LAMP技术 PPT
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3、GPL(General Public License)
我们很熟悉的Linux就是采用了GPL。GPL协议和BSD, 我们很熟悉的Linux就是采用了GPL。GPL协议和BSD, Apache Licence等鼓励代码重用的许可很不一样。GPL的出发点是代码开源的 Licence等鼓励代码重用的许可很不一样。GPL的出发点是代码开源的 传递。它允许代码免费使用，但不允许修改/ 传递。它允许代码免费使用，但不允许修改/衍生的代码做为闭源的 商业软件发布和销售。 GPL协议的主要内容是只要在一个软件中使用(“使用”指类库引 GPL协议的主要内容是只要在一个软件中使用(“使用”指类库引 用，修改后的代码或者衍生代码)GPL协议的产品，则该软件产品必须 用，修改后的代码或者衍生代码)GPL协议的产品，则该软件产品必须 也采用GPL协议，这就是所谓的“传染性”。因此，商业软件或对原 也采用GPL协议，这就是所谓的“传染性”。因此，商业软件或对原 代码有保密要求的产品不适合使用GPL协议的代码。 代码有保密要求的产品不适合使用GPL协议的代码。 GPL是针对软件源代码的版权，而不是针对软件编译后二进制版 GPL是针对软件源代码的版权，而不是针对软件编译后二进制版 本的版权。你有权免费获得软件的源代码，但是你没有权力免费获得 软件的二进制发行版本。GP对软件发行版本唯一的限制就是：你的发 软件的二进制发行版本。GP对软件发行版本唯一的限制就是：你的发 行版本必须把完整的源代码一同提供。
2、Apache Licence
Apache Licence是著名的非盈利开源组织Apache采用的协议。该 Licence是著名的非盈利开源组织Apache采用的协议。该 协议和BSD类似，同样鼓励代码共享和尊重原作者的著作权，同样允 协议和BSD类似，同样鼓励代码共享和尊重原作者的著作权，同样允 许代码修改和再发布（作为开源或商业软件）。需要满足的条件也和 BSD类似： BSD类似： • 需要给代码的用户一份Apache Licence。 需要给代码的用户一份Apache Licence。 • 如果你修改了代码，需要再被修改的文件中说明。 • 在延伸的代码中需要带有原来代码中的协议、商标、专利声明和 其他原来作者规定需要包含的说明。 • 如果再发布的产品中包含一个Notice文件，则在Notice文件中需 如果再发布的产品中包含一个Notice文件，则在Notice文件中需 要带有Apache Licence。你可以在Notice中增加自己的许可，但 要带有Apache Licence。你可以在Notice中增加自己的许可，但 不可以表现为对Apache Licence构成更改。 不可以表现为对Apache Licence构成更改。 Apache Licence也是对商业应用友好的许可。使用者也可以在需 Licence也是对商业应用友好的许可。使用者也可以在需 要的时候修改代码来满足需要并作为开源或商业产品发布/ 要的时候修改代码来满足需要并作为开源或商业产品发布/销售。
UV lamp讲解
破坏后DNA
4.3 低压单色光谱杀菌过程
低压单色光谱
DNA
proteine
enzyme
仅破坏DNA
低压单色光谱
4.4中压多谱段杀菌过程
多谱段紫外线
OH
DNA
proteine OH enzyme
全面破坏
多谱段紫外 线
多谱段紫外线
4.5 低压紫外灯的细菌光复活
1. PRE Binds to Dimerised Site
188 nm
190 nm
193 nm
254 nm
185 nm
189 nm
192 nm
195 nm
5.6 有效的强度监测
5.7 节约占地和配套管接成本
Hanovia 中压紫外系统
Hanovia低压紫外系统
5.8 中高流量时中压TOC降解对比优势
1. 2. 3. 4.
减小系统占地 降低工程的首期投资 运行维护简单，降低运行维护成本 在线监测系统更为真实反映系统运行情况，可 实现高智能化运行
5.4 低压UV在水中穿透距离
>2 m
低压系统
r= 177 mm
7 mm
TOC Reduction Zone
185 nm
254 nm
5.5 中压UV在中水穿透距离
230 mm
>2 m
中压系统
r= 177 mm 140 mm 100 mm 25 mm 7 mm 43 mm 55 mm Entire Chamber is TOC Reduction Zone
UV在水处理中的应用
1.1什么是紫外线
波长(m) 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9 10-7 Visible 10-6 10-3 10 Radio Frequencies 105
环介导等温扩增技术
简单，快速，准确的基因扩增法
四、问题分析
1.随机采取鸽子翅或尾部羽髓样，用试剂盒提取DNA
01
2.在家鸽在W染色体上找到保守基因并以LAMP引物设计
02
软件设计引物
3.进行应用LAMP法扩增目的基因、不断优化dNTPs、
03
Mg2+、甜菜碱浓度，反应体系温度，反应结果由紫红色
变为天蓝色为雌性，否则为雄性
80℃水浴，5min，结束反应，加指示剂
LAMP反应体系
三、应用
1、LAMP在食品安全中的应用：
水产品和水体中灿烂弧菌现场可视化环介导等温扩增快检方法的建立及应用；环介导等温扩增 技术快速检测植物蛋白饮料中大豆成分等
2、LAMP在动植物疫病检测中的应用：
环介导等温扩增技术检测鼠疫感染动物敏感性的应用性研究；
感谢各位观看
Thank You
3、LAMP在人类疾病检测中的应用：
环介导等温扩增技术在新型冠状病毒检测中的应用研究进展；环介导等温扩增技术（LAMP） 在肺结核诊断中的应用研究
四、问题分析
生产上的鸽子性别 鉴定主要通过PCR 和翻肛鉴别，不太 适用于养殖户
鉴别方法比较
LAMP法
PCR法
翻肛鉴别
温度 时间 产物量 特异性 检测
试剂
二、原理
设计四条引物，包括两条内引 物和两条外引物，利用DNA链在 60-65℃的恒温条件下处于解链 和退火的动态平衡状态，在DNA 聚合酶的驱动下结合靶序列启 动DNA合成，反应中生成LAMP反 应特有的焦磷酸镁白色沉淀， 运用HNB指示剂显色反应。
二、流程
制作LAMP反应体系，12.5uL，如右图 放入200uL PCR管中，离心混匀 64℃水浴，90min
Web应用开发的黄金组合—LAMP
Zigbee是一种新兴的短距离、低速率无线网络技术，它是一种介于无线标记 技术和蓝牙之间的技术方案。它有自己的无线电标准，在数千个微小的传感
器之间相互协调实现通信。这些传感器只需要很少的能量以接力的方式通过 无线电波将数据从个传感器传到另一个传感器，所以它们的通信效率非常高。
第五章
5.1ZigBee介绍
第五章
5.1ZigBee介绍
5.1.2 ZigBee的应用
1. 智能家居
家里可能都有很多电器和电子设备，如电
灯、电视机、冰箱、洗衣机、电脑、空调等 等，可能还有烟雾感应、报警器和摄像头等 设备，以前我们最多可能就做到点对点的控 制，但如果使用了ZigBee技术，可以把这些 电子电器设备都联系起来，组成一个网络， 甚至可以通过网关连接到Internet，这样用户 就可以方便的在任何地方监控自己家里的情 况，并且省却了在家里布线的烦恼。工业控 制：工厂环境当中有大量的传感器和控制器， 可以利用ZigBee技术把它们连接成一个网络
送，发送的每个数据分组都必须等待接收方的确认消息，并进行确认信息
回复。若没有得到确认信息的回复就表示发生了冲突，将重传一次。采用
这种方法可以提高系统信息传送的可靠性。ZigBee为需要固定带宽的通信
业务预留了专用时隙，避免了发送数据时竞争和冲突。同时，ZigBee针对
时延敏感的应用做了优化，通信时延和休眠状态激活的时延都非常短。
PART 02
Apache服务器
第五章
5.1ZigBee介绍
5.1.1 什么是ZigBee
1. ZigBee简介
其特点是近距离、低复杂度、自组织、低功耗、低数据速率。主要适合
用于自动控制和远程控制领域，可以嵌入各种设备。简而言之，ZigBee就是 一种便宜的，低功耗的近距离无线组网通讯技术。ZigBee是一种低速短距离 传输的无线网络协议。ZigBee协议从下到上分别为物理层(PHY)、媒体访问控 制层(MAC)、传输层(TL)、网络层(NWK)、应用层(APL)等。其中物理层和媒 体访问控制层遵循IEEE 802.15.4标准的规定。
器之间相互协调实现通信。这些传感器只需要很少的能量以接力的方式通过 无线电波将数据从个传感器传到另一个传感器，所以它们的通信效率非常高。
第五章
5.1ZigBee介绍
第五章
5.1ZigBee介绍
5.1.2 ZigBee的应用
1. 智能家居
家里可能都有很多电器和电子设备，如电
灯、电视机、冰箱、洗衣机、电脑、空调等 等，可能还有烟雾感应、报警器和摄像头等 设备，以前我们最多可能就做到点对点的控 制，但如果使用了ZigBee技术，可以把这些 电子电器设备都联系起来，组成一个网络， 甚至可以通过网关连接到Internet，这样用户 就可以方便的在任何地方监控自己家里的情 况，并且省却了在家里布线的烦恼。工业控 制：工厂环境当中有大量的传感器和控制器， 可以利用ZigBee技术把它们连接成一个网络
送，发送的每个数据分组都必须等待接收方的确认消息，并进行确认信息
回复。若没有得到确认信息的回复就表示发生了冲突，将重传一次。采用
这种方法可以提高系统信息传送的可靠性。ZigBee为需要固定带宽的通信
业务预留了专用时隙，避免了发送数据时竞争和冲突。同时，ZigBee针对
时延敏感的应用做了优化，通信时延和休眠状态激活的时延都非常短。
PART 02
Apache服务器
第五章
5.1ZigBee介绍
5.1.1 什么是ZigBee
1. ZigBee简介
其特点是近距离、低复杂度、自组织、低功耗、低数据速率。主要适合
用于自动控制和远程控制领域，可以嵌入各种设备。简而言之，ZigBee就是 一种便宜的，低功耗的近距离无线组网通讯技术。ZigBee是一种低速短距离 传输的无线网络协议。ZigBee协议从下到上分别为物理层(PHY)、媒体访问控 制层(MAC)、传输层(TL)、网络层(NWK)、应用层(APL)等。其中物理层和媒 体访问控制层遵循IEEE 802.15.4标准的规定。
LAMP技术
•
例如：寡核苷酸的浓度为0.1µmol，钠离子的浓度是50mM,镁离子的浓度4 mM等。
•
Tm(退火温度=△h*1000/[△S+Rln(C/4)]-273.15+16.6log[Na+] 式中，Tm为退火温度，℃；为摩尔气体常数，1.
ห้องสมุดไป่ตู้
• 3 LAMP的特点 • LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： • (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，
产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应 体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。 • (2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成 • 的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情 况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应 用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。 • (3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域 与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 • (4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
基因的B3c区域互补。
•2．扩增原理
• 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此 温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不 停地自我循环。扩增分两个阶段。 • 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离， 变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作 用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链 （如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。 以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’ 末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循 环的起始结构。 • 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出 的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及 链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产 物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置 换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为 扩增靶序列的交替反向重复序列。
LAMP,bDNA,NASBA技术原理与应用比较——北京蓝谱
BJLP
北京藍譜生物有限公司
常用反应体系
FIP,BIP: F3,B3: loopF,B: dNTP: Betaine: Tween20: (NH4)2SO4: MgSO4: KcL: Tris-Hcl(pH8.8): Bst : 40pmol 5pmol 20pmol 1.4mM 0.8M 0.1% 10mM 8mM 10mM 20mM 8U
◎ amplification △ additional step △ additional step △ additional step △ additional step ～ ◎ 15～ 60 min. △ ◎ 2～3 hrs △ △ 2～3 hrs △ △ 1～2 hrs △ △ 2～3 hrs △
BJLP
BJLP
二、NASBA技术原理与应用
北京藍譜生物有限公司
BJLP
北京藍譜生物有限公司
NASBA检测应用
BJLP
北京藍譜生物有限公司
NASBA检测技术特征
使用反转录酶,RNA酶H,T7RNA聚合酶进行循环 反应. 上游引物带有Ｔ７RNA聚合酶结合位点，下游引 物带有ＥＣＬ检测核苷酸序列，此外，还有一条 俘获探针用于固定扩增产物． 扩增产物是单链ＲＮＡ，后续操作较复杂． 连续等温反应,特殊仪器进行检测, 特异性强，灵 敏度高，但成本也非常高昂． 可与分子信标探针联合使用，进行单管实时荧光 检测．
有无扩增反应可在UV灯下观 有无扩增反应可在 灯下观 测颜色的变化 有无扩增反应可借助肉眼判断扩 增副产物焦磷酸镁存在与否来断 增副产物焦磷酸镁存在与否来断 定
不需要特殊的试剂或仪器
－
＋
－ 模板:PSA 模板
＋
模板: 模板 PSA 荧光剂: 荧光剂 Ethidium Bromide (0.5 ug/ml)
环介导等温扩增技术
延伸循环步骤
•
产物(10)和(10’)进入延伸循环步骤，分别
形成(11)和(11’)；内部引物又可以(11)和(11’)
作为模板，引导链置换DNA 的合成，使产物的序
列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些
具有不同茎长度茎环结构的DNA 和带有许多环的
折叠结构的DNA 的混合物。
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LAMP法实验室常规操作步骤
抽取、提纯样本DNA或RNA
环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
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优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。
• 缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在 进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应 后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因 可能不适合使用环介导等温扩增方法。
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应用
LAMP 技术因其快速、高效、特异、灵 敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄 生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领 域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境 监测、食源安全等领域，具有更为广阔的 发展应用前景。
• BIP
B1末端延伸至形成一个环状构造（F1末端即3’端游 离）；BIP 退火到茎环结构（8’）上，引导链置换DNA 合成反应，产生结构（9’）的产物；随后产物（9’）的 F1末端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物 (10’）和茎环结构（8），产物（ 8 ）开始新一轮的循环 扩增。
LAMP技术及应用
LMP技术与其他技术的结合应用
LMP技术与云 计算的结合： 提高数据处理 能力降低成本
LMP技术与大 数据技术的结 合：提高数据 分析能力挖掘
数据价值
LMP技术与人 工智能技术的 结合：提高智 能化水平实现
自动化运维
LMP技术与物 联网技术的结 合：实现设备 互联提高数据 采集和处理能
力
感谢观看
反应体系：接着需要准备反应体 系包括模板DN、引物、DN聚合 酶、dNTPs等。
反应过程：最后进行反应过程包 括变性、退火、延伸等步骤最终 得到扩增的DN片段。
输出：扩增的DN片段可以通过电 泳、荧光定量PCR等方法进行检 测和定量。
LMP技术的优点
开源：LMP技术是开源的用户可 以自由使用和修改
LMP技术的组成
Linux操作系统：提供稳定的运 行环境
pche Web服务器：提供网页 服务
MySQL数据库：存储和管理数 据
PHP编程语言：实现动态网页 和后端逻辑
LMP技术的应用场景
网站开发：LMP技术广泛应用于网站开发包括企业网站、电子商务网 站、社区论坛等。
应用程序开发：LMP技术可以用于开发各种应用程序如ERP、CRM、 O等。
LMP技术的新研究方向
云计算：LMP技术在云计算中的应用和优化 大数据：LMP技术在大数据存储和处理中的应用 物联网：LMP技术在物联网设备管理和数据分析中的应用 人工智能：LMP技术在人工智能算法和模型训练中的应用
LMP技术在未来的应用前景
云计算：LMP技术在云计算中的应用将更加广泛为云计算提供强大的支持。 大数据：LMP技术在大数据中的应用将更加深入为处理和分析大数据提供强大的支持。 物联网：LMP技术在物联网中的应用将更加广泛为物联网提供强大的支持。 人工智能：LMP技术在人工智能中的应用将更加深入为开发更加智能的应用提供强大的支持。
LAMP环介导等温扩增法技术临床应用
LAMP环介导等温扩 增法技术临床应用
目录
LAMP LAMP LAMP
壹
术 原 理
环 介 导 等 温 扩 增 法 技
贰
术 临 床 应环 用介
导 等 温 扩 增 法 技
叁
术 发 展 前环 景介
导 等 温 扩 增 法 技
1
LAMP环介导等温 扩增法技术原理
工作原理
利用环介导等温扩 增技术，在恒温条 件下进行核酸扩增
技术改进方向
提高反应灵敏度 提高扩增产物的特异性 提高自动化程度
降低反应时间 降低成本和操作难度 拓展应用领域
应用领域拓展
病原体检测：快速、 准确检测病原体，
提高诊断效率
环境监测：应用于 环境监测，提高环 境监测效率和准确
性
基因编辑：应用于 基因编辑技术，提 高基因编辑效率和
安全性
食品安全检测：应 用于食品安全检测， 提高食品安全检测
02
优势：快速、简便、 灵敏度高
03
应用范围：呼吸道感 染、消化道感染、血 液感染等病原体检测
基因突变检测
1
原理：利用LAMP环介导等 温扩增法技术，对基因突变
进行检测
2
应用范围：肿瘤、遗传病、 传染病等疾病的基因突变检
测
3
优势：操作简便，快速高效， 成本低廉，结果准确
4
局限性：对基因突变类型有 一定限制，需要针对不同基
特异性强：针对特定基因序列 设计引物，避免非特异性扩增
结果直观：扩增产物可直接通 过凝胶电泳或荧光定量PCR检 测
2
LAMP环介导等温 扩增法技术临床应 用
病原体检测
01
原理：利用LAMP环 介导等温扩增法技术，
目录
LAMP LAMP LAMP
壹
术 原 理
环 介 导 等 温 扩 增 法 技
贰
术 临 床 应环 用介
导 等 温 扩 增 法 技
叁
术 发 展 前环 景介
导 等 温 扩 增 法 技
1
LAMP环介导等温 扩增法技术原理
工作原理
利用环介导等温扩 增技术，在恒温条 件下进行核酸扩增
技术改进方向
提高反应灵敏度 提高扩增产物的特异性 提高自动化程度
降低反应时间 降低成本和操作难度 拓展应用领域
应用领域拓展
病原体检测：快速、 准确检测病原体，
提高诊断效率
环境监测：应用于 环境监测，提高环 境监测效率和准确
性
基因编辑：应用于 基因编辑技术，提 高基因编辑效率和
安全性
食品安全检测：应 用于食品安全检测， 提高食品安全检测
02
优势：快速、简便、 灵敏度高
03
应用范围：呼吸道感 染、消化道感染、血 液感染等病原体检测
基因突变检测
1
原理：利用LAMP环介导等 温扩增法技术，对基因突变
进行检测
2
应用范围：肿瘤、遗传病、 传染病等疾病的基因突变检
测
3
优势：操作简便，快速高效， 成本低廉，结果准确
4
局限性：对基因突变类型有 一定限制，需要针对不同基
特异性强：针对特定基因序列 设计引物，避免非特异性扩增
结果直观：扩增产物可直接通 过凝胶电泳或荧光定量PCR检 测
2
LAMP环介导等温 扩增法技术临床应 用
病原体检测
01
原理：利用LAMP环 介导等温扩增法技术，
LAMP技术及应用
琼脂糖凝胶电泳法
由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组 成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。（图A）
肉眼观察法
在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色 沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。 LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
LAMP法的引物设计
LAMP法的原理
LAMP法的原理
LAMP法所需的试剂
LAMP法常规操作步骤
LAMP法的检测方法
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本， 长远来说，更有利于避免耐药性的产生。 gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进 化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。
LAMP法和其他PCR法的比较
LAMP法和其他PCR法的比较
技术特点
特异性高 4条引物靶向目标基因6个区段，特异性高于PCR和qPCR 灵敏度高 扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。 检测时间短 恒温扩增，省却温度循环，扩增时间60min。 设备简易，可同时检测多批样本 不需特定或高端检测仪器，恒温设备即可，例如水浴锅， 可以随时放入后续批次样本。
由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组 成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。（图A）
肉眼观察法
在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色 沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。 LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
LAMP法的引物设计
LAMP法的原理
LAMP法的原理
LAMP法所需的试剂
LAMP法常规操作步骤
LAMP法的检测方法
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本， 长远来说，更有利于避免耐药性的产生。 gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进 化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。
LAMP法和其他PCR法的比较
LAMP法和其他PCR法的比较
技术特点
特异性高 4条引物靶向目标基因6个区段，特异性高于PCR和qPCR 灵敏度高 扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。 检测时间短 恒温扩增，省却温度循环，扩增时间60min。 设备简易，可同时检测多批样本 不需特定或高端检测仪器，恒温设备即可，例如水浴锅， 可以随时放入后续批次样本。
LAMP技术对猪呼吸道主要病原诊断
20
猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立
猪胸膜肺炎放线杆菌特异性检测 M12 3 4
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
特异性检验电泳结果 1：阴性对照；2：肺炎双球菌3：副猪嗜血杆菌；4：猪胸膜肺炎放线杆菌
21
猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立
从结果中表明可以成功建立了肺炎支原体、放线杆菌和巴氏杆菌的LAMP诊 断方法，为我们国家临床上诊断支原体肺炎、放线杆菌和巴氏杆菌提供了灵敏有 效的分子生物学的方法 。
LAMP方法的现场应用及综合防治措施的制定
猪肺炎支原体的防制措施： （l）做好猪场环境卫生工作：定期对猪场内进行卫生清扫和消毒工作。采取自
2.10：阳性对照；7：阴性对照
17
猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立
优化后建立 LAMP 检测方法
LAMP 扩增反应体系
组成
外引物（支F3、支R3）（10 pmol/μL） 内引物（支F1/F2、支R1/R2）（10 pmol/μL） dNTP＋（10 mmol/L） MgSO4（25 mmol/L） 10×LAMP反应缓冲液 Bst DNA 聚合酶（8 U/μL） 模板DNA
dNTP+不同浓度下电泳结果 1-4 的浓度：0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L；
5：阳性对照；6-7：阴性对照
15
猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立
Bst DNA 聚合酶用量的优化
M12 345 67M
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
1
研究意义
猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立
猪胸膜肺炎放线杆菌特异性检测 M12 3 4
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
特异性检验电泳结果 1：阴性对照；2：肺炎双球菌3：副猪嗜血杆菌；4：猪胸膜肺炎放线杆菌
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猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立
从结果中表明可以成功建立了肺炎支原体、放线杆菌和巴氏杆菌的LAMP诊 断方法，为我们国家临床上诊断支原体肺炎、放线杆菌和巴氏杆菌提供了灵敏有 效的分子生物学的方法 。
LAMP方法的现场应用及综合防治措施的制定
猪肺炎支原体的防制措施： （l）做好猪场环境卫生工作：定期对猪场内进行卫生清扫和消毒工作。采取自
2.10：阳性对照；7：阴性对照
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猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立
优化后建立 LAMP 检测方法
LAMP 扩增反应体系
组成
外引物（支F3、支R3）（10 pmol/μL） 内引物（支F1/F2、支R1/R2）（10 pmol/μL） dNTP＋（10 mmol/L） MgSO4（25 mmol/L） 10×LAMP反应缓冲液 Bst DNA 聚合酶（8 U/μL） 模板DNA
dNTP+不同浓度下电泳结果 1-4 的浓度：0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L；
5：阳性对照；6-7：阴性对照
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猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立
Bst DNA 聚合酶用量的优化
M12 345 67M
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
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研究意义
LAMP技术剖析
• • •
3 LAMP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可， 产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应 体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。 (2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成 的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情 况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应 用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。 (3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域 与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 (4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
•2.引物的Trn值
• 引物的Tm值采用近邻分析法(the nearest-neighbor method)来计算，这种方法是目前 认为计算值最接近真实值的一种方法。计算Tm值的时候会受到盐浓度(salt concentration), 寡核苷酸的浓度等实验条件的影响，所以最好是在确定的实验条件下来计算Tm值。
•2．扩增原理 • 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此 温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不 停地自我循环。扩增分两个阶段。 • 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离， 变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作 用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链 （如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。 以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’ 末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循 环的起始结构。 • 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出 的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及 链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产 物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置 换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为 扩增靶序列的交替反向重复序列。
LAMP、DISPLAY制程简介
※波長(Wave Length,WL) ※順向電壓(Forward Voltage,Vf) ※原Open,Short,Vf,Ir電性項目一並測試
晶片 擴晶 框晶 固晶 固檢 推力檢查
銀膠 解凍 攪拌
支架
金線
TPX模 裝模 清模 噴離模劑 預熱 灌膠
離模劑
膠 配膠 攪拌 抽氣
電鍍液/錫粒
入庫
烘烤
拉力檢查 銲線 插支架 烤短
烘烤
推力 檢查 鋁線
銲線
拉 力 檢 查
●測試
依PCB腳位進 行電性測試與 光學特性檢驗。
18 17 16 15 14 13 12 11 10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
測試
●電性測試項目
※開路(Open)
※短路(Short) ※順向電壓(Forward Voltage,Vf) ※漏電流(Reverse Current,Ir )
壓蓋
烘烤
後測
蓋印碼
簡介結束
晶片
●框晶
將晶片膠帶 繃緊於框晶 環上，以利 固晶。
框晶環 黏晶膠帶
晶片
擴晶
框晶
●固晶(點銀膠)
膠量控制塊 銀膠(Silver Conductve Epoxy) 點 膠 頭 銀膠
支架 銀膠轉軸
支架
點銀膠
銀膠
解凍
攪拌
●固晶
吸 嘴 晶片
頂針 (Ejector)
晶片
固晶
固檢
烘烤
推力 檢查
●銲線(Ball Bond)
1E 1D 1C 1DP 2E
2D 2G 2C 2DP
後測
●電性測試項目
《LAMP原理及应用》幻灯片
只能有两种结果：扩增和不扩增 靶序列长度控制在300bp以下 灵敏度
三、影响LAMP扩增的因素
1、引物设计 2、模板DNA大小与浓度 3、DNA聚合酶 4、缓冲液
四、LAMP扩增的应用前景
《LAMP原理及应用》幻 灯片
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一、扩增原理
1、引物的设计
2、起始结构的扩增
启动链置换DNA合成
置换先头FIP引物合成的DNA链，并合成自身DNA
FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链
被置换的单链DNA两端存在互补序列 该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构
3பைடு நூலகம்LAMP法基因扩增循环
在 同 一 条 链 上 互 补 序 列， 周 而 复 始 形 成 大 小 不 一 的 结 构。
二、LAMP法的特点
1、设备、步骤简单 2、高特异性 3、快速、高效扩增 4、灵敏度较高
5、鉴定简便
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LAMP技术
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•
例如：寡核苷酸的浓度为0.1µmol，钠离子的浓度是50mM,镁离子[△S+Rln(C/4)]-273.15+16.6log[Na+] 式中，Tm为退火温度，℃；为摩尔气体常数，1.
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• 缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。>500 bp则较难 扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。 故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统 的PCR方法。
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• 4 引物设计实例 • LAMP引物设计的在线网站()，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。 • 以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程： • 首先，单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于2 2 kbp。支持三个
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•在进行LAMEP引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑： •1.引物之间的距离 • F2区段的5’端到B2区段的5’端(LAMP反应扩增的区域)之间的距离建议是120~180bp。 F3区段的3’端到F2区段的5’端之间的距离是0~20bp(同理B2和B3之间的距离是0~20bp)。 F2区段的5’端到F1区段的5f端(形成环的部分)之间的距离是40~60bp。 •2.引物的Trn值 • 引物的Tm值采用近邻分析法(the nearest-neighbor method)来计算，这种方法是目前 认为计算值最接近真实值的一种方法。计算Tm值的时候会受到盐浓度(salt concentration), 寡核苷酸的浓度等实验条件的影响，所以最好是在确定的实验条件下来计算Tm值。
LAMP 技术
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• 1．LAMP引物的设计 • LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’端的
F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 • FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2
基因的B3c区域互补。
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•2．扩增原理
• 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此 温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不 停地自我循环。扩增分两个阶段。 • 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离， 变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作 用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链 （如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。 以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’ 末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循 环的起始结构。 • 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出 的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及 链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产 物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置 换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为 扩增靶序列的交替反向重复序列。
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• 3 LAMP的特点 • LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： • (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，
产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应 体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。 • (2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成 • 的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情 况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应 用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。 • (3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域 与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 • (4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
类型的文件，普通文本格式（仅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。 • 第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。基于GC含量的自
动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT丰度高的区,如 果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。 • 设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构 的形成，Tm值等因素可以通过Pimer Explore)(一种专门设计LAMP引物的软件)来设计 LAMP反应的引物。
区与靶基因3’端的F2c区域互补F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 • F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基
因的F3c区域互补。 • BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，
B2区与靶基因3’ 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 • B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶