(完整版)三微生物分离纯化技术

实验三微生物分离纯化技术

一、目的要求

掌握浇注平板法、平板涂抹法和平板划线法分离微生物的基本原理和具体操作

二、实验材料

1、菌种

2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基

3、试剂和仪器：无菌水、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、水浴锅

2人一组，每人分别用三种方法操作三个培养皿

三、实验原理

平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后，取其中一合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置室温下培养。最后可从其表面和内层出现的许多单菌落中选取典型代表，将其转移至斜面培养后保存，此即为初步分离的纯种。

涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布棒把菌液均匀地徒步在装个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面，经培养后保存。

四、实验过程

（1）稀释平板法

A 每组取培养皿2只，即每个同学做1只。先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。

B 另取一吸管，以无菌操作法吸取10-3或10-4稀释液0.2mL，加在无菌培养皿的一边；

C 取已熔化的在水浴锅中保温45－50 ℃左右的培养基，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于37 ℃恒温培养。

（2）平板涂抹法

A 每组取无菌培养皿2只（每个同学做1只）。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释

度、组别、班级。

B 取已熔化的培养基倒入培养皿制成平板。

C 凝固后，另取一支吸管吸取10－3或10－4的土壤稀释液0.2 mL放在平板上。

D 用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于37 ℃条件下培养。

（3）平板划线法

A 每组取无菌培养皿2只，在皿底贴上标签，注明事项。取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。

B 凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－3或10－4）在平板上划线。

连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。

C 划线完毕，盖上皿盖，倒置于37℃温室培养。

五、思考题

1、用平板划线法进行纯种分离的原理是什么？

答：平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。

2、要防止平板被划破应采取哪些措施？

答：接种环的环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，培养基的琼脂含量宜高些。

3、试比较浇注平板法和涂布平板法的优缺点和应用范围。

答：浇注平板法较适合兼性厌氧的细菌和酵母菌的分离，涂布平板法则更适用于好氧性或有气生菌丝的放线菌和细菌的分离。