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• 3 LAMP的特点 • LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： • (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，
产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应 体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。 • (2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成 • 的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情 况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应 用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。 • (3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域 与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 • (4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
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例如：寡核苷酸的浓度为0.1µmol，钠离子的浓度是50mM,镁离子的浓度4 mM等。
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Tm(退火温度=△h*1000/[△S+Rln(C/4)]-273.15+16.6log[Na+] 式中，Tm为退火温度，℃；为摩尔气体常数，1.
区与靶基因3’端的F2c区域互补F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 • F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基
因的F3c区域互补。 • BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，
B2区与靶基因3’ 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 • B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶
类型的文件，普通文本格式（仅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。 • 第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。基于GC含量的自
动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT丰度高的区,如 果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。 • 设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构 的形成，Tm值等因素可以通过Pimer Explore)(一种专门设计LAMP引物的软件)来设计 LAMP反应的引物。
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•在进行LAMEP引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑： •1.引物之间的距离 • F2区段的5’端到B2区段的5’端(LAMP反应扩增的区域)之间的距离建议是120~180bp。 F3区段的3’端到F2区段的5’端之间的距离是0~20bp(同理B2和B3之间的距离是0~20bp)。 F2区段的5’端到F1区段的5f端(形成环的部分)之间的距离是40~60bp。 •2.引物的Trn值 • 引物的Tm值采用近邻分析法(the nearest-neighbor method)来计算，这种方法是目前 认为计算值最接近真实值的一种方法。计算Tm值的时候会受到盐浓度(salt concentration), 寡核苷酸的浓度等实验条件的影响，所以最好是在确定的实验条件下来计算Tm值。
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• 缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。>500 bp则较难 扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。 故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统 的PCR方法。
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• 4 引物设计实例 • LAMP引物设计的在线网站()，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。 • 以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程： • 首先，单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于2 2 kbp。支持三个
基因的B3c区域互补。
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•2．扩增原理
• 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此 温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不 停地自我循环。扩增分两个阶段。 • 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离， 变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作 用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链 （如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。 以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’ 末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循 环的起始结构。 • 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出 的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及 链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产 物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置 换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为 扩增靶序列的交替反向重复序列。
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• 1．LAMP引物的设计 • LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’端的
F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 • FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2