沉淀反应与溶血试验

免疫实验

实验二沉淀反应

一、概述

沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体结合后，在条件适宜时（抗原抗体比例合适，有适量电解质存在等）出现肉眼可见沉淀物的反应。

利用沉淀反应进行抗原或抗体检测的是沉淀试验，沉淀试验是抗原抗体检测方法中的一个大类。

沉淀试验有琼脂扩散试验、免疫电泳试验、环状沉淀试验、絮状沉淀试验等。

琼脂扩散试验分单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。

二、单向琼脂扩散试验（用于检测抗原的含量）（示教试验）

1. 原理：在单向琼脂扩散试验中，形成沉淀环，沉淀环直径与抗原浓度成正比，因此可根据沉淀环直径对抗原进行定量。

2. 结果：注意观察所形成的沉淀环，了解作标准曲线根据标准曲线求抗原含量的方法。

三、双向琼脂扩散试验（检测甲胎蛋白AFP）

1. 原理：抗原抗体在琼脂中可自由扩散，若抗原抗体相对应，两者在相遇且比例合适处形成大抗原抗体复合物，此复合物沉积出现沉淀线。双向琼脂扩散试验可用于抗原抗体纯度的检测、滴定抗体效价以及未知抗原或抗体的检测。

2. 方法（检测甲胎蛋白AFP）：。

制备琼脂板→根据需要在琼脂板打孔→分别在对应孔加入待检标本、AFP阳性血清（阳性对照）和抗AFP抗体→37℃孵育，24小时后观察结果。

3. 结果判断

在AFP阳性对照孔和抗AFP孔出现白色沉淀线，为阳性对照线。待检标本孔和抗AFP 孔也出现白色沉淀线且与阳性对照线衔接成一线，表明待检标本AFP阳性；若待检标本孔和抗AFP孔不出现白色沉淀线，表明待检标本AFP阴性。

四、对流免疫电泳试验（检测甲胎蛋白AFP）

1. 原理：对流免疫电泳试验将双向琼脂扩散和电泳技术相结合的一种试验。和双扩相比，具有试验时间缩短、试验敏感度提高的优点。

2. 方法：按照实验指导进行操作。

3. 结果判断与分析：

在AFP阳性对照孔和抗AFP孔出现白色沉淀线，为阳性对照线。待检标本孔和抗AFP 孔也出现白色沉淀线，表明待检标本AFP阳性；若待检标本孔和抗AFP孔不出现白色沉淀线，表明待检标本AFP阴性。

实验三补体参与的免疫反应

一、溶血反应

1. 原理：绵羊红细胞在溶血素（绵羊红细胞的抗体）、补体均存在的条件下出现溶血。此溶血反应是补体结合试验的指示系统。

2. 方法：按照实验指导进行操作。

3. 现象观察与分析：观察溶血现象；分析第3、5管为何未出现溶血，分别缺什么成分。

二、补体结合试验（原理）

1. 原理：补体结合试验是补体参与，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统进行抗原或抗体检测的试验。以检测抗原为例，若待检系统有抗原，和已知抗体结合形成抗原抗体复合物，消耗补体；此时，再加入绵羊红细胞和溶血素，不出现溶血（补体全部消耗）或部分溶血（补体部分消耗）。若待检系统无抗原，只有已知抗体，无抗原抗体复合物，不消耗补体；此时，再加入绵羊红细胞和溶血素，出现溶血且溶血最完全（补体没有消耗）。最后根据溶血现象判断抗原的有无并可定量。

免疫实验

实验四免疫标记技术

一、概述

免疫标记技术是指将已知抗体或抗原用放射性核素、酶、荧光素、胶体金、化学发光物质或电子致密物质等标记物标记作为试剂，检测相应抗原或抗体的一类免疫实验技术。根据标记物不同，免疫标记技术分放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等。

二、双抗体夹心法ELISA（以检测HBsAg为例）

1. 原理：ELISA全称酶联免疫吸附试验，属以酶作为标记物的酶免疫技术。ELISA用于标本中抗原或抗体测定。ELISA分双抗体夹心法、间接法、竞争法等不同方法。双抗体夹心法ELISA用于标本中的抗原测定。

2. 方法（以检测HBsAg为例）：

已知抗体（抗HBsAg）包被酶标板→洗板→封闭→洗板→加待检标本，设阳性对照、阴性对照→洗板→加酶标抗体（抗HBsAg）→洗板→加底物→观察结果。

3. 结果判断

肉眼观察：阳性对照显色，阴性对照未显色。待检标本显色为待检抗原（HBsAg）阳性，待检标本不显色为待检抗原（HBsAg）阴性

三、斑点免疫层析试验（以检测HCG为例）

1. 原理：斑点免疫层析试验属金免疫技术，以胶体金作为标记物。在斑点免疫层析试验，所有试剂预先组合在一个试剂条上。以检测HCG为例，所用试剂有金标抗体（金标抗HCG，为小鼠IgG）、测试区固相特异性抗体（抗HCG）、参照区固相抗小鼠IgG抗体。检测时，若待检标本HCG阳性，在测试区、参照区均出现红线（两条红线）；若待检标本HCG 阴性，仅参照区出现红线，测试区不出现红线（一条红线）。

2. 方法：

将试剂条一端浸入待检标本，5秒后取出；3分钟内观察结果。

3. 结果判断

在测试区、参照区均出现红线（两条红线），待检标本HCG阳性；参照区出现红线，测试区不出现红线（一条红线）待检标本HCG阴性；参照区不出现红线，试剂条失效。

实验五免疫细胞的分离纯化

一、概述

获得高纯度的免疫细胞是许多免疫实验基本前提。可根据免疫细胞的不同特点应用相应方法分离纯化免疫细胞。

二、外周血单个核细胞的分离（密度梯度离心法）

1. 原理：外周血单个核细胞（PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞。PMNC比重比红细胞和粒细胞比重小，利用比重介于两者之间的淋巴细胞分离液分离出PMNC。

2. 方法：。

抗凝血稀释→在离心管加入淋巴细胞分离液→将稀释的抗凝血叠加在淋巴细胞分离液上→水平离心→吸取单个核细胞层移入另一干净试管→洗涤单个核细胞→将单个核细胞重悬于淋巴细胞培养液，备用。

实验六细胞免疫功能测定

一、概述

对免疫细胞进行功能测定，可反映机体免疫状态。

二、E玫瑰花环试验（示教试验）

1. 原理：可根据T细胞可以与绵羊红细胞形成E花环而B细胞不能形成E花环区分T 细胞和B细胞，计数E花环细胞（T细胞），计算E花环形成率。活性E花环形成率可反映对绵羊红细胞高亲和力的T细胞亚群在淋巴细胞中所占比例。总E花环形成率可反映T细胞在淋巴细胞中所占比例。T细胞缺失患者该比例下降。

2. 结果：注意观察E花环形成细胞和未形成E花环淋巴细胞。

三、淋巴细胞转化试验（示教试验）

1. 原理：淋巴细胞转化试验反映T细胞（或B细胞）的应答能力。PHA是刺激T细胞转化的非特异性有丝分裂原，在PHA刺激下T细胞转化为淋巴母细胞，而B细胞不发生转化。计算转化细胞在淋巴细胞中所占比例（转化率）反映T细胞应答能力。

2. 结果：注意观察典型淋巴母细胞特征。