端浸入液体标本中下端吸水材料即吸取液体向上端移动流经c处时使干片上的免疫金复合物复溶若标本中有待测特异抗原即可与免疫金复合物中的抗体结合此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体捕获在膜上显出红色反应线条t
胶体金试纸条诊断技术
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一、简 介
胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析 技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗 滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫 学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素 （ HCG） 的 测 定 和 乙 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 （HBsAg）等检测。
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胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功 能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质 等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非 共价结合，形成胶体金标记物。
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➢胶体金的质量判定标准
PCT胶体金试纸制备及其原理
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5、PCT胶体金试纸样品垫和金标垫处理
样品垫和金标垫的处理方式一样，都是将切割好的样品垫（玻纤膜-有些脆， 需小心）和金标垫（聚酯膜）浸泡在处理液中1小时，使其彻底湿润。（半小时 需用镊子翻一次面）
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3、常用的免疫胶体金检测技术
（1）免疫胶体金光镜染色法 （2）斑点免疫金渗滤法 （3）胶体金免疫层析法
将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗 体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前 移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区 域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上， 可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
PCT胶体金试纸制备及其原理
2016年6月3号
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胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution）： 是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗 粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层 构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－）， 外层双层正离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶 体金游离于溶胶间的悬液状态。
胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用 下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体 金。
胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由
链霉素胶体金免疫层析试纸条的技术报告
链霉素胶体金免疫层析试纸条的技术报告1 胶体金的制备1.1玻璃器皿的准备玻璃器皿表面的少量污染会干扰金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗，硅化。
硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于含5％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1min，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。
专用的玻璃器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。
将玻璃器皿用酸液浸泡72小时后，取出，用洗洁精洗涤和大量自来水冲洗，蒸馏水浸泡24h后用去离子水冲洗三次，37℃温箱烘干后备用。
1.2 柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液在胶体金免疫层析试验中，检测信号是由于金颗粒在检测线或质控线上聚集而成，所以如果金颗粒太小就不能产生足够的颜色信号，如果太大又会遇到空间位阻问题。
空间位阻可以阻止小分子蛋白质接近金颗粒的zeta电位，例如IgG 分子(160 000 DaLtons)大约8nm，约有4nm可以与金颗粒的表面结合，其最适的标记金颗粒为40nm，而对小分子抗原来说，可以使用20nm的胶体金颗粒进行标记。
取0.01％氯金酸水溶液100mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液3.5mL，继续搅拌加热10min，溶液呈透亮的红色。
室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存。
1.3 胶体金的质量鉴定1.3.1 肉眼观察用肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好无杂质、透明度较高。
1.3.2 紫外扫描鉴定取冷却后的胶体金溶液进行400～600nm紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰形、峰宽。
紫外扫描的最大吸收峰波长为520nm，根据回归方程Y= 0. 4271X + 514. 56计算得到胶体金颗粒粒径为12.74nm。
由图谱可以看出最大吸收峰的峰宽较小,说明胶体金颗粒分布比较均匀1.3.3 透射电镜鉴定透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致，有无椭圆形及多角形。
拍片放大后测量胶体金颗粒直径大小，取多个点计算胶体金颗粒的平均直径。
胶体金试纸条的制备_图文
最终结合（McAb）
• 取100ml金溶液，调整pH值至8.2 • 调整滤过和离心的抗体溶液（0.1μg/μl）至
pH8.2 • 当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的
抗体（蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定 量），大约5分钟加完 • 在金标溶液中加入10ml滤过的10％BSA至 终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。
• 在兽医疫病检测中的应用
Bhakar等应用相应的单抗标金，建立了阿米巴虫抗原检测方法。Kameyama 等以牛病腹泻病毒的 NS3 蛋白制备单克隆抗体，并用胶体金标记单抗制备胶 体金试纸，用于牛病毒性腹泻抗原的检测。Kang等以同样方式建立了猪轮状 病毒胶体金抗原检测方法，并用于腹泻仔猪轮状病毒的鉴别诊断。Li等应用 实验室制备的两种 PRRSV 单抗，以双单抗夹心的模式，组装成 PRRSV 抗 原检测试纸，作为 PRRSV 感染的诊断工具。
135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法.
吸收垫(Absorbent Pad)：
提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸 收纸；
吸收纸的作用： 主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及 使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。
片材：
不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了 产品的货架期。
• ⑤乙醇—超声波还原法(1980年)可合成6～10nm大小的金 颗粒；
• ⑥硼氢化钠还原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒 ；
• ⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成3～17nm大 小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
PEDV胶体金试纸条制备
PEDV胶体金试纸条制备胶体金(colloidal gold)是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，利用它在碱性环境下带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团相互吸引而形成牢固结合，可以将胶体金与抗体蛋白以及其他一些蛋白相结合，进行示踪研究。
目前已成为继荧光素、放射性同位素和酶之后，在免疫标记技术中较为常用的一种非放射性示踪剂。
1971年，Faulk和Taylor首先报道了将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。
1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。
之后，胶体金作为以后总新型免疫标记技术发展很快。
1978年，Geohegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细胞表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色(immunogold staining，IGS)，但是所需的胶体金颗粒必须大于20nm，并且标记物浓度要高，才能获得阳性结果。
1981年Danscher等用银显影方法增强了金颗粒的可见度，并提高了灵敏度。
1983年Holgate等将免疫金染色与银显影技术相结合，称之为免疫金银染色法(immunogold silver staining，IGSS)。
由于IGS和IGSS两种方法具有试剂制备简便，特异性强、灵敏度高、应用范围广，并可以用于双重和多重标记等特点，被广泛应用于医学和细胞生物学研究领域，是目前免疫组织化学技术中常用的敏感方法之一。
近年来胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色(dot IGS／IGSS)以及斑点金免疫渗滤测定法(dot immunogold filtration assay，DIGFA)等多种标记免疫检测方法。
本实验中应用柠檬酸钠还原法制备颗粒大小为20nm．30nm大小的胶体金，用于与制备纯化的抗体相结合，为制备检测·猪流行性下痢(PEDv)病毒试纸条做准备。
胶体金的制备方法
胶体金的制备方法胶体金的制备方法标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]一、制备胶体金的准备（一）玻璃器皿的清洁制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。
如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。
我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。
通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。
也可用已经制备的胶体金溶液，用同等大不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。
（二）试剂的配制要求按照Frens法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。
许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数，基本的规律是柠檬酸三钠用量多，胶体金颗粒直径小，柠檬酸三钠用量越少，腔体金颗粒直径越大。
（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。
（2）氯化金（HauCl水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶4液。
放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍保持稳定。
（3）白磷或黄磷乙醚溶液的配制：白磷在空气中易燃烧，要格外小心操作。
把白磷在双蒸水中切成小块，放在滤纸上吸于水份后，迅速放入已准备好的乙醚中去，轻轻摇动，等完全溶解后即得饱和溶液。
储藏于棕色密闭瓶内，放在阴凉处保存。
柠檬酸三钠还原法（Frens 1973）此方法是由Frens在1973年创立的，制备程序很简溶液加热至沸腾，迅单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。
胶体金试纸条检测技术实用PPT资料
二、胶体金试纸条诊断技术的原理
以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细 血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端 渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜 色（红色）反应，检测抗原/抗体。有三种反应模 式：夹心法，间接法，竞争抑制法。
最常用的是双抗夹心法检测抗原
胶体金试纸条示意图
样品垫
连接垫 （胶体金垫）
特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。
胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCG） 的测定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等检测。 外层离子层 H+分散在胶体间的溶液中
阴性对照
H5ＡIV细胞 毒阳性结果 阴性对照
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作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于 的测定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等检测。
胶体金（Colloidal gold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。 胶体金标记技术（Immunogold labeling technique）是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。 双离子 内层负离子（AuC12－） zeta电位
结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。
以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体。 胶体金标记技术（Immunogold labeling technique）是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。 结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉
同时检测两种真菌毒素的胶体金试纸条的研制
ｏ ｐ ｒ ｔ ｎ ｃ ｕ ｄ ｅｅ ｔ ｂｏｈ ｔ ｘｎ ｏ ａ ｅ ｅ ｔ ｔｍｅ ｎｄ ｏ ｔ ｎｅ ｏ ｅ ａｉ ｏ ｌ ｄ ｔ ｃ ｔ ｏ ｓ ｔ ｓ ｖ ｔｓ ｉ ａ ｃ ｓ． ｏ ｉ
Ｋｅ ｗｏ ｄ ａｌ ｔｘｎ ｌ ｏ ｈ ａ ｏ ｉ Ａ； ｍｏ ｏ ｌｎ ｎ ｉ ｏ ｙ ｃ ｌ ｉａ ｏｄ ； ｔｓ ｓｒ ｙ ｒ ｓ ｆ ｏ Ｂ ； ｃ ｒ ｔｘｎ ａ ｉ ｎ ｃ ｏ ａ ａ ｔ ｄ ； ｏ ｏｄ ｌ ｌ ｌ ｂ ｇ ｅｔｔｐ ｉ
ｗ ｉ ｈ Ｃ ｉ ｌ ｅ ｕ ｌ ｅｅ ｔ ｔ ｏ ｋ ｎ ｓ ｏ ｕ ｇ ｏ ｉ ｓ Ｗ ８ ｓ ｃ ｅ ｓ ｌ ｒ ｄ ｃ ｄ ｈ ｃ ａ ｓｍｕ ｔ ｏ ｓｙ ｄ ｔ ｃ ｗ ｉ ｄ ｆ ｆ ｎ ｉ ｔｘｎ ８ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ｐ ｏ ｕ ｅ ，ｗｈ ｃ ａ ｅ ｔ ｒ ｄ ｎ ｎ ａ ｕ ｙ ｉｈ Ｗ ｓ ｆａ ｕ ｅ ｔ Ｉ ｌ
０ １ ｏ ， ｐ ７４的 Ｃ Ｓ稀 释） ． ｌＬ Ｈ ． ０ ｔ ｏ Ｂ ，此 为检 测 Ｏ Ａ的
１ 材料与方法
１１ 材料 与试 剂 ．
检 测 线 Ｔ ；（ ） Ｖ — Ｆ ｌ 全 抗 原 （ １ ３Ｏ Ａ Ａ Ｂ 完 １ｍｇ／ｍ ， Ｌ
０ １ ｏ／ Ｈ ． Ｃ Ｓ ． ｌＬｐ ７ Ｏｍ ４的 Ｂ 稀释） ，此为检测 Ａ Ｂ 的 Ｆｌ
胶体金试纸条的制备 ppt课件
小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
注意事项
（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。
（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白
质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由 5μg～45μg另设对照管），各取等体积顺序加入 一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述 各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表顺序进行。
发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3 号管虽 然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
16
2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
呈色
橙色 橙红 红色 紫色
λmax
518nm 522nm 525nm 535nm
一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法[发明专利]
![一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/edeaaf3d360cba1aa911da81.png)
专利名称：一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法专利类型：发明专利
发明人：夏泉,任刘丽,赵营莉,宗凯,高贝贝,余晓峰申请号：CN201810775483.0
申请日：20180716
公开号：CN108918851A
公开日：
20181130
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法，包括金标垫与样品垫的预处理、胶体金喷点到金标垫、抗原喷点到NC膜。
本发明制得的拉莫三嗪胶体金试纸条具有检测灵敏度高的优点。
申请人：夏泉
地址：230000 安徽省合肥市蜀山区习友路西湖花苑天2-1103
国籍：CN
代理机构：苏州翔远专利代理事务所(普通合伙)
代理人：王华
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检测登革病毒抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用[发明专利]
![检测登革病毒抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/712281f6a76e58fafbb003c7.png)
专利名称：检测登革病毒抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：王静,杨宇,杨永莉,秦成峰,张志华
申请号：CN201110245759.2
申请日：20110824
公开号：CN102393454A
公开日：
20120328
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种检测登革病毒抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用，胶体金试纸条包括反应支撑物、连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分连接、硝酸纤维膜末端的上表面与金标抗体保护膜部分连接，金标抗体保护膜的上表面部分连接有样品垫，金标抗体保护膜包括膜本体、及其上的胶体金标记的SPA或重组登革病毒E蛋白涂层，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置质控条带、靠近其末端处设置有检测条带。
本发明建立登革病毒抗体的快速检测方法，建立的检测登革病毒的胶体金试纸条，能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的登革病毒抗体，并可实现定量检测、适用于现场的快速检测及监测。
申请人：中国检验检疫科学研究院
地址：100123 北京市朝阳区高碑店北路甲3号
国籍：CN
代理机构：北京中创阳光知识产权代理有限责任公司
代理人：尹振启
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胶体金试纸条的制备 38页
1974------实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了
间接免疫金染色法
胶体金技术的种类及优点
快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前
上海金标生物生物科技有限公司
玻璃纤维膜/聚酯纤维膜
硝酸纤维素膜
强度、表面质量、厚度、批间均一性等。
硝酸纤维膜的选择
膜的分类标准(μm和s)
µm: 指的是膜孔径 换算情况大致为：8μm=135s；6μm=180s
不同秒数的膜对反应的影响
通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读 数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢， 也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发 生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不 一定就能够真正的提升灵敏度。
（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白
质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由 5μg～45μg另设对照管），各取等体积顺序加入 一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述 各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表顺序进行。
发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3 号管虽 然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而
胶体金免疫层析试纸模式
• 双抗体夹心模式 疫病抗原检测
• 竞争模式 小分子物质检测
• SPA/蛋白G模式 疫病抗体检测
双抗体夹心模式
判定 阳性 阴性
检测线 质控线 显色 显色
不显色 显色
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1
胶体金技术的发展
2
胶体金技术的种类
3
胶体金的合成
4
胶体金的标记与纯化
5 胶体金免疫层析法试剂的组成
6 胶体金免疫层析试纸的检测模式
7 胶体金免疫层析试纸的应用
胶体金免疫层析（Gold Immune – Chromatographic Assay, GICA）技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术 发展而来的，其本质为一种固相反应的 ELISA,并用胶体 金来代替底物显色。
➢不足：
金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控 制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂 的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。 其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料 的开发与应用。
最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能 制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生 产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的 GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其 精密度和准确性均符合定量测定要求。
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一 般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢 固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至 待标记蛋白质的等电点略偏碱。
者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一 片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜， 标记结合物为免疫金。
A：金标记抗体 B：标本中的抗原 C：包被抗体 D：NC膜 E：吸水材料 F：塑料盒
免疫层析法( immunochromatogra-phy，
ICA)
是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定， 与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法 中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层 析作用的横流 （lateral flow） )向另一端移动。移动过 程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者 抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分 离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金 为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。
免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型
的免疫标记技术。
胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包
被过程。
胶体金技术的发展
➢ 1939-----雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电
子显微镜下观察金离子呈高电子密度。
➢ 1971------作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结
免疫胶体金技术的特点
➢ 优点：
• 检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果； • 不需仪器设备，操作人员不需特殊训练； • 试剂稳定，适用于单份测定； • 无污染； • GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室
即有条件开发生产。 • 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。
成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing，POCT） 中广为应用的方法。
合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。
➢ 1974------实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了
间接免疫金染色法
胶体金技术的种类及优点
快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前
胶体金的质量鉴定
透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度
理想的金颗粒大小基本相等， 均匀一致，无椭圆形及多角 形的金颗粒存在。
优质金颗粒和劣质金颗粒
劣质金外形不均一，且
非球形，有凝集现象， 颗粒间变异系数较大 。
胶体金的蛋白标记
双电层结构保证了胶体金的稳定 性，使金颗粒始终以悬浮状态存 在。
胶体金溶液通常由呈单一分散状 态的金颗粒组成，金颗粒直径在 1-100nm 之间，而稳定的金溶液 则要求金颗粒维持在某一固定直 径不变。
注意事项
（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。
（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
胶体金的合成
• ①白磷还原法()可合成3nm左右大小的金颗粒； • ②白磷还原法(1925年)经改良后，可合成5～12nm大小的
金颗粒； • ③抗坏血酸还原法(1958年)可合成6～13nm大小的金颗粒； • ④柠檬酸三钠还原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、
60nm大小的金颗粒； • ⑤乙醇—超声波还原法(1980年)可合成6～10nm大小的金
颗粒； • ⑥硼氢化钠还原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒； • ⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成3～17nm大
小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
16
2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
呈色
橙色 橙红 红色 紫色
λmax
518nm 522nm 525nm 535nm
蛋白通常带有多种电荷，当蛋白 带正电时，能与胶体金所带的负 电荷相互作用；而蛋白中的疏水 氨基酸能通过疏水作用将蛋白结 合至金颗粒表面；有些蛋白则可 通过半胱氨酸的巯基与金颗粒共 轭连接。
金标样本程序
将胶体金调整至正确的pH值 确定最小蛋白含量 最终结合（标记） 纯化
胶体金调整正确的pH值