LAMP环介导等温扩增法技术临床应用PPT课件
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已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫) LAMP技术因其特异、敏感、简便、快捷、检测方式对
实验室基础设施、设备的要求较少，逐步用于结核分 枝杆菌诊断鉴别中
世界卫生组织于2016年8月11日，在日内瓦发布了一份 最新的推荐书，推荐发展中国家的基础医疗单位使用 该方法，可以作为痰涂片检测方法的替代方案
2020年5月18日星期一
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
➢ gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进 化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
➢ 临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。
“十三五”规划要求逐步推广的新诊断技术
县区级
检测结核分枝杆菌
环介导等温扩增 多色巢氏荧光PCR法
交叉引物发 RNA等温扩增法等
地市级
省、自治区
结核分枝杆菌及是否对 利福平和异烟肼耐药 基因芯片 溶解曲线 线性探针
检测结核分枝杆菌 检测是否对利福平和异
烟肼耐药
LAMP技术的原理
对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链 置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合
2020年5月18日星期一
LAMP法常规操作步骤
2020年5月18日星期一
LAMP法的检测方法
➢ 琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组
成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。（图A）
2020年5月18日星期一
LAMP法的原理
2020年5月18日星期一
LAMP技术特点
灵敏度高 特异性强 速度快
设备简单
LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数，扩 增模板可低至每测试10拷贝或更少。
通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合 来产生扩增效应,因此能获得比PCR更高的特异性。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较
2020年5月18日星期一
痰标本目测法检测流程
100分钟
一、样品处理
1、用2~3倍体积的4%NaOH溶液消化痰液 2、吸取1mL痰液液化液加入无菌1.5mL离心管中
一、样品处理 2、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果
➢ 阳性一致率=88.56% ➢ 阴性一致率=93.06% ➢ 总符合率=91.36%
2020Leabharlann Baidu5月18日星期一
WHO 认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测。在 已有肺结核症状的检测者中进行对比，TB-LAMP法比 痰涂片检测法多检出15%的患者。对比WHO近年推荐 的其它快速检测法，如果把TB-LAMP法用于对痰涂片 检测阴性患者的复查，TB-LAMP法检出率要高40%。
➢ 肉眼观察法 在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色
沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
➢ 通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所
以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行 染色，来检测扩增是否发生。（图C）
2020年5月18日星期一
LAMP法和其他PCR法的比较
2020年5月18日星期一
LAMP法所需的试剂
2020年5月18日星期一
LAMP技术简介
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外 等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约 65℃）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的 热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连 续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相 比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。
成，从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
➢ 扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。 ➢ LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
2020年5月18日星期一
LAMP法的引物设计
2020年5月18日星期一
LAMP法的原理
恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化的耗时,省 却温度循环，在30min～60min内即可完成反应 过程。
只需一个简单的恒温器,不需要昂贵的PCR仪。
产物检测便捷
在合成DNA的同时产生的大量焦磷酸根离子,与 镁
离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，从而能定性 判断LAMP反应；可与荧光物质结合。
LAMP法和其他PCR法的比较
➢ 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本， 长远来说，更有利于避免耐药性的产生。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用 技术特点：
➢ 适宜的检测对象 以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测 对象，可避免假阳性过高。
➢ 反应管预装反应体系 扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶 污染；用户操作简便、减少操作误差。
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LAMP环介导等温扩增法技术临床应用
医者人之司命，如大将提兵，必谋定而后战。
开始啦！请将手机调成静音，如有疑问可以随时打断我！
LAMP技术
环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一种在恒定温度下实现核酸 的指数级扩增的技术
➢ 结果易读 产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果
➢ 灵敏度＝89.54% ➢ 特异性＝98.93% ➢ 总符合率＝95.31%
阳性结果预期值＝98.13% 阴性结果预期值＝93.77%
实验室基础设施、设备的要求较少，逐步用于结核分 枝杆菌诊断鉴别中
世界卫生组织于2016年8月11日，在日内瓦发布了一份 最新的推荐书，推荐发展中国家的基础医疗单位使用 该方法，可以作为痰涂片检测方法的替代方案
2020年5月18日星期一
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
➢ gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进 化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
➢ 临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。
“十三五”规划要求逐步推广的新诊断技术
县区级
检测结核分枝杆菌
环介导等温扩增 多色巢氏荧光PCR法
交叉引物发 RNA等温扩增法等
地市级
省、自治区
结核分枝杆菌及是否对 利福平和异烟肼耐药 基因芯片 溶解曲线 线性探针
检测结核分枝杆菌 检测是否对利福平和异
烟肼耐药
LAMP技术的原理
对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链 置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合
2020年5月18日星期一
LAMP法常规操作步骤
2020年5月18日星期一
LAMP法的检测方法
➢ 琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组
成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。（图A）
2020年5月18日星期一
LAMP法的原理
2020年5月18日星期一
LAMP技术特点
灵敏度高 特异性强 速度快
设备简单
LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数，扩 增模板可低至每测试10拷贝或更少。
通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合 来产生扩增效应,因此能获得比PCR更高的特异性。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较
2020年5月18日星期一
痰标本目测法检测流程
100分钟
一、样品处理
1、用2~3倍体积的4%NaOH溶液消化痰液 2、吸取1mL痰液液化液加入无菌1.5mL离心管中
一、样品处理 2、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果
➢ 阳性一致率=88.56% ➢ 阴性一致率=93.06% ➢ 总符合率=91.36%
2020Leabharlann Baidu5月18日星期一
WHO 认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测。在 已有肺结核症状的检测者中进行对比，TB-LAMP法比 痰涂片检测法多检出15%的患者。对比WHO近年推荐 的其它快速检测法，如果把TB-LAMP法用于对痰涂片 检测阴性患者的复查，TB-LAMP法检出率要高40%。
➢ 肉眼观察法 在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色
沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
➢ 通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所
以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行 染色，来检测扩增是否发生。（图C）
2020年5月18日星期一
LAMP法和其他PCR法的比较
2020年5月18日星期一
LAMP法所需的试剂
2020年5月18日星期一
LAMP技术简介
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外 等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约 65℃）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的 热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连 续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相 比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。
成，从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
➢ 扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。 ➢ LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
2020年5月18日星期一
LAMP法的引物设计
2020年5月18日星期一
LAMP法的原理
恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化的耗时,省 却温度循环，在30min～60min内即可完成反应 过程。
只需一个简单的恒温器,不需要昂贵的PCR仪。
产物检测便捷
在合成DNA的同时产生的大量焦磷酸根离子,与 镁
离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，从而能定性 判断LAMP反应；可与荧光物质结合。
LAMP法和其他PCR法的比较
➢ 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本， 长远来说，更有利于避免耐药性的产生。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用 技术特点：
➢ 适宜的检测对象 以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测 对象，可避免假阳性过高。
➢ 反应管预装反应体系 扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶 污染；用户操作简便、减少操作误差。
此PPT下载后可自行编辑修改
LAMP环介导等温扩增法技术临床应用
医者人之司命，如大将提兵，必谋定而后战。
开始啦！请将手机调成静音，如有疑问可以随时打断我！
LAMP技术
环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一种在恒定温度下实现核酸 的指数级扩增的技术
➢ 结果易读 产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果
➢ 灵敏度＝89.54% ➢ 特异性＝98.93% ➢ 总符合率＝95.31%
阳性结果预期值＝98.13% 阴性结果预期值＝93.77%