免疫印迹步骤

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免疫印迹法（PDF）

免疫印迹法免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot。

免疫印迹法分三个阶段进行。

第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。

此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。

此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。

第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。

常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。

阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。

本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。

在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。

抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。

根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。

一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。

免疫印迹步骤

2.6 免疫印迹（Western blot）（1）裂解细胞，提取细胞总蛋白：收集细胞（约2×106），离心洗涤2次，加入100µL RIPA裂解液，置冰上反应30min，4℃12,000r/min离心15min，取上清，蛋白定量后分装，-80℃冻存备用；（2）蛋白定量：Bradford法测定蛋白质含量[35]：①分别在微量离心管中各加入0.5mg/mL BSA 5µL、10µL、15µL及20µL，以0.15mmol/L的NaCl补足至100µL，同时以两管100µL的0.15mmol/L的NaCl作空白对照。

②每管各加入900μL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡混匀，室温放置2min。

③用1cm光径的微量比色杯测A595吸光值，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，并测量待测样品的A595吸光值，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。

（3）SDS-PAGE电泳①制胶SDS丙稀酰胺凝胶12％分离胶8％分离胶5％积层胶去离子水 3.3mL 4.6mL 2.7mL1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8)2.5mL 2.5mL －1.0mol/L Tris-Cl(pH6.8) －－0.5mL30%丙稀酰胺 4.0mL 2.7mL 0.67mL10% SDS 0.1mL 0.1mL 0.04mL10%APS 0.1mL 0.1mL 0.04mLTEMED 0.004mL 0.004mL 0.004mLTotal 10mL 10mL 4mL其中10%APS和TEMED需等临灌胶之前再加入。

先配制好分离胶，在涡旋混合器上混匀，立刻用吸管将胶缓缓灌入到大小两块玻璃板之间，至胶的最上缘距玻璃板顶端3cm左右。

再用去离子水覆盖在分离胶的上层，封闭空气使胶易于凝固。

室温静置1h左右可看到去离子水和胶之间由于折射率不同而出现一条界限，说明胶已经凝好，可用注射器小心吸出上层的去离子水。

免疫印迹操作步骤

1．主要内容检测限为2—20fmol，或约0．1～lng的50kDa蛋白质有多个操作步骤，需2天(或1天)时间完成。

检测抗原的存在，定量及其大小。

半定量至全定量。

抗原的检测依赖于耐变性的表位。

一般，低亲和力抗体亦可使用。

2．操作步骤(1)将蛋白质溶解于Laemmli样品缓冲液中。

最终的样品缓冲液条件是2％SDS、100mmol／LDTT(从lmol ／L的储存液中取出，临用前加入，该储存液置于—20℃冷冻保存)、60mmol／LTris(pH6．8)、0。

01％溴酚蓝和10％甘油。

全细胞可直接放在样品缓冲液中进行溶解；纯化或部分纯化的溶液可用2％的样品缓冲液1：1进行稀释。

加热至70℃10min。

最终蛋白质浓度应不超过150ug／每孔(微型胶不超过15pg／每孔)。

(2)将样品放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，移去平板，将凝胶剪成适当大小以进行转印。

在凝胶上作记号以确定方向。

(3)剪1张硝酸纤维素膜和4张吸附滤纸(Whatman 3MM或替代物)，其大小与凝胶相当。

(4)将硝酸纤维素膜放入蒸馏水中润湿。

将膜转入转印缓冲液中浸泡5min。

将吸水纸浸泡于转印缓冲液中。

转印缓冲液1(20 000～400 000kDa蛋白质)：48mmol／LTris，390mmol／L甘氨酸、0．1％(w／v)SDS、20％甲醇加蒸馏水至1000ml。

转印缓冲液2(<80 000kDa蛋白质)：25mmol／LTris、190mol／L甘氨酸、20％甲醇加蒸馏水至1000ml。

(5)将凝胶、印迹膜、滤纸和支持垫浸入转印缓冲液中使其完全浸泡。

小心地将支持垫中的气泡排出。

(6)组装转印夹层组合：依次为支持垫、2张吸水纸、凝胶、膜、2张吸水纸和支持垫。

将组装好的夹层组合放入转印槽中，并使膜靠近正极(阳极，红色电极)。

(7)于4C条件下转印过夜。

分子质量>100 000kDa的蛋白质，先在28V转印1h，然后在84V转印14～16h。

免疫印迹(immunoblotting)

免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。

由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。

免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。

b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。

2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。

3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。

4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。

5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。

b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。

c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。

加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。

6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。

图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

免疫印迹分析流程

免疫印迹分析流程
一、实验准备
1.准备试剂和设备：免疫印迹分析需要的试剂和设备包括蛋白样本、SDS-凝胶、转膜膜、植物生物素-磷酸化酶、抗体等。

2.蛋白样本制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-凝胶中，通过电泳
分离蛋白。

3.封闭：将分离的蛋白转移到转膜膜上，然后使用封闭液（如牛奶或BSA）阻断非特异性结合位点。

4.探测：将转膜膜与目标蛋白特异性的抗体结合，然后添加辅助试剂（如生物素-磷酸化酶）使得信号可检测。

5.探测：将荧光标记的探针（如荧光素-磷酸化物）与辅助试剂结合，产生荧光信号。

6.检测：使用荧光成像系统或其他适当的设备检测荧光信号，分析结果。

二、应用领域
1.蛋白表达分析：免疫印迹可以用于检测蛋白在细胞中的表达水平，
通过比较不同细胞或不同条件下蛋白的表达水平，可以进一步研究蛋白的
功能和调节机制。

2.蛋白相互作用分析：免疫印迹可以用于检测蛋白与其他分子（如受体、配体等）的相互作用，从而揭示蛋白在信号传导通路或代谢途径中的
作用机制。

3.肿瘤标志物检测：免疫印迹可以用于检测肿瘤标志物，帮助早期诊
断和监测肿瘤的进展，为个体化治疗提供依据。

4.免疫原性研究：免疫印迹可以用于检测抗原的免疫原性，用于疫苗
研发和免疫治疗的评估。

5.药物筛选和评价：免疫印迹可以用于评估药物对特定蛋白的作用效果，帮助筛选和优化药物开发。

总之，免疫印迹是一种重要的生物技术方法，可广泛应用于生物学和
医学研究领域，为我们更深入地理解生命的奥秘提供了有效的工具和手段。

免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明

免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。

免疫印迹(immunoblotting)

免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。

由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。

免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。

3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。

4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。

5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。

b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。

c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。

加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。

6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。

图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明

免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。

下面将详细介绍WB实验的具体步骤。

1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。

使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。

再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。

2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。

3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。

电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。

电泳结束后，将凝胶转移到膜上。

4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。

5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。

常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。

6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。

一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。

7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。

8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。

10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。

最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。

11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。

需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。

同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

免疫印迹法原理

免疫印迹法原理
免疫印迹法是一种实验室技术，用来检测抗体与抗原之间的相互作用。

它是一种比较灵敏的技术，可以快速准确地测量抗体和抗原之间的交互作用。

这一方法的特点是可以检测到极低浓度的抗体，并且可以在短时间内完成测试。

免疫印迹法通常具有五个步骤：1）准备抗原：将抗原溶解在溶剂中，以便它能够与抗体结合。

2）制备抗体：将抗体溶解在溶剂中，以便它能够与抗原结合。

3）将抗体与抗原混合：将抗体和抗原混合，使它们能够形成结合物。

4）检测结合物：使用某种技术，如荧光技术，来检测抗体和抗原之间的结合物。

5）分析结果：对检测到的结合物进行分析，以确定抗体与抗原之间的交互作用。

免疫印迹法在医学诊断中有着重要的应用。

它可以用来检测抗体与抗原之间的结合，以确定患者是否患有特定病毒或疾病。

此外，它还可以用来检测肿瘤细胞，以确定是否有癌症。

免疫印迹法的优点是，它可以检测到极低浓度的抗体，可以在短时间内完成测试，并且可以检测出抗体与抗原之间的结合物。

它的缺点是，它只能检测出抗体与抗原之间的结合，而不能检测出抗体与抗原之间的其他关系。

免疫印迹法是一种灵敏、准确的技术，可以用来检测抗体与抗原之
间的结合，以确定患者是否患有特定病毒或疾病。

它可以快速准确地检测出极低浓度的抗体，并且可以在短时间内完成测试。

因此，免疫印迹法在医学诊断中具有重要的应用。

免疫印迹分析流程

免疫印迹分析流程
免疫印迹分析(Western Blot)是一种常用的蛋白质分析方法。

它的基本流程包括:
1. 样品制备:提取并定量蛋白质样本。

常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。

2. 电泳分离蛋白:使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。

根据分子量的不同,蛋白质会在凝胶上分离成不同的条带。

3. 转膜:将凝胶中的蛋白转移到NC膜或PVDF膜上。

4. 滤膜:使用5%脱脂奶粉或BSA在室温封闭1小时,以阻断膜胶的非特异性结合位点。

5. 一抗反应:加入特异性的一抗,孵育过夜。

一抗与目标蛋白特异性结合。

6. 二抗反应:洗涤后加入连接HRP的二抗,孵育1-2小时。

二抗与一抗结合。

7. ECL显色:滴加显影液,HRP催化发光底物氧化产生发光信号。

8. 凝胶成像:曝光、扫描和记录结果。

目标蛋白会出现特异性的条带。

9. 数据分析:通过条带的位置和强度分析目标蛋白的相对分子量和表达量。

以上是免疫印迹分析的基本流程。

根据实验目的,可以选择不同的样品制备方法、凝胶系统、转膜系统等,从而实现对蛋白质的分离、定量和功能分析。

WesternBlot（免疫印迹法）步骤

WesternBlot（免疫印迹法）步骤主要包括以下4 个基本步骤：样品制备；电泳分离；蛋白的膜转移；免疫杂交与显色――蛋白检测。

溶液和试剂1. 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)2. ModifiedRIPAbuffer：Tris-HCl:50 mM, pH 7.4； NP-40: 1%；Na-deoxycholate: 0.25%；NaCl: 150 mM；EDTA:1 mM；PMSF: 1 mM；Aprotinin,leupeptin,pepstatin:1 microgram/ml each；Na3VO4: 1 mM；NaF: 1 mM3. 1X SDS 样品缓冲液：62.5 mMTris-HCl(pH 6.8 于25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mMDTT, 0.01% w/v溴酚蓝4. 转移缓冲液：25 mM Trisbase, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)5. 10X Tris缓冲盐 (TBS)：准备1L 10X TBS：24.2 g Trisbase, 80g NaCl；用1N HCl调pH为 7.67. 甲醇8. TBS/T缓冲液：1X TBS, 0.1% Tween-209. 封闭缓冲液(TBS/T)：1X TBS,0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA10. 一抗的稀释：1X TBS,0.1% Tween-20 加 5% BSA ( 多抗) 或5%脱脂奶粉( 单抗)。

Note：一般来说，BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。

预染的蛋白质marker，可用于监测转膜的效率。

样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

1.培养细胞或药物处理。

2.弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。

免疫印迹检测方法

免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。

2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。

这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。

其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。

4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。

这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。

5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。

此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。

immunoblotting免疫印迹法

immunoblotting免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblotting）是一种常用的蛋白质检测方法，它通过使用特异性抗体来检测目标蛋白质在复杂的混合物中的存在和量。

免疫印迹法的原理是将蛋白质样品分离后转移到固定膜上，然后用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过检测抗体标记物的信号来确定目标蛋白质的存在与数量。

免疫印迹法的步骤如下：1.蛋白质分离：首先，将待测样品进行电泳分离。

通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，根据蛋白质的分子量大小将其分离成不同的带状条带。

2.转印：将蛋白质从凝胶转移到固定膜上。

这个步骤通常使用西方半湿法或湿法转印，将凝胶和膜夹在一起，通过电流使蛋白质从凝胶逐渐转移到膜上。

3.阻断：为了减少非特异性结合，需要用饱和蛋白或其他蛋白质进行膜的阻断。

常见的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）或非脂干奶粉。

4.抗体结合：将特异性的一抗加入到含有阻断剂的缓冲液中，将膜与抗体溶液一同孵育，使抗体与目标蛋白质结合。

5.清洗：将膜用洗涤缓冲液洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的成分。

6.检测：将抗体标记物（如荧光素、辣根过氧化物酶等）加入到膜上，使其与结合的抗体发生特异性反应。

通过荧光素的化学反应或辣根过氧化物酶底物的显色反应来产生可见的信号。

这些信号可以通过数字成像系统进行记录和分析。

免疫印迹法的优点包括：能够检测特定蛋白质的存在和量；需要样品量比较小，一般几微克；灵敏度高，可检测到非常低浓度的目标蛋白质；可以同时检测多个蛋白质。

然而，免疫印迹法也存在一些局限性，如需要已知的特异性抗体来进行检测，如果没有可用的抗体，就无法检测目标蛋白质；对于高分子量的蛋白质，由于电泳分离的限制，可能无法很好地分离和转移；部分抗体可能存在交叉反应或非特异性结合问题；荧光或显色信号必须进行定量分析才能获得准确的结果。

总体来说，免疫印迹法是一种常用且可靠的蛋白质检测方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20n 封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。

抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。

n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

免疫印迹实验步骤及问题解决

免疫印迹实验步骤及问题解决一、实验步骤试剂和缓冲液1x RIPA 缓冲液: 50 mM Tris，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5% SDS，1% Triton X-100 或NP40. 1x PBS 缓冲液: 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，2.7 mM Na2HPO4，2.7 mM KH2PO4，pH 7.4 BCA或Bradford蛋白分析试剂盒1.5 M Tris缓冲液（pH 8.8）: 90.68 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到8.81.0 M Tris缓冲液（pH 6.8）: 60.58 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到6.810% APS: 100 mg AP 溶于1 ml ddH2O。

用前准备10% SDS: 10 g SDS溶于100 ml ddH2O。

1x Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 25 mM Tris，230 mM 甘氨酸（pH 8.3），0.1% SDS。

3x SDS蛋白加样缓冲液: 150 mM Tris （pH 6.8），6% SDS，30% 甘油，30 mM EDTA和0.2% 溴酚蓝1x TTBS: 25 mM Tris（pH 7.5）: 0.15 M NaCl，0.05% Tween-20，0.001% 硫柳汞1x 转移缓冲液: 3 g Tris，14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddH2O 到1L样品准备细胞培养样品贴壁细胞去除培养基，用1X PBS冲洗去掉残留培养基加入预冷的400 ul-1 ml 1X RIPA缓冲液/100 mm平皿。

在冰上孵育5-10 min。

完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 ml离心管中。

（可选）充分混匀或超声处理。

4°C下12,000 rpm离心10-15 min并收集上清总蛋白用前需储存在-20°C。

免疫印迹法基本步骤

免疫印迹法基本步骤
一、蛋白质样品制备
1. 组织或细胞样品：将组织或细胞放入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液中，通过超声破碎或匀浆器破碎细胞，释放出胞内蛋白质。

2. 细菌样品：将细菌培养物离心收集菌体，用超声波破碎菌体，释放出蛋白质。

3. 血清样品：直接使用。

二、凝胶电泳
1. 将制备好的蛋白质样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离出不同大小的蛋白质。

2. 在电泳过程中，蛋白质带电荷量不同，大小也不同，因此会形成不同的条带。

三、转膜
1. 将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。

2. 在转移过程中，蛋白质通过电荷和疏水作用吸附到膜上，保持原有的相对分子量和特异性。

四、免疫反应
1. 将膜与一抗进行孵育，一抗能够与特定的蛋白质结合。

2. 孵育后清洗掉未结合的一抗，再将膜与二抗孵育。

二抗能够与一抗结合，起到放大的作用。

3. 二抗的标记物可以是酶、荧光物质或放射性同位素等，便于后续的检测和信号放大。

五、检测
1. 根据标记物不同选择相应的检测方法，如化学发光法、荧光法、放射自显影法等。

2. 通过检测器检测膜上的信号强度，分析特定蛋白质的表达情况。

六、结果分析
1. 对电泳图谱和免疫印迹图谱进行比较和分析，确定目标蛋白质的位置和相对表达量。

2. 将实验组与对照组进行比较，判断蛋白质表达的差异。

immunoblotting免疫印迹法 -回复

immunoblotting免疫印迹法-回复什么是免疫印迹法（immunoblotting）？免疫印迹法（immunoblotting）是一种分析蛋白质的方法，用于检测目标蛋白质在样本中的存在、确定其分子量以及评估其表达水平。

该技术基于免疫学原理，利用抗体对特定的蛋白质进行特异性检测。

免疫印迹法的步骤如下：步骤一：样品制备在进行免疫印迹分析之前，需要从细胞或组织样本中提取蛋白质。

样品制备可以通过细胞裂解和组织破碎等方法来完成。

裂解细胞的方法包括机械裂解、声波裂解和化学裂解等，这会释放细胞内的蛋白质。

组织样本通常需要经过液氮的冷冻-解冻循环，配合高速离心和组织破碎试剂进行组织破碎，以获得蛋白质。

步骤二：蛋白质分离提取的蛋白质需要通过电泳方法进行分离。

常用的电泳方法有SDS-PAGE 和Native PAGE。

其中，SDS-PAGE在分离蛋白质时使用SDS（十二烷基硫酸钠）使其带负电荷，从而实现蛋白质按照分子量大小进行分离。

NativePAGE则不使用SDS，保留了蛋白质的原有电荷和构象，适用于研究蛋白质间的相互作用和酶活性等性质。

步骤三：蛋白质转移分离的蛋白质需要被转移到膜上用于后续的免疫检测。

这一步骤称为电转印（electroblotting），通常使用半干式或湿式转印两种装置进行转印。

在转印过程中，将凝胶和膜以规定的条件接触并传送蛋白质，使之迁移到膜上。

通过这一步骤，蛋白质被定位到膜上并准备进行免疫检测。

步骤四：蛋白质检测转移膜上的蛋白质现在可以进行特异性的免疫检测。

在这一步骤中，转移膜需要被封闭以避免非特异性抗体的结合，并与目标蛋白质特异性结合的一抗孵育。

一抗的选择应基于研究者所需表达的目标蛋白质。

一旦一抗与特定蛋白质形成特异性结合，未结合的一抗需要被洗去。

接下来，可以使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等二抗来进一步检测目标蛋白质。

这些二抗与一抗发生特异性结合，形成二抗-一抗复合物，可被检测出来。

免疫印迹介绍及试验过程

免疫印迹免疫印迹免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Westernblotting）,是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。

由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。

免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

免疫印迹法的基本原理将混合抗原样品在凝胶板上进彳t单向或双向电泳分离，然后取固定化基质膜与凝胶相贴。

在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下，使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上，并且固相化。

最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析。

免疫印迹法的基本步骤免疫印迹法（以抗原分析为例）基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤。

在每一步中因采用的具体实验方法不同，可构成多种免疫印迹分析系统。

免疫印迹法的优点免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。

它具有下列优点：1、湿的固定化基质膜柔韧，易于操作；2、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近，不会象凝胶那样受孔径阻隔；3、免疫印迹分析只需少量试剂；4、孵育、洗涤的时间明显减短；5、可同时制作多个拷贝，用于多种分析和鉴定；6、结果以图谱形式可长期保存；7、免疫探针可通过降低PH值等方法，象抹去录音磁带一样将探针抹掉，再换用第二探针进行分析检测。

免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此，它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。

免疫印迹免疫印迹又常称Westernblot,是一综合性的免疫学检测技术。

它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。