microRNA(miRNA)引物设计及过程原理说明
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microRNA(miRNA)引物设计及过程原理说明microRNAs的平均长度23nt左右,所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别,以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程,以帮助大家对各方面的学习。
首先,引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。
我们拿经典颈环序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介绍。打开DNAstar软件的PrimerSelect;file打开下拉菜单;打开Enter New Primer…;粘贴颈环序列;点击OK。
颈环结构已经输入,下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。选择颈环结构(鼠标点一下);点击Report下拉菜单;选择Primer Hairpins。
第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。
下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解
has-miR-122-5P:UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU
将U转T,方便后面使用:TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT
miRNAs的颈环结构引物:是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构。(自己根据后面图片想一下原因,加6个碱基为经验所授)
has-miR-122-5P的后6位:GTTTGT
has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列:ACAAAC
颈环引物序列:
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC -3’
查看形成的发夹结构(方法前面有讲)
看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子:
在含反转录酶及适当的条件下,miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCAT TGTCACACTCCA
查看cDNA结构:
我们知道了cDNA的合成过程和序列,同时学习了miRNA的反转录过程。
下面进入重头戏,教大家如何进行miRNA引物设计。首先如果你的前面实验是芯片的就在miRbase上再查看核对一遍,如果是测序实验的需要将miRNA的名字3p或5p及之前的部分复制到miRAN上查找完整序列。将得到的miRNA完整序列复制到一个excel表中,然后使用查找替换将U改为T(一定要记住改换,要不然primer5.0是不认U的)。
为了后面引物设计方便,需要以miRNA序列构建引物,所以需要将miRNA的cDNA的反向互补序列找出。使用primer5.0。
打开File下拉菜单;New;DNA Sequence。
由于正规设计过程中不会先把cDNA序列找出来,所以直接操作过程为先将miRNA序列(U改T)输入,再输入颈环结构序列的反向互补序列。
复制miRNA序列(U改T);点击primer5.0序列框,使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列;选择正向序列。
复制颈环结构序列;点击primer5.0序列框,使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列;选择反向互补序列输入Reverse Complemented。
到这一歩cDNA的反向互补序列已经输入完毕,下一歩是在primer5.0上进行引物设计。
1.在序列前面输入9个N(这个是个人习惯,也有人是6个或以
上的A,也有人是不输入就直接设计引物的),因为miRNA序列太短,很多时候不能设计出符合实验需要的miRNA,所以在
设计正向引物时,一般需要加入3-6个碱基,最多时加入8个碱基,以满足正向引物的设计;
2.点击Function框下的Primer,开始设计上下游引物;
3.有经典颈环结构自然也就少不了常用的下游引物,一般使用C
AGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC。同时还可以适当的在颈环序列中前后移动碱基设计下游引物;
4.自动跳出的显示框中默认选择的是下游引物,正好符合先将
常用下游引物输入的操作。下游引物相当比较固定,先输入下游引物对整个引物设计能够提高设计效率。
5.点击框内的Edit Primers;选择所有引物序列;使用组合键
“Ctrl+V”输入下游引物,输入方式为反向输入Reversed;
点击OK;
点击Analyze分析引物基本信息;点击Prime寻找引物在序
列里结合部位;点击OK确定下游引物;
6.点击上下游转换键(图示),开始设计上游引物;点击Edit
Primers;
7.去除前面的9个N;点击Analyze;点击prime;查看前面不
添加序列时的上游引物状况如何。
在这里的主要问题是Tm值太低,第二个问题是长度稍短。8.绝大多数情况下在前边添加的序列已GC为主,且在加GC序
列时如果序列中间不以AT隔开则TM值上升比值高,同理加AT序列。不要出现GCGC、ATAT、GCCG、或连续4个不同的核苷酸,这些失误会造成引物评分的降低。个人喜欢加CGGGC、GCGGGC、A/TGCCCG等。
9.例如加入ACGGGC(5’端加入,别在3’端);点击Analyze;
点击prime;查看引物的长度和TM值差不多了就行。当然不是全行了,还要查看引物的自身颈环结构,自身引物配对,重要指标为dG(当然还有其他,哈哈)。下游引物不用看了,因为是经典嘛,呵呵。点击OK。
10.再查看一下引物对之间的匹对情况,加以对上游引物的修
改,或者更换下游引物。有必要点击比对框下的All查看所以的匹对情况,呵呵,希望你懂的。
11.想做好实验的同学可以在DNAstar的PrimerSelect中进