免疫印迹步骤

2.6 免疫印迹（Western blot）

（1）裂解细胞，提取细胞总蛋白：收集细胞（约2×106），离心洗涤2次，加入100µL RIPA裂解液，置冰上反应30min，4℃12,000r/min离心15min，取上清，蛋白定量后分装，-80℃冻存备用；

（2）蛋白定量：Bradford法测定蛋白质含量[35]：

①分别在微量离心管中各加入0.5mg/mL BSA 5µL、10µL、15µL及20µL，

以0.15mmol/L的NaCl补足至100µL，同时以两管100µL的

0.15mmol/L的NaCl作空白对照。

②每管各加入900μL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡混匀，室温放置2min。

③用1cm光径的微量比色杯测A595吸光值，取A595吸光值对标准蛋白浓

度作图，画出标准曲线，并测量待测样品的A595吸光值，从BSA标

准曲线中确定待测样品的浓度。

（3）SDS-PAGE电泳

①制胶

SDS丙稀酰胺凝胶

12％分离胶8％分离胶5％积层胶去离子水 3.3mL 4.6mL 2.7mL

1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8)

2.5mL 2.5mL －

1.0mol/L Tris-Cl(pH6.8) －－0.5mL

30%丙稀酰胺 4.0mL 2.7mL 0.67mL

10% SDS 0.1mL 0.1mL 0.04mL

10%APS 0.1mL 0.1mL 0.04mL

TEMED 0.004mL 0.004mL 0.004mL

Total 10mL 10mL 4mL

其中10%APS和TEMED需等临灌胶之前再加入。先配制好分离胶，在涡旋混合器上混匀，立刻用吸管将胶缓缓灌入到大小两块玻璃板之间，

至胶的最上缘距玻璃板顶端3cm左右。再用去离子水覆盖在分离胶的上层，封闭空气使胶易于凝固。室温静置1h左右可看到去离子水和胶之间由于折

射率不同而出现一条界限，说明胶已经凝好，可用注射器小心吸出上层的

去离子水。在两层玻璃板间插好合适厚度和宽度的齿梳，再将积层胶灌制

在分离胶的上层，没过齿梳至玻璃板顶端。室温静置20~30min左右，浓缩

胶可以凝好。将齿梳拔出，小心取出玻璃板去掉两板间的间隔条，再将两

层玻璃板翻转，将大板朝外重新置于塑料套件中，将整个套件置于电泳槽

中，用去离子水冲洗上样孔，向电泳槽上下槽中加入适量电泳缓冲液。

②准备样品：向(10~20)µL样品/5μL蛋白marker加入2×Loading

buffer(1/2样品体积)，煮沸3～5min后取出，稍微离心。

③上样：用注射器加样，样品的蛋白量为50µg/孔，同时加蛋白marker。

④电泳：恒流10mA/板，当溴酚兰前沿到达分离胶时，电流改至15mA/

板，直至溴酚兰到胶底部时终止。

（4）转膜（湿转）：电泳结束后，关闭电源，取出玻璃板。用塑料平铲撬开小板，切去上部的浓缩胶，将转膜用的夹子浸入盛有转移缓冲液的托盘中展开，按以下顺序安装黑色栅（阴性电极）、吸水海绵、三张滤纸、凝胶、标记好的PVDF膜（用前用甲醇浸泡1min）、三张滤纸、吸水海绵、红色栅（阳性电极）。每放一层均用玻璃棒赶出层间气泡。将夹子卡上放入电转移装置中，使PVDF膜朝向正极侧，胶则在负极侧，加入转移缓冲液。在恒流200mA，4℃条件下，通过电转移将蛋白从SDS-PAGE胶转到硝酸纤维素膜上，转膜约2-3h，转移结束后，关闭电源，取出转印膜。

（5）免疫杂交

①将PVDF膜用1×TBS漂洗5min。

②10％牛奶封闭液封闭膜上的非特异性抗原位点，在水平脱色摇床上

室温震摇1h，转速90r/min。

③1×PBST 摇动洗膜3次，每次10min。

④加入用1×PBST稀释的HIF-1α兔多克隆抗体（1:500），4℃摇动过

夜。

⑤1×PBST 摇动洗膜3次，每次10min。

⑥ 加入用PBST （不含叠氮钠）稀释的辣根过氧化物酶（HRP ）标记的羊抗兔Ig （1:10,000）室温摇动孵育1h 。

⑦

1×PBST 摇动洗膜3次，每次10min 。 ⑧ 显像：按Pierce 公司的ECL 试剂盒方法，通过HRP 使化学发光底物氧化发出蓝光可以使X 光胶片显影，进行荧光显迹反应，具体步骤如下。 ⑨ 将膜放入现配的含过氧化氢/鲁米诺和对碘苯酚的底物混合液中，平稳摇动10min ，使膜和底物充分作用。

⑩ 取出膜将水滴干，以膜正面朝下放在一张透明的塑料保鲜膜上，向后折叠用保鲜膜将膜包裹好，排除其间的气泡。将膜正面向上放入压片盒中，用胶带固定四角。

○11 在暗室中将X 光胶片压置在膜上，曝光1~3min 后取出X 光胶片，置于显影液中，至出现清晰图象（约2min ），取出沥干水分再置于定影液中2min 。用清水冲洗胶片，晾干。

（6） 胶片用凝胶成像分析仪进行光密度扫描，用Bandscan 分析软件对图像条带作半定量分析，各组条带的光密度值结果以s x _表示，用SPSS10.0数据统计软件One-Way ANOV A 的LSD 对组间数据进行处理和分析。