壬基酚和双酚A检测方法

1目的

建立该程序为规范壬基酚和双酚A测定提供指导性文件。

2 适用范围

本规程适用于婴幼儿食品及食用植物油和包材等双酚A、壬基酚含量的液相色谱-串联质谱法测定。

3 原理

试样中(婴幼儿乳粉及粉状原料）的壬基酚和双酚A经乙酸乙酯-环己烷（体积比按1:1）提取后，同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。

样品（油类）经过凝胶渗透色谱法（GPC）除脂净化（乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v）超声提取），同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。

样品（膜）经过正己烷浸泡提取，氮吹（42℃）至干，用1ml甲醇定容后，同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。

4 试剂和材料

除非另有规定，本方法所用试剂均为色谱纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

乙酸乙酯

环己烷

壬基酚和双酚A 及其同位素内标（NP-d4、BPA-d4）

甲醇

氨水（分析纯）

乙腈

标准溶液

壬基酚和双酚A标准储备液（ml）：分别称取壬基酚和双酚A的标准品（精确到），溶于甲醇中，用甲醇定容到100ml容量瓶中，放置于4℃冰箱中。

壬基酚和双酚A标准中间夜（2ug/ml）：分别吸取1ml壬基酚和双酚A标准储备液，用甲醇定容至100mL。壬基酚和双酚A标准工作液：分别吸取壬基酚和双酚A标准中间夜10μl，25μl，50μl，75μl，100μl，150μl，250μl，然后分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液，最后加甲醇定容至1ml，配制成工作液浓度分别为20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，150ng/ml，200ng/ml，300ng/ml，500ng/ml。内标物溶液

壬基酚和双酚A同位素内标物标准储备液（ml）：分别称取壬基酚和双酚A的同位素内标物（精确到），溶于甲醇中，用甲醇定容到100ml容量瓶中，放置于4℃冰箱中。

壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液（2ug/ml）：分别吸取1ml壬基酚和双酚A的同位素内标物标准储备液，用甲醇定容至100mL。

5 仪器和设备

天平：感量为。

涡旋振荡器

氮吹仪

低温低速离心机

超高效液相-质谱联用仪

凝胶渗透色谱仪

6 分析步骤

试样处理

婴幼儿乳粉及粉状原料

称取试样1g（原料根据实际情况酌情减少称样量）精确到于50ml干燥的玻璃离心管中，向样品中分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素（200ng/ml）内标物（NP—4-n-NP-d4和BPA-d4）,加入8ml乙酸乙酯-环己烷溶液（体积比按1:1），涡旋振荡30s，离心10min（1000转/min）。然后再重复上述操作进行

第二次提取，将两次的上清液合并至同一个试管中。然后将上清液转移到氮吹管中，进行氮吹（42℃），吹干后用1ml甲醇进行定容，用有机滤膜过滤后上机，同时做试剂空白试验。

包材

准确裁取一定面积（15*30cm）的包材，然后进行塑封，向其中加入100ml的正己烷进行浸泡，向浸泡液中分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素（1ug/ml）内标物（NP—4-n-NP-d4和BPA-d4）.浸泡5小时，每隔半个小时摇晃一次。取出20ml浸泡液于干净的试管中进行氮吹（42℃），吹干后用1ml甲醇进行定容，同时做试剂空白试验。用有机滤膜过滤后上机。

食用植物油

称取食用植物油样品g于GPC样品管中，向样品中分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液（200ng/ml）,加入5 mL乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v），2000 rpm涡旋混合1 min，用于GPC净化。GPC分离采用苯乙烯树脂Biobead SX-3 (300 × 10 mm)凝胶色谱柱，流动相为乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v），流速mL/min。收集14-17 min组分于100 mL茄形瓶中，30oC，120 rpm旋转蒸发至干，1 mL甲醇（）定容，用有机滤膜过滤后上机，同时做试剂空白试验。

测定

参考液相色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（50 mm ×mm）；捕集柱：Waters Isolator Column（P/N：6），捕集柱位于进样阀之前（图1）。

流动相:甲醇﹪氨水

进样量：10μl

流速：min

柱温：35±5℃

样品室温度：15±5℃

根据仪器性能调至最佳状态，液相仪器参考条件见下表

目标化合物参考液相色谱条件

时间（min）流速（ml/min）A%（甲醇）B%%氨水溶液)

40 60

100 0

2 100 0

40 60

3 40 60

参考质谱条件

质谱条件：离子源，电喷雾电离ESI（-）；毛细管电压， KV；离子源温度，150oC；脱溶剂温度，400oC；脱溶剂气流量，800 L/h；锥孔气流量为50 L/h。采用多反应监测具体的离子采集参数见下表

化合物名称母离子（m/z）子离子（m/z）锥孔电压v碰撞能量ev 4-NP（壬基酚）3430

4-NP（壬基酚）3426

BPA（双酚A）36 30

BPA（双酚A）36 26

6.2.3超高效液相色谱-质谱联用仪测定（定量测定）

将标准储备液用甲醇稀释称为标准工作液，在仪器最佳工作条件下，标准工作液分别进样，以标准工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。采用外标法进行定量测定，样品溶液中的待测物的响应值应该在标准曲线的线性范围内。

分析结果的表述