壬基酚和双酚A检测方法

1目的
建立该程序为规范壬基酚和双酚A测定提供指导性文件。

2 适用范围
本规程适用于婴幼儿食品及食用植物油和包材等双酚A、壬基酚含量的液相色谱-串联质谱法测定。

3 原理
3.1试样中(婴幼儿乳粉及粉状原料）的壬基酚和双酚A经乙酸乙酯-环己烷（体积比按1:1）提取后，同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。

3.2样品（油类）经过凝胶渗透色谱法（GPC）除脂净化（乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v）超声提取），同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。

3.3样品（膜）经过正己烷浸泡提取，氮吹（42℃）至干，用1ml甲醇定容后，同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。

4 试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为色谱纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

4.1 乙酸乙酯
4.2 环己烷
4.3 壬基酚和双酚A 及其同位素内标（NP-d4、BPA-d4）
4.4 甲醇
4.5 氨水（分析纯）
4.6 乙腈
4.7 标准溶液
4.7.1 壬基酚和双酚A标准储备液（0.2mg/ml）：分别称取壬基酚和双酚A的标准品0.02g（精确到0.1mg），溶于甲醇中，用甲醇定容到100ml容量瓶中，放置于4℃冰箱中。

4.7.2 壬基酚和双酚A标准中间夜（2ug/ml）：分别吸取1ml壬基酚和双酚A标准储备液，用甲醇定容至100mL。

4.7.3 壬基酚和双酚A标准工作液：分别吸取壬基酚和双酚A标准中间夜10μl，25μl，50μl，75μl，100μl，150μl，250μl，然后分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液，最后加甲醇定容至1ml，配制成工作液浓度分别为20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，150ng/ml，200ng/ml，300ng/ml，500ng/ml。

4.8 内标物溶液
4.8.1 壬基酚和双酚A同位素内标物标准储备液（0.2mg/ml）：分别称取壬基酚和双酚A的同位素内标物0.02g（精确到0.1mg），溶于甲醇中，用甲醇定容到100ml容量瓶中，放置于4℃冰箱中。

4.8.2 壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液（2ug/ml）：分别吸取1ml壬基酚和双酚A的同位素内标物标准储备液，用甲醇定容至100mL。

5 仪器和设备
5.1 天平：感量为0.1mg。

5.2 涡旋振荡器
5.3 氮吹仪
5.4 低温低速离心机
5.5 超高效液相-质谱联用仪
5.6 凝胶渗透色谱仪
6 分析步骤
6.1 试样处理
6.1.1婴幼儿乳粉及粉状原料
称取试样1g（原料根据实际情况酌情减少称样量）精确到0.1mg于50ml干燥的玻璃离心管中，向样
品中分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素（200ng/ml）内标物（NP—4-n-NP-d4和BPA-d4）,加入8ml 乙酸乙酯-环己烷溶液（体积比按1:1），涡旋振荡30s，离心10min（1000转/min）。

然后再重复上述操作进行第二次提取，将两次的上清液合并至同一个试管中。

然后将上清液转移到氮吹管中，进行氮吹（42℃），吹干后用1ml甲醇进行定容，用0.22有机滤膜过滤后上机，同时做试剂空白试验。

6.1.2包材
准确裁取一定面积（15*30cm）的包材，然后进行塑封，向其中加入100ml的正己烷进行浸泡，向浸泡液中分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素（1ug/ml）内标物（NP—4-n-NP-d4和BPA-d4）.浸泡5小时，每隔半个小时摇晃一次。

取出20ml浸泡液于干净的试管中进行氮吹（42℃），吹干后用1ml甲醇进行定容，同时做试剂空白试验。

用0.22有机滤膜过滤后上机。

6.1.3食用植物油
称取食用植物油样品0.4 g于GPC样品管中，向样品中分别加入50μl壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液（200ng/ml）,加入5 mL乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v），2000 rpm涡旋混合1 min，用于GPC 净化。

GPC分离采用苯乙烯树脂Biobead SX-3 (300 × 10 mm)凝胶色谱柱，流动相为乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v），流速3.0 mL/min。

收集14-17 min组分于100 mL茄形瓶中，30ºC，120 rpm旋转蒸发至干，1 mL 甲醇（3.1）定容，用0.22有机滤膜过滤后上机，同时做试剂空白试验。

6.2 测定
6.2.1 参考液相色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（50 mm ×2.1 mm）；捕集柱：Waters Isolator Column（P/N：186004476），捕集柱位于进样阀之前（图1）。

流动相:甲醇-0.1﹪氨水
进样量：10μl
流速：0.3mL/min
柱温：35±5℃
样品室温度：15±5℃
根据仪器性能调至最佳状态，液相仪器参考条件见下表
6.2.2 参考质谱条件
质谱条件：离子源，电喷雾电离ESI（-）；毛细管电压，2.8 KV；离子源温度，150ºC；脱溶剂温度，400ºC；脱溶剂气流量，800 L/h；锥孔气流量为50 L/h。

采用多反应监测具体的离子采集
6.2.3超高效液相色谱-质谱联用仪测定（定量测定）
将标准储备液用甲醇稀释称为标准工作液，在仪器最佳工作条件下，标准工作液分别进样，以标准工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。

采用外标法进行定量测定，样品溶液中的待测物的
响应值应该在标准曲线的线性范围内。

7.1 分析结果的表述
7.1.1试样（粉和油）中壬基酚和双酚A的含量按下式计算：
X=CV/m
式中：
X——试样中检测目标化合物残留量，单位为微克每千克（μg/kg)
C——由回归曲线计算得到的上机试样溶液中目标化合物含量，单位为纳克毫升（ng/ml）；V——浓缩至干后试样的定容体积，单位为毫升（mL）；
m——试样的质量，单位为克（g）。

7.1.2试样（膜）中壬基酚和双酚A的含量按下式计算：
X=6*CV*f/S
式中：
X——试样中检测目标化合物残留量，单位为微克每千克（μg/kg)
C——由回归曲线计算得到的上机试样溶液中目标化合物含量，单位为纳克毫升（ng/ml）；V——浸泡所使用溶液的体积，单位为升（L）；
S——检测样品的表面积，平方分米。

f——稀释倍数。

6——欧盟指令2002/72/EC中规定1mg/kg=6mg/dm2
8 精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

图1 色谱柱连接示意图。