双缩脲试剂配置

(一) 方法学评价试验双缩脲试剂配置

摘要

目的：掌握双缩脲法的试剂的配置，并熟悉和掌握分光光度计的使用方法掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理与操作

方法：标准管法测物质含量的方法、双缩脲法测定蛋白质含量的方法、双缩脲反应法

结果：成功的配置双缩脲试剂，血清总蛋白的量是38.27g/l.

结论：能够按照正确的方法配置双缩脲试剂，并测定出血清总蛋白量。

英文翻译

Abstract Master configuration Biuret reagent，and Familiar with and master the use of the spectrophotometer。Master the principle and operation of the determination of total proteins by Biuret Method。

Methods Standard tube method to measure the material content，

Double deflation urea method for the determination of protein content and Biuret reaction.

Result configuration of biuret reagent Successfully ,The serum total protein amount of 38.27g/l.

Conclusion We can use the correct way to configured Biuret reagent,

and we know determination of serum total protein.

关键词：双缩脲法配置血清总蛋白

前言

双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生

成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物

都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红

色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行测定，这种紫

红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正

比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。

1.材料和方法

1.1材料硫酸铜（CuSO4·5H2O）、酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）、KI固体

NoOH晶体标准蛋白质溶液可见光分光光度计、钥勺、试管、烧杯、玻璃棒、旋涡混合器

1.2 方法（操作过程）

（1）6mol/L NaOH溶液25ml：用烧杯称取NaOH 6 g，量取蒸馏水25 ml加入烧杯溶解NaOH，备用。

（2）双缩脲试剂，称取以0.75克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于新鲜制备的

500ml的蒸馏水，加入2.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），【用于结合Cu2+,用于防止CuO在碱性条件下沉淀】并加入KI 1.5g【防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu

2

O的离析】，等到完全溶解后，在搅拌下加入6g/lNaOH溶液25ml，并用水定容到250ml，放置塑料瓶中盖紧保存。

（3）取三支试管按下表进行操作

试管号空白管B 标准管S 测定管T

血清（mL）0 0 0.06

标准蛋白（mL）0 0.06 0

蒸馏水（mL）0.06 0 0

双缩脲试剂（mL） 3 3 3

旋涡混合器摇匀，37℃水浴10分钟,后用分光光度计于540nm波长处比色，以空白管调零点，测得各管吸光度。

2.结果

标准管是0.185，待测管是0.118，

血清总蛋白（g/l）=A

u /A

s

x C

标准

（g/l）=0.118/0.185x60g/l=38.27g/l

3、讨论

3.1 实验结果讨论

3.1.1 我的结果是：S / Abs. T=0.185/0.118=1.568/与参考范围接近，说

明实验误差不是很大本次实验的结果参考范围应该是

Abs. S≈0.140 – 0.160，

Abs. T≈0.090 – 0.110， Abs. S / Abs. T≈ 1.5,

对部分同学结果进行讨论：

3.1.2 同学甲 Abs. S=0.259，Abs. T=0.211，此同学的结果偏大，原来是该同学加样的是误把蛋白质标准溶液加了0.1ml.把双缩脲试剂加5ml，做实验不够认真和细心。

3.1.3 同学乙 Abs. S=0.088，Abs. T=0.061，这个同学的结果偏低，是他加样

的时候，由于加样枪的枪头已经部分老化，封密性不够好，导致加的蛋白质标准溶液不够0.6ml。以后做实验时候一定要注意实验仪器造成的误差。

3.1.4同学丙 Abs. S=0.113，Abs. T=0.096,是由于此同学在操作加样枪的时候，

按针筒的时候用力过度，导致每一次加样都是超过0.6ml，是操作不规范造成的实验误差。

3.2 实验过程中的讨论

3.2 .1 加试剂时候按不同的顺序会出现不同的溶液颜色的变化。

实验中，加的试剂要先硫酸铜结晶（CuSO

4·5H

2

O）溶于新鲜制备的

蒸馏水，然后加酒石酸钾钠（NaKC

4H

4

O

6

·4H

2

O，接着加KI，班上有同学是加

了硫酸铜结晶CuSO

4·5H

2

O）然后加KI，最后才加酒石酸钾钠（NaKC

4

H

4

O

6

·4H

2

O，

结果颜色是咖啡色，变成咖啡带绿色，实验需要重新做，

3.2 .2 加入的氢氧化钠是为了提供碱性环境，向试剂中加入碘化钾，是为了

延长试剂的使用。

3.2 .3 蛋白质定量测量方法除双缩脲法外,还有如下几种测定方法：寿凯氏定氮

法、紫外吸收法、folin-酚试剂法、考马斯亮蓝法。

4.方法学评价

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

优点：双缩脲法测定蛋白质测定范围能够是1~10mg蛋白质，操作简单、快捷。既适合手工操作，又适合自动化分析，重复性好、线性关系好，双缩脲试剂可以长期保存（若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制）。

缺点：灵敏度差，测定范围窄，样品需要量大，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，因此它常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。干扰测定的物质包括有：在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。

5.临床意义：

用双缩脲法测定蛋白质含量，假如血浆蛋白质浓度增高，临床上主要见于因各种原因引起的血浆浓缩；假如血浆蛋白浓度降低，临床上主要见严重肝病、肾病、营养不良、血液稀释等，对有关疾病的早期诊断预后观察具有一定的参考价值。

参考文献

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版社,1997: 155～156.

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