LAMP环介导等温扩增法技术临床应用PPT课件
LAMP技术 PPT
动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT丰度高的区,如 果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。 • 设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构 的形成，Tm值等因素可以通过Pimer Explore)(一种专门设计LAMP引物的软件)来设计 LAMP反应的引物。
LAMP技术
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• 利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷 酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核 苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处 终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调 整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终 止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处 理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。DNA的复制需要：DNA聚合 酶，双链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、 dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引 物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP），因它在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸 二酯键。如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况 下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5'-引物端和 以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信 息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条 件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。将 制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中 的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱 即可直接读得DNA的碱基序列。与DNA复制不同的是sanger测序中的引物是单引物或 者是单链
第8章环介导等温扩增
扩增分两个阶段
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另 一条链就会解离，变成单链。
扩增分两个阶段
上游内部引物FIP的F2 序列首先与模板F2c结合 （如图B所示），在链置 换型DNA聚合酶的作用下 向前延伸启动链置换合成 。
扩增分两个阶段
外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的 FIP连接的互补单链（如图 C所示）。FIP上的F1c与 此单链上的Fl为互补结构 。自我碱基配对形成环状 结构（如图C所示）。
F3引物：上游外部引 物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的 F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物 (Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’ 端的 B2c区域互补，B1C域与靶 基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物 (Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温 度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。 因此，DNA在此温度下合成是可能的。利 用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA 聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自 我循环。
结合。开始链置换合成，解离出的单链核 酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的 B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．
扩增分两个阶段
第2阶段是扩增循环阶段。 形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP
引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状 引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动 链置换合成，周而复始。
环介导等温扩增技术
谢谢欣赏！
采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检 测出阳性样品81份, GB/T 4789.10- 2003检测出阳性样品84 份,LAMP阳性检出率为96.43%。
图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果
M:DL2000 DNA Marker; 1:金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:沙门氏菌 CGMCC 111552; 3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ- 004; 5: ETEC: 44247 (6∶15∶16) ;6: EPEC: 44706 (111∶58∶- ) ; 7:荧光假单胞菌 CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819; 9:铜绿假单胞菌 ATCC27853;
散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、 测试片法、PCR 法等。
环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种 新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的 作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异 性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的 速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中, 如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合
测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间 短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄 球菌的新方法。
简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus
aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是 引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广 泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗 生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
环介导等温扩增技术原理ppt课件
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特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
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环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
形 成
基 础 结 构
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LAMP
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Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction.
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
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60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及
进行温度循环。
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针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。
LAMP
LAMP（环介导等温扩增）技术2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩增分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。
然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。
通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。
LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。
目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。
详见：/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=11. 优缺点介绍：LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。
环介导等温扩增
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列。
LAMP的特点：（1）特异性强。
LAMP能从仅相差1个核苷酸的基因标本中，找出相应的靶序列进行扩增。
（2）等温高效。
LAMP在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，而且受非靶序列的影响小。
与PCR相比，其检测极限更小，仅为几个拷贝。
（3）耗时短。
在1h内可把靶序列扩增至109倍。
（4）产物易检测。
（5）操作简便。
反应不需PCR仪和特殊试剂。
通过逆转录酶，LAMP即能进行RNA高效扩增。
LAMP因具有高特异性、高效率和快速反应的特点，可以大量扩增所需的靶序列，故被用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断。
LAMP和其他的核酸扩增技术相比，可以在等温条件下，快速、高效、高特异地扩增靶序列。
但是，其引物设计比传统的PCR复杂，而且因为其产物的独特性，为单链DNA的分离增加了难度。
所以，还需要研究出更加有效的分离方法，同时摸索LAMP反应的条件，从引物的长度与浓度、目的序列的大小、茎环结构的大小等方面进行优化，提高扩增效率和特异性。
环介导等温扩增技术
延伸循环步骤
•
产物(10)和(10’)进入延伸循环步骤，分别
形成(11)和(11’)；内部引物又可以(11)和(11’)
作为模板，引导链置换DNA 的合成，使产物的序
列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些
具有不同茎长度茎环结构的DNA 和带有许多环的
折叠结构的DNA 的混合物。
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LAMP法实验室常规操作步骤
抽取、提纯样本DNA或RNA
环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
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优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。
• 缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在 进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应 后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因 可能不适合使用环介导等温扩增方法。
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应用
LAMP 技术因其快速、高效、特异、灵 敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄 生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领 域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境 监测、食源安全等领域，具有更为广阔的 发展应用前景。
• BIP
B1末端延伸至形成一个环状构造（F1末端即3’端游 离）；BIP 退火到茎环结构（8’）上，引导链置换DNA 合成反应，产生结构（9’）的产物；随后产物（9’）的 F1末端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物 (10’）和茎环结构（8），产物（ 8 ）开始新一轮的循环 扩增。
LAMP环介导等温扩增法技术临床应用
目录
LAMP LAMP LAMP
壹
术 原 理
环 介 导 等 温 扩 增 法 技
贰
术 临 床 应环 用介
导 等 温 扩 增 法 技
叁
术 发 展 前环 景介
导 等 温 扩 增 法 技
1
LAMP环介导等温 扩增法技术原理
工作原理
利用环介导等温扩 增技术，在恒温条 件下进行核酸扩增
技术改进方向
提高反应灵敏度 提高扩增产物的特异性 提高自动化程度
降低反应时间 降低成本和操作难度 拓展应用领域
应用领域拓展
病原体检测：快速、 准确检测病原体，
提高诊断效率
环境监测：应用于 环境监测，提高环 境监测效率和准确
性
基因编辑：应用于 基因编辑技术，提 高基因编辑效率和
安全性
食品安全检测：应 用于食品安全检测， 提高食品安全检测
02
优势：快速、简便、 灵敏度高
03
应用范围：呼吸道感 染、消化道感染、血 液感染等病原体检测
基因突变检测
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原理：利用LAMP环介导等 温扩增法技术，对基因突变
进行检测
2
应用范围：肿瘤、遗传病、 传染病等疾病的基因突变检
测
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优势：操作简便，快速高效， 成本低廉，结果准确
4
局限性：对基因突变类型有 一定限制，需要针对不同基
特异性强：针对特定基因序列 设计引物，避免非特异性扩增
结果直观：扩增产物可直接通 过凝胶电泳或荧光定量PCR检 测
2
LAMP环介导等温 扩增法技术临床应 用
病原体检测
01
原理：利用LAMP环 介导等温扩增法技术，
核酸等温扩增ppt课件
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
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NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
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RPA的原理
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四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
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结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
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引物、探针设计
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LAMP的操作过程
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检测方法
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LAMP技术在病原体检测中的应 用
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LAMP技术小结
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LAMP技术的优点
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存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
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SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
LAMP技术及应用
由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组 成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。（图A）
肉眼观察法
在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色 沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。 LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
LAMP法的引物设计
LAMP法的原理
LAMP法的原理
LAMP法所需的试剂
LAMP法常规操作步骤
LAMP法的检测方法
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本， 长远来说，更有利于避免耐药性的产生。 gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进 化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。
LAMP法和其他PCR法的比较
LAMP法和其他PCR法的比较
技术特点
特异性高 4条引物靶向目标基因6个区段，特异性高于PCR和qPCR 灵敏度高 扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。 检测时间短 恒温扩增，省却温度循环，扩增时间60min。 设备简易，可同时检测多批样本 不需特定或高端检测仪器，恒温设备即可，例如水浴锅， 可以随时放入后续批次样本。
LAMP技术及应用PPT参考幻灯片
沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
➢ 通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所
以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行 染色，来检测扩增是否发生。（图C）
安徽省胸科医院&安徽省结防所
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LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果
➢ 阳性一致率=88.56% ➢ 阴性一致率=93.06% ➢ 总符合率=91.36%
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WHO 认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测。在 已有肺结核症状的检测者中进行对比，TB-LAMP法比 痰涂片检测法多检出15%的患者。对比WHO近年推荐 的其它快速检测法，如果把TB-LAMP法用于对痰涂片 检测阴性患者的复查，TB-LAMP法检出率要高40%。
➢ 结果易读 产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。
安徽省胸科医院&安徽省结防所
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LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果
➢ 灵敏度＝89.54% ➢ 特异性＝98.93% ➢ 总符合率＝95.31%
阳性结果预期值＝98.13% 阴性结果预期值＝93.77%
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LAMP法的引物设计
安徽省胸科医院&安徽省结防所
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LAMP法的原理
安徽省胸科医院&安徽省结防所
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LAMP法的原理
安徽省胸科医院&安徽省结防所
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LAMP技术特点
环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用
㊃综 述㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2024.07.031环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用*廖 川1,梁丽娜1,黄少宇2,马梦霞3,李雪斌4综述,韦贵将1ә审校1.右江民族医学院附属医院医学检验中心/广西高校高发病临床分子诊断研究重点实验室/百色市高发病临床分子诊断与研发重点实验室,广西百色533000;2.广西壮族自治区田东县人民医院医学检验科,广西百色533000;3.右江民族医学院医学检验学院,广西百色533000;4.右江民族医学院附属医院神经内科,广西百色533000摘 要:病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速㊁准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义㊂环介导等温扩增(L AM P )是一种恒温扩增方法,具有反应时间短㊁操作简便㊁灵敏度高㊁特异度高㊁检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断㊂基于这种情况,该文主要阐述了L AM P 的原理㊁特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展㊂L AM P 技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性㊁引物设计复杂等不足之处㊂该文综述了近年来L AM P 技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向㊂关键词:环介导等温扩增技术; 核酸检测; 病原微生物; 核酸扩增; 结核分枝杆菌中图法分类号:R 446.5文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)07-1003-06A p p l i c a t i o n o f l o o p -m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t e c h n i qu e i n p a t h o g e n i c m i c r o o r ga n i s m s c l i n i c a l d e t e c t i o n *L I A O C h u a n 1,L I A N G L i n a 1,HU A N G S h a o y u 2,MA M e n g x i a 3,L I X u e b i n 4,WE I G u i j i a n g1ә1.M e d i c a l L a b o r a t o r y C e n t e r ,A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Y o u j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y fo r N a t i o n a l i t i e s /K e y L a b o r a t o r y o f C l i n i c a l M o l e c u l a r D i a g n o s i s a n d R e s e a r c h f o r H i gh I n c i d e n c e D i s e a s e s i n G u a n g x i U n i v e r s i t i e s /B a i s e K e y L a b o r a t o r y o f C l i n i c a l M o l e c u l a r D i a gn o s i s ,R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t f o r H i g h I n c i d e n c e D i s e a s e s ,B a i s e ,G u a n g x i 533000,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f M e d i c a l L a b o r a t o r y ,T i a n d o n g C o u n t y P e o p l e 's H o s p i t a l o f G u a n g x i Z h u a n g A u t o n o m o u s R e g i o n ,B a i s e ,G u a n g x i 533000,C h i n a ;3.S c h o o l o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e ,Y o u j i a n g Me d i c a l U n i v e r s i t yf o r N a t i o n a l i t i e s ,B a i s e ,G u a ng x i 533000,Chi n a ;4.D e p a r t m e n t o f N e u r o l o g y ,A f fi l i a t e d H o s p i t a l o f Y o u j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y f o r N a t i o n a l i t i e s ,B a i s e ,G u a n gx i 533000,C h i n a A b s t r a c t :P a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s a r e o n e o f t h e i m p o r t a n t f a c t o r s t h r e a t e n i n g h u m a n h e a l t h .R a pi d a n d a c c u r a t e d e t e c t i o n m e t h o d s a r e o f g r e a t s i g n i f i c a n c e f o r t h e d i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s .L o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n (L AM P )i s o n e o f t h e i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o d s ,w h i c h h a s t h e a d v a n t a ge s of s h o r t r e a c t i o n t i m e ,s i m p l e o p e r a t i o n ,h igh s e n si t i v i t y ,h i g h s p e c i f i c i t y a n d l o w c o s t ,s o i t i s w i d e l y us e d i n t h e r a p i d d i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s .B a s e d o n t h i s s i t u a t i o n ,t h i s p a p e r m a i n l y e l a b o r a t e s t h e p r i n c i pl e a n d c h a r a c t e r i s t i c s o f L AM P a n d i t s a p p l i c a t i o n a n d r e s e a r c h p r o g r e s s i n t h e d e t e c t i o n o f c o mm o n p a t h o g e n i c m i -c r o o r g a n i s m s i n c l i n i c .L AM P t e c h n o l o g y h a s b e e n a p p l i e d t o t h e d e t e c t i o n o f p a t h o g e n i c m i c r o o r ga n i s m s w i t h h i g h s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y ,b u t t h i s t ec h n o l o g y i s s t i l l p r o n e t o p r od u cef a l s e p o s i t i v e ,c o m p l e x p r i m e r d e -s ig n a n d o th e r s h o r t c o mi n g s .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e a p p l i c a t i o n a n d p r o g r e s s o f L AM P t e c h n o l o g y in p a t h o -g e n i c m i c r o b i a l i n f e c t i o n i n r e c e n t y e a r s ,a n d o u t l o o k s i t s f u t u r e d e v e l o p m e n t p r o s pe c t i n o r d e r t o p r o v i d e a r e a s o n a b l e r e s e a r c h d i r e c t i o nf o r t h e r a p i d d i ag n o s i s o f p a th o ge n i c m i c r o b i a l i nf e c t i o n i n t h e e n v i r o n m e n t w i t h l i m i t e d r e s o u r c e s .K e y w o r d s :l o o p -m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t e c h n i q u e ; n u c l e i c a c i d t e s t ; p a t h o g e n i c m i c r o o r -g a n i s m ; n u c l e i c a c i d a m p l i f i c a t i o n ; m yc o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s ㊃3001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n ,A pr i l 2024,V o l .21,N o .7*基金项目:国家自然科学基金项目(82260418,82060570);右江民族医学院附属医院高层次人才项目(R 202011701);广西壮族自治区百色市科学研究与技术开发计划项目(百科20232031)㊂ә通信作者,E -m a i l :w e i g u i j i a n g2021@163.c o m ㊂病原微生物是指能够引起人和动物疾病的微小生物,对人类健康具有极大的威胁㊂临床上很多常见疾病都是病原微生物感染导致的,如各种病毒性肝炎㊁结核病㊁新型冠状病毒感染等,这类疾病通常都具有一定的传染性,有的甚至可以造成世界范围的大流行㊂因此,临床迫切需要一种能够准确㊁高效㊁快速㊁简便地识别相关病原体的检测方法㊂随着分子生物学研究的不断深入,核酸扩增技术在诊断领域的应用越来越广泛㊂其中最具代表性的是聚合酶链反应(P C R),它能在短时间内对靶标完成指数级扩增,且具有较高的灵敏度和特异度[1],因此很多病原微生物检测都将其作为诊断的参考标准㊂然而,P C R需要经历变温过程,对设备和操作者要求较高,从而导致其在欠发达地区和现场实施检测上的应用受到一定的限制㊂而等温扩增技术的出现就很好地解决了这一问题,该技术在恒定温度下即可完成扩增反应,摆脱了对高精密热循环仪的依赖,有望取代P C R在诊断领域的地位㊂环介导等温扩增(L AM P)是由日本荣研株式会社N O T OM I等[2]于2000年研发,是一种较为成熟的等温扩增法,具有高效㊁快速㊁灵敏度高㊁特异性度强等优点,因此被应用于医学领域中细菌㊁病毒㊁寄生虫的检测[3-4]㊂1 L AM P的反应原理与特点1.1 L AM P的反应原理 L AM P的扩增过程可以分为两个阶段,即起始阶段和扩增循环阶段[2],扩增完成后可与多种技术相结合实现扩增产物的检测,不同的技术有不同的检测原理,如试纸条法㊁荧光法等,本文主要讲述L AM P的扩增原理㊂在扩增的过程中需要引物的参与,和其他扩增方法不同的是,L AM P 需要设计2对引物,即内部引物(F I P/B I P)和外部引物(F3/B3),通过这两对引物对靶基因的6个不同区域(F1-F1c㊁F2-F2c㊁F3-F3c㊁B1-B1c㊁B2-B2c㊁B3-B3c)特异性识别,因此L AM P具有极强的特异性㊂在起始阶段,当温度达到60~65ħ时,双链D N A处于解旋与结合的不稳态,其中上游内部引物F I P中的F2序列区段首先与模板目标区段的单链D N A中的F2c结合,在B s t D N A聚合酶的作用下自F2的3'末端延伸启动链置换D N A合成㊂外引物F3则与模板F3c结合并延伸,置换出由F I P链接的互补单链D N A,此单链的F1c与F1区段为互补结构,可通过自我碱基配对形成环状结构㊂以上述步骤中合成的5'端以茎环状结构的单联D N A为模板,下游内部引物B I P的B2序列区段与单链D N A模板的B2c 结合,在B s t D N A聚合酶的作用下启动链置换反应,自B2的3'末端开始延伸合成D N A㊂外引物B3则与模板B3c结合并延伸,置换出由B I P链接的互补单链D N A,此单链的F1与F1c区段互补,B1c与B1区段互补,形成哑铃状结构的单链D N A㊂哑铃状结构以3'末端的F1区段为起点,以自身为模板进行D N A合成㊂由此,哑铃状结构转变为茎环状结构,L AM P扩增进入循环阶段㊂循环阶段以起始阶段形成的单链D N A为模板,在内部引物与B s t D N A聚合酶的作用下,反复进行延伸和链置换反应,最终产生大量具有多个靶标反向重复序列的茎环D N A结构[2]㊂1.2 L AM P的特点 L AM P不需要进行高温变性,整个过程在60~65ħ反应60m i n即可完成㊂与其他核酸扩增法相比,L AM P具有更高的特异性和抗干扰性,因为它是通过2对引物特异性识别靶基因上的6个不同区域来启动反应㊂此外,L AM P的灵敏度也很高,能够在短时间内扩增出1ˑ107~1ˑ1010数量级的产物,比常规P C R高100倍左右[5],有报道指出L AM P最低可检测10个基因拷贝或更低的检测限[6]㊂而且L AM P对设备要求不高,一般的水浴锅即可满足需求㊂因此,L AM P具有高效㊁灵敏度高㊁特异性强㊁简便等优点㊂当然,L AM P也有其不足之处:首先,L AM P反应需要2对引物参与,因此对引物设计要求较高,如果引物设计不合理,就可能产生非特异性扩增片段影响结果的正确性㊂其次,由于L AM P 的灵敏度很高,在反应过程中易产生气溶胶污染,导致假阳性结果㊂最后,由于L AM P的扩增产物是长短不一且含有大量茎环结构的D N A双链,因此很难对其扩增产物进行定量分析㊂2 L AM P技术在病原微生物临床检测中的应用目前,临床上对于病原微生物感染的诊断方法主要有培养法㊁血清学方法及P C R㊂但这些方法都有其不足之处:培养法耗时较长;血清学方法特异度不高,易产生假阳性结果;P C R对设备和实验环境要求较高㊂而L AM P因其具有灵敏度高㊁特异性强㊁操作简便等优点,有望取代传统技术在病原微生物检测中的地位㊂2.1 L AM P技术在新型冠状病毒检测中的应用新型冠状病毒感染者主要表现为发热㊁咳嗽,严重者会休克甚至死亡㊂虽然目前已经上市了大量的疫苗,但对新型冠状病毒快速㊁准确㊁高效地诊断仍然是疫情防控的关键㊂实时反转录P C R因具有特异性强㊁灵敏度高等优点,被视为诊断新型冠状病毒感染的金标准[7],但它耗时较长,而且对设备和操作人员的要求也较高,因此在资源匮乏地区和现场实时检测新型冠状病毒的应用方面受到一定的限制㊂L AM P作为一种恒温扩增法,不仅操作简便,而且其灵敏度不低于反转录P C R[8],因此L AM P可以作为反转录P C R的替代方法以弥补其不足之处㊂目前,已经有大量基于L AM P的试剂盒被用于新型冠状病毒的检测,E i k e n 公司开发的L o o p a m p T M新型冠状病毒检测试剂盒基于N基因和R d R p基因设计,通过测量反应体系浊度确定检测结果㊂为了评估L o o p a m p T M新型冠状病毒㊃4001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7检测试剂盒的有效性,Y A N等[9]用该试剂盒检测新型冠状病毒,并使用L A-200浊度计对扩增产物进行实时检测,结果表明该反应能够在35m i n内检测到水平为10c o p y/μL的R N A㊂HU A N G等[4]针对新型冠状病毒的O R F1a b㊁S㊁N基因,将比色法与L AM P结合用于检测新型冠状病毒,该方法仅需30 m i n即可完成检测,通过肉眼判读结果,无须精密仪器,且灵敏度可达80c o p y/μL㊂此外,L AM P还可以和荧光检测[10]㊁微流控[11]等技术结合用于检测新型冠状病毒㊂这些方法的建立为新型冠状病毒快速㊁准确㊁高效地检测提供了新的思路,也为疫情防控做出了重大贡献㊂2.2 L AM P技术在结核分枝杆菌检测中的应用结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌㊂2020年世界卫生组织(WHO)报告显示,我国结核感染人数位居世界第3位[12]㊂早期诊断并给予恰当的治疗是控制结核病传播的关键,因此,临床迫切需要寻找一种快速㊁准确㊁简单的检测方法㊂L AM P能在60~65ħ的条件下对结核分枝杆菌进行快速检测,1h即可完成试验[13]㊂贾枫等[14]通过临床试验对比了抗酸染色法㊁L AM P法和改良罗氏培养法检测痰标本中结核分枝杆菌的阳性率㊁灵敏度和特异度㊂结果表明L AM P法在结核分枝杆菌的诊断中具有快速㊁灵敏等优点㊂此外,L AM P对于一些罕见的肺外结核病的诊断也具有很高的价值㊂K H A N 等[15]以m p t64和p s t S1为靶点,建立了多靶点L AM P检测骨关节结核患者结核分枝杆菌的方法,结果表明多靶点L AM P在骨关节结核总病例中的灵敏度显著高于多重P C R和G e n e X p e r t㊂S H A R MA 等[16]采用I S6110和M P B64靶点对35例临床疑似胃肠道结核患者的回盲活检标本和30例非结核对照者的回盲活检标本进行结核分枝杆菌复合体L AM P检测㊂结果表明,L AM P检测胃肠道结核分枝杆菌的灵敏度明显高于I S6110P C R和培养法㊂此外,在结核病的诊断方面,仍有大量基于L AM P的新技术不断被开发出来㊂如将L AM P技术与基于纳米颗粒的侧流装置(L F D)[17]及微流控芯片[18]等技术的联合应用㊂由此可见L AM P在结核病的诊断发面也有广阔的前景㊂2.3 L AM P技术在沙门菌检测中的应用沙门菌是全球最主要的食源性致病菌㊂若误食含有沙门菌的食物可导致食物中毒,严重者会引发肠胃炎㊁败血症等症状,若不及时就医甚至会危及生命㊂因此该菌被世界卫生组织(WHO)列为具有中等乃至严重危害的食源性病原菌[19]㊂目前临床上主要通过传统的实验室方法在标本中检测沙门菌㊂但这些传统的实验室方法操作复杂㊁耗时较长,需要3d以上才能通过多个分析步骤获得结果㊂近年来,随着核酸检测技术的不断发展与完善,许多基于核酸扩增的技术已经被广泛使用,如P C R㊁实时P C R等,这些方法均能将检测时间缩短到3d以内[20]㊂其中P C R虽然灵敏度高,但需要配备训练有素的人员和复杂的热循环仪,这使得其难以在设备不足的实验室和资源匮乏的现场环境中应用㊂而L AM P作为一种新型的核酸扩增技术,在病原微生物的检测方面有其独特的优势㊂自2005年L AM P被应用于沙门菌的检测之后,已经开发出数十种基于L AM P的沙门菌检测方法,这给临床早期诊断沙门菌感染带来了新的希望㊂近年来,随着对L AM P技术的深入研究,大量的商业试剂盒被用于沙门菌的快速检测[21]㊂此外,还有一些基于L AM P的新技术被开发出来㊂试纸条作为一种简单㊁快速的检测方法,常与L AM P技术结合用于现场快速检测,朱传新等[22]建立了环介导核酸恒温扩增结合试纸条(L AM P-L F D)检测技术用于沙门菌的快速检测,30m i n内即可完成检测,其灵敏度与P C R相当,为10c o p y/μL㊂D R A Z等[23]将L AM P与酶联免疫吸附试验(E L I S A)联合用于检测沙门菌D型血清型菌株,检测灵敏度为1ˑ103C F U/m L,比P C R-E L I S A的灵敏度高10倍㊂D R A Z等[23]将L AM P与表面增强拉曼技术联合用于检测肠炎沙门菌,其灵敏度比常规P C R高10倍,达到了66C F U/m L㊂与P C R相比,L AM P不仅快速㊁简单,而且具有高灵敏度㊁高特异度等优点,因此, L AM P技术具有替代传统方法检测沙门菌的潜力㊂2.4 L AM P技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用金黄色葡萄球菌是一种常见的机会致病菌,当机体免疫力降低时,它可以迁移到其他组织或器官造成感染,严重者甚至出现菌血症,具有较高的致死率㊂目前临床上金黄色葡萄球菌的常规检测方法是微生物培养法,这种方法虽然具有较高的灵敏度和准确性,但检测过程烦琐㊁耗时较长[24]㊂很多患者因此错过了最佳治疗期㊂因此,开发一种快速㊁可靠的检测方法来检测金黄色葡萄球菌是临床上迫切需要的㊂近年来,越来越多的分子诊断技术被用于病原微生物的分类鉴定,与培养法相比,分子诊断技术具有快速㊁准确㊁灵敏等优点,常见的分子诊断技术有P C R㊁重组酶聚合酶扩增技术(R P A)㊁L AM P等㊂其中P C R在金黄色葡萄球菌的临床标本检测中具有较高的准确率[25],然而,由于需要昂贵的设备和熟练的操作人员,P C R在资源匮乏地区的应用受到一定的限制㊂L AM P作为一种恒温扩增法,无须昂贵的设备和复杂的操作步骤㊂WU等[3]开发了一种基于L AM P 的可视化检测法,通过使用比色指示剂羟基萘酚蓝目视检测金黄色葡萄球菌,结果表明L AM P的检测限为每反应8c o p y或每反应400C F U㊂与常规P C R相比,L AM P将检测限降低至1/10㊂邹作成等[26]也设㊃5001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7计了基于n u c基因的L AM P可视化检测法,该方法的检测限可达5.6ˑ101C F U/m L,其灵敏度比常规P C R高出10000倍㊂L I M等[27]以金黄色葡萄球菌的s p a和a r c C基因为靶标,将L AM P与P C R对比,结果表明二者的特异度㊁阳性预测值和阴性预测值完全一致,L AM P的检测限为2.5n g/μL或1ˑ102 C F U/m L,而P C R的检测限为12.5n g/μL或1ˑ103 C F U/m L㊂由此可见,在检测金黄色葡萄球菌方面,与P C R相比,L AM P不仅具有同样的特异度和准确率,而且检测时间更短,灵敏度更高㊂因此L AM P是一种很有前途的快速检测金黄色葡萄球菌的方法㊂2.5 L AM P技术在乙型肝炎病毒(H B V)检测中的应用 H B V是一种环状部分双链D N A病毒,主要通过血液传播,由于H B V感染早期没有任何症状,且感染者血液内缺乏乙型肝炎表面抗原,H B V-D N A含量较低,因此很难在早期检测到H B V感染㊂E L I S A和实时定量P C R是目前临床检测H B V最常用的方法[28],然而E L I S A诊断乙型肝炎的灵敏度非常低[29],实时定量P C R作为E L I S A的替代方法,其灵敏度较高,但它对实验设备和环境要求也很高[30],在资源不足的情况下很难满足,因此,需要开发出一种快速㊁灵敏㊁特异㊁易于使用的H B V检测方法㊂C H E N等[31]通过使用L AM P检测H B V,该方法可以不用提取D N A直接检测血液中的H B V,其灵敏度为每反应10c o p y,与P C R相当㊂C HE N等[32]设计了一种L AM P与基于纳米颗粒的LF D用于临床上H B V的检测,在60m i n内即可完成结果的读取,其灵敏度为每反应7.5I U㊂MA I T Y等[33]同样将L AM P与L F D结合用于检测H B V,结果表明H B V-L AM P-L F D法检测H B V的灵敏度为92%,特异度为100%,检测限低至500p g/μL㊂为了更好地评估L AM P对H B V诊断的准确性,C H E N等[34]通过检索E m b a s e㊁C o c h r a n e L i b r a r y和P u b M e d数据库中使用L AM P检测H B V的研究,然后使用Q U A D A S-2工具提取数据并评估文献质量,分析发现L AM P检测H B V的灵敏度和特异度分别为0.91和0.97,阳性似然比㊁阴性似然比㊁诊断优势比分别为16.93㊁0.08和397.57㊂由此可见,与P C R相比,L AM P是一种简便㊁快速㊁有效的检测H B V的方法㊂因此, L AM P可以取代其他方法用于临床诊断H B V感染㊂2.6 L AM P技术在华支睾吸虫检测中的应用华支睾吸虫又称肝吸虫,是临床上常见的一种人类寄生虫,主要流行于中国㊁韩国和越南等国家[35]㊂感染早期无明显症状,随着病情的发展,患者会出现腹部不适㊁黄疸㊁发热㊁呕吐和腹泻等,甚至可能引发癌变,因此华支睾吸虫被WHO的国际癌症研究机构归类为Ⅰ类生物致癌物[36]㊂华支睾吸虫的准确诊断对于患者的治疗极为重要,目前临床上主要通过涂片镜检法和血清学方法来诊断华支睾吸虫,但镜检法阳性率较低,因此轻度感染病例可能会被遗漏;而血清学方法又无法判断是既往感染还是现在感染[37]㊂虽然已经开发出了几种基于P C R的检测方法,但它们的灵敏度和特异度波动较大[38]㊂近年来,L AM P也被用于华支睾吸虫的检测,R A HMA N等[39]将L AM P用于检测从韩国的华支睾吸虫疫区采集的人粪便样品,并使用K a t o-K a t z 方法和实时P C R作为参考标准,L AM P测定显示灵敏度为97.1%(95%C I:90.1%~99.2%),特异度为100.0%(95%C I:92.9%~100.0%)㊂此外,朱海等[40]以华支睾吸虫I T S2基因为靶标成功建立了一种可用于检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的L AM P方法,该方法对华支睾吸虫成虫D N A的最低检出限可达到3.33ˑ10-4n g/μL,灵敏度和特异度与P C R法一致,均为100%,相对于P C R,L AM P不仅具有很高的灵敏度和特异度,而且操作更加简便㊁反应时间更短㊂因此,L AM P完全可以替代其他方法用于临床检测华支睾吸虫㊂3总结与展望3.1 L AM P的优势 L AM P是一种新型的恒温扩增技术,在模板㊁多条引物及链置换酶的参与下,无须温度循环即可快速完成扩增过程㊂与P C R相比, L AM P无须精密的控温装置,操作简便㊁快捷,更适用于资源条件有限的基层医院使用,在病原微生物的现场检测方面有非常广阔的前景㊂3.2 L AM P的不足近年来,L AM P技术发展迅速,但仍然面临着许多困难与挑战:(1)由于L AM P 技术灵敏度高,一旦开盖容易形成气溶胶污染,加上目前国内大多数实验室不能严格分区,假阳性问题比较严重,因此需要通过设置空白对照确定是否为假阳性,并且在实验过程中使用实时浊度仪,避免开盖导致的污染㊂(2)L AM P与其他恒温扩增法不同,它需要2对引物参与反应,因此引物设计比较复杂,有些疾病的靶基因可能不适合用L AM P方法检测㊂(3)由于L AM P技术发展时间较短,因此它的集成检测设备不够成熟㊁商品化应用有待加强㊂3.3未来展望随着L AM P技术的发展及其与多学科技术的联合创新,上述问题都将会得到解决㊂总之,L AM P技术作为一种新型核酸扩增检测技术,在现场快速检测和基层应用于诊断病原微生物感染的前景较广阔,但仍需要不断深入研究㊂参考文献[1]K E L L E R M,N A U E J,Z E N G E R L E R,e t a l.A u t o m a t e df o r e n s i c a n i m a l f a m i l y i d e n t i f i c a t i o n b y n e s t e d P C R a n dm e l t c u r v e a n a l y s i s o n a n o f f-t h e-s h e l f t h e r m o c y c l e r a u g-m e n t e d w i t h a c e n t r i f u g a l m i c r o f l u i d i c d i s k s e g m e n t[J].㊃6001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7P L o S O n e,2015,10(7):e0131845.[2]N O T OM I T,O K A Y AMA H,MA S U B U C H I H,e t a l.L o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n o f D N A[J].N u-c l e i c A c id s Re s,2000,28(12):e63.[3]WU C,Z E N G Y,H E Y.R a p i d v i s u a l i z a t i o n a n d d e t e c t i o n o f s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s b a s e d o n l o o p-m e d i a t e d i s o t h e r-m a l a m p l i f i c a t i o n[J].W o r l d J M i c r o b i o l B i o t e c h n o l, 2021,37(12):209.[4]HU A N G W E,L I M B,H S U C,e t a l.R T-L AM P f o r r a p i dd i a g n o s i s o f c o r o n a v i r u s S A R S-C o V-2[J].M i c r o b i o l B i o-te c h n o l,2020,13(4):950-961.[5]S E K I M,Y AMA S H I T A Y,T O R I G O E H,e t a l.L o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o d t a r g e t i n g t h e l y t A g e n e f o r d e t e c t i o n o f s t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e[J].JC l i n M i c r o b i o l,2005,43(4):1581-1586.[6]N Z E L U C O,K A T O H,P E T E R S N C,e t a l.L o o p-m e d i-a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P):a n a d v a n c e d m o-l e c u l a r p o i n t-o f-c a r e t e c h n i q u e f o r t h e d e t e c t i o n o f L e i s h-m a n i 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p i r a t o r yS y n d r o m e C o r o n a v i r u s2(S A R S-C o V-2)b y r e v e r s e t r a n-s c r i p t i o n-l o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n[J].P L o S O n e,2020,15(6):e0234682.[11]R O D R I G U E Z-MA T E O S P,N G AM S OM B,WA L T E RC,e t a l.A l a b-o n-a-c h i p p l a t f o r m f o r i n t e g r a t e d e x t r a c-t i o n a n d d e t e c t i o n o f S A R S-C o V-2R N A i n r e s o u r c e-l i m-i t e d s e t t i n g s[J].A n a l C h i m A c t a,2021,1177:338758.[12]C HA K A Y A J,K HA N M,N T O UM I F,e t a l.G l o b a l t u-b e rc u l o s i s r e p o r t2020-r e f l e c t i o n s o n t h e g l o b a l T B b u r-d e n,t r e a t m e n t a n d p r e v e n t i o n e f f o r t s[J].I n t J I n f e c t D i s,2021,113(S u p p l1):S7-S12.[13]丁运生,彭远远,徐东芳,等.抗酸染色涂片法㊁G e n e x p e r t法和L AM P法检测对结核性胸腔积液的诊断价值[J].医学临床研究,2020,37(5):772-774.[14]贾枫,叶海容,曾云龙,等.环介导等温扩增技术(L AM P)在肺结核诊断中的应用研究[J].实验与检验医学,2021, 39(05):1041-1043.[15]K HA N A,K AM R A E,S I N 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环介导的等温扩增法共27页PPT
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我扩增法
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
(完整)环介导等温扩增技术原理精品PPT资料精品PPT资料
环介导等温扩增核酸技术优势
LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的 缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续 快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。
操作简单：只需一个水浴锅
快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而 造成 的时间损失
特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区 域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异 性极高。
环单介引导 物等温扩增(SLoPoIAp-mediated isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶, 在A的新技术。
突变率低 焦F3磷引酸物酶：沉上淀游的外检部测引（物浊(F度or检wa测rd）O：ut在erLPAriMmPe反r)，应由过F程3区中组，成dN，TP并析与出靶的基焦因磷的酸F3根c离区子域与互反补应。溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸酶
方便诊断
等温扩增的种类
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
各类等温扩增技术的比较
温度 ℃ 引物
模板
NASBA 42
Principle of Loop-mediated isothermal amplification
环介导等温扩增技术原理
烟雨莫问
主要内容
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
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“十三五”规划要求逐步推广的新诊断技术
县区级
检测结核分枝杆菌
环介导等温扩增 多色巢氏荧光PCR法
交叉引物发 RNA等温扩增法等
地市级
省、自治区
结核分枝杆菌及是否对 利福平和异烟肼耐药 基因芯片 溶解曲线 线性探针
检测结核分枝杆菌 检测是否对利福平和异
烟肼耐药
LAMP技术的原理
对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链 置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合
➢ 肉眼观察法 在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色
沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
➢ 通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所
以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行 染色，来检测扩增是否发生。（图C）
2020年5月18日星期一
LAMP法常规操作步骤
2020年5月18日星期一
LAMP法的检测方法
➢ 琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组
成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。（图A）
2020年5月18日星期一
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
➢ gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进 化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
➢ 临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。
恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化的耗时,省 却温度循环，在30min～60min内即可完成反应 过程。
只需一个简单的恒温器,不需要昂贵的PCR仪。
产物检测便捷
在合成DNA的同时产生的大量焦磷酸根离子,与 镁
离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，从而能定性 判断LAMP反应；可与荧光物质结合。
LAMP法和其他PCR法的比较
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果
➢ 阳性一致率=88.56% ➢ 阴性一致率=93.06% ➢ 总符合率=91.36%
2020年5月18日星期一
WHO 认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测。在 已有肺结核症状的检测者中进行对比，TB-LAMP法比 痰涂片检测法多检出15%的患者。对比WHO近年推荐 的其它快速检测法，如果把TB-LAMP法用于对痰涂片 检测阴性患者的复查，TB-LAMP法检出率要高40%。
➢ 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本， 长远来说，更有利于避免耐药性的产生。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用 技术特点：
➢ 适宜的检测对象 以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测 对象，可避免假阳性过高。
➢ 反应管预装反应体系 扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶 污染；用户操作简便、减少操作误差。
2020年5月18日星期一
LAMP法和其他PCR法的比较
2020年5月18日星期一
LAMP法所需的试剂
2020年5月18日星期一
LAMP技术简介
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外 等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约 65℃）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的 热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连 续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相 比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较
2020年5月18日星期一痰标本目测法检测流程100分钟
一、样品处理
1、用2~3倍体积的4%NaOH溶液消化痰液 2、吸取1mL痰液液化液加入无菌1.5mL离心管中
一、样品处理 2、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清
➢ 结果易读 产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果
➢ 灵敏度＝89.54% ➢ 特异性＝98.93% ➢ 总符合率＝95.31%
阳性结果预期值＝98.13% 阴性结果预期值＝93.77%
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LAMP法的原理
2020年5月18日星期一
LAMP技术特点
灵敏度高 特异性强 速度快
设备简单
LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数，扩 增模板可低至每测试10拷贝或更少。
通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合 来产生扩增效应,因此能获得比PCR更高的特异性。
已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫) LAMP技术因其特异、敏感、简便、快捷、检测方式对
实验室基础设施、设备的要求较少，逐步用于结核分 枝杆菌诊断鉴别中
世界卫生组织于2016年8月11日，在日内瓦发布了一份 最新的推荐书，推荐发展中国家的基础医疗单位使用 该方法，可以作为痰涂片检测方法的替代方案
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LAMP环介导等温扩增法技术临床应用
医者人之司命，如大将提兵，必谋定而后战。
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LAMP技术
环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一种在恒定温度下实现核酸 的指数级扩增的技术
成，从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
➢ 扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。 ➢ LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
2020年5月18日星期一
LAMP法的引物设计
2020年5月18日星期一
LAMP法的原理