LAMP技术原理和引物设计

LAMP原理及引物设计与实例

.LAMP引物的设计

LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域,基于靶基因3' 端的

F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。

FIP(Forward Inner Primer):上游内部引物,由F2区和F1C区域组成,F2区与靶基因3’端的F2c区域互补,F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。

F3引物:上游外部引物(Forward Outer Primer),由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。

BIP引物:下游内部引物(Backward Inner Primer ),由B1C和B2区域组

成,B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补,B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.

B3引物:下游外部引物(Backward Outer Primer ),由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。

2.扩增原理

60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度,DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此, DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。

第1阶段为起始阶段,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合(如图B所示),在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸,置换出完整的FIP连接的互补单链(如图C所示)。FIP上的F1c与此单链上的Fl 为互补结构。自我碱基配对形成环状结构(如图C所

示)。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成,形成哑铃状结构的单链。迅速以3' 末端的Fl区段为起点。以自身为模板,进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板,FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成,解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点,以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换.形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA,BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB,它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成,周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

MP的特点

LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点:

(1)操作简单,LAMP核酸扩增是在等温条件下进行,对于中小医院只需要水浴锅即可,产

物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(MP),不需要特殊的试剂及仪器。

(2)快速高效,因为不需要预先的双链DNA热变性.避免了温度循环而造成的时间损失.核酸扩增在l h内均可完成,添加环状引物后时间可以节省1/2,多数情况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍,达0.5 mg/mL.应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。

(3)高特异性,由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。

(4)高灵敏度,对于病毒扩增模板可达几个拷贝,比PCR高出数量级的差异。

缺点:由于LAMP扩增是链置换合成,靶序列长度最好在300 bp以内。>500 bp 则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作,以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。

4.引物设计实例

LAMP引物设计的在线网站(),只要导入靶基因就能自动生成成组引物。

以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程:

首先,单击浏览按钮选择靶基因序列文件,靶序列默认的是小于22 kbp。支持三个类型的文件,普通文本格式(仅含序列)。FASTA格式和GenBank 格式文件。

第二,从下面三个选项中选择定参数设定(引物设计条件)条件。基于GC含量的自动判断, 起始的参数是特定的:如果GC含量小于或等于45%,则选取AT丰度高的区,如果GC含量高于60%,则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。