LAMP方法及其在病原微生物检测中的应用_吴禹熹

（西南民族大学生命科学与技术学院，成都 ６１００４１）
摘 要 ：环 介 导 等 温 扩 增 技 术 （ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）是 一 门 新 兴 的 分 子 生 物 学 技 术 ，该 技 术具有操作简单、不需要大型仪器设备、成本低廉、反应时间短、结果判定简单等 优 点，且 具 有 比 常 规 分 子 生 物 学 方 法更高的灵敏度和特异性。目前该技术 在 细 菌、病 毒 及 支 原 体 等 病 原 微 生 物 的 快 速 检 测 和 早 期 诊 断 中 已 广 泛 应 用。通过 对 国 内 外 ＬＡＭＰ 研 究 进 展 及 该 技 术 在 细 菌 、病 毒、支 原 体 等 致 病 菌 中 的 诊 断 应 用 进 行 综 述 ，以 期 介 绍 该 技 术 的 优 缺 点 和 应 用 现 状 ，从 而 为 今 后 的 广 泛 应 用 提 供 参 考 依 据 。 关 键 词 ：环 介 导 等 温 扩 增 技 术 ；致 病 菌 ；检 测 中图分类号：Ｓ８５２．６１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－７２３６（２０１６）０２－０３８９－０５
收 稿 日 期 ：２０１５－０８－１３ 基 金 项 目 ：西 南 民 族 大 学 ２０１４ 年 研 究 生 创 新 型 科 研 项 目 （ＣＸ２０１４ＳＺ９３） 作 者 简 介 ：吴 禹 熹 （１９９０－），女 ，辽 宁 抚 顺 人 ，硕 士 ，研 究 方 向 ：动 物 病 原 生 物 学 ，Ｅ－ｍａｉｌ：１２２５９７０５５９＠ｑｑ．ｃｏｍ ＊ 通 信 作 者 ：杨 发 龙 （１９７４－），男 ，青 海 大 通 人 ，博 士 ，教 授 ，研 究 方 向 ：动 物 病 原 生 物 学 ，Ｔｅｌ：０２８－８５５２８２７６；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｆａｌｏｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
１．４ 优 缺 点 ＬＡＭＰ 的优点 在 于：① 特 异 性 好，针 对 ６ 个 区
域设计４对引物，如 果 有 任 何 一 条 引 物 不 匹 配 反 应 都无法进行；②灵敏度高，相对于常规 ＰＣＲ 来说，可 以 检 出 更 少 的 模 板 量 ；③ 反 应 时 间 短 ，不 需 要 复 杂 的 反应程序，反应时间不超过１ｈ，而常规 ＰＣＲ 至少需 要２ｈ；④ 操 作 简 单，省 去 了 细 菌 分 离 的 步 骤，直 接 对病变组织进行扩 增。ＬＡＭＰ 的 缺 点：引 物 设 计 较 复杂，而且其发展 史 较 短，只 能 用 于 快 速 检 测，在 稳 定性 和 准 确 率 等 方 面 与 常 规 ＰＣＲ 相 比 还 有 一 定 的 差 距 。 ［９］
分子生 物 学 技 术，特 别 是 ＰＣＲ，目 前 作 为 一 种 常用且高效的核酸 扩 增 技 术，在 传 染 病 诊 断 和 病 原 的检测中发挥 了 重 要 的 作 用。 但 ＰＣＲ 扩 增 结 果 必 须通过电泳才能观 察 到，不 适 用 于 现 场 检 测 病 原 微 生物。 因 此，开 发 一 种 简 易 快 捷、特 异、灵 敏 的 核 酸 扩增检测方 法 成 为 当 务 之 急［１］。２０００ 年，由 Ｎｏｔｏ－ ｍｉ等［２］首 先 发 布 了 环 介 导 等 温 扩 增 技 术 （ｌｏｏｐ－ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）。ＬＡＭＰ 作为一 种 快 速 准 确 且 敏 感 度 高 的 诊 断 方 法 备 受 瞩目。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓ ａ ｎｅｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｅ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＬＡＭＰ）ｈａｓ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｅａｓｙ ｔｏ ｏｐｅｒａｔｅ，ｎｏ ｎｅｅｄ ｏｆ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｄｅｖｉｃｅｓ，ｌｏｗ ｃｏｓｔ，ｓｈｏｒｔ ｒｅ－ ａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｓｏ ｏｎ．Ｉｔ ｈａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｉｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ，ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ．Ｗｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ＬＡＭＰ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ，ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｔ ｈｏｍｅ ａｎｄ ａ－ ｂｒｏａｄ，ｓｏ ａｓ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄ ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ＬＡＭＰ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｉｔｓ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）；ｐａｔｈｏｇｅｎ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
２ ＬＡＭＰ 在不同致病菌检测中的应用
２．１ 细 菌 检 测 中 的 应 用 ２．１．１ 沙门氏菌的 检 测 沙 门 氏 菌 是 一 种 常 见 的 重 要 人 畜 共 患 病 原 菌 ，在 世 界 各 地 的 食 物 中 毒 中 ， 沙门氏菌引起的中 毒 病 例 占 有 很 大 的 比 例，因 此 沙 门氏菌 的 检 测 方 法 一 直 都 是 人 们 关 注 的 焦 点 之 一［１１］。传统方法 费 时，且 对 场 地、试 验 仪 器 有 很 高
是４条引物，分别为上、下 游 内 部 引 物 （ＦＩＰ、ＢＩＰ）和 上、下 游 外 部 引 物 （Ｆ３、Ｂ３）。ＦＩＰ：上 游 内 部 引 物 由
Ｆ２区和 Ｆ１Ｃ 区域组 成，Ｆ２ 区 与 靶 基 因 ３′端 的 Ｆ２Ｃ 区域互补，Ｆ１Ｃ 区与靶基因５′端的 Ｆ１Ｃ 区域序列 相 同；Ｆ３引物：上游外部引物，由 Ｆ３区组成，并与靶基 因的 Ｆ３Ｃ 区 域 互 补；ＢＩＰ 引 物：下 游 内 部 引 物，由 Ｂ１Ｃ 和 Ｂ２区域组成，Ｂ２区与靶基因 ３′端的 Ｂ２Ｃ 区 域互补，Ｂ１Ｃ 域 与 靶 基 因 ５′端 的 ＢＬＣ 区 域 序 列 相 同；Ｂ３引物：下游外部引物，由 Ｂ３区域组成，和靶基 因的 Ｂ３Ｃ 区域互补（图１）［４］。外部引物限定了扩 增 的范围，同时为内部引物提供模板 。 ［５］
３９０
中 国 畜 牧 兽 医
４３ 卷
Hale Waihona Puke Baidu
ＬＡＭＰ 研 究 进 展 及 该 技 术 在 细 菌、病 毒、支 原 体 等 致病菌的诊断应用 进 行 综 述，以 期 深 入 了 解 该 技 术 的优缺点和应用现 状，从 而 为 今 后 的 广 泛 应 用 提 供 参考依据。
１ ＬＡＭＰ 技术
１．１ 引 物 设 计 根据 目 的 基 因 的 ６ 个 不 同 区 域 设 计 引 物，主 要
Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ＷＵ Ｙｕ－ｘｉ，ＬＩ Ｐｕ－ｊｕｎ，ＷＡＮＧ Ｊｕａｎ，ＹＡＮＧ Ｆａ－ｌｏｎｇ＊ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）
中 国 畜 牧 兽 医 ２０１６，４３（２）：３８９－３９３
Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
ｄｏｉ：１０．１６４３１／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７１－７２３６．２０１６．０２．０１５
ＬＡＭＰ 方法及其在病原微生物检测中的应用
吴 禹 熹 ，李 璞 君 ，王 娟 ，杨 发 龙 ＊
ＬＡＭＰ 在合成 ＤＮＡ 的同时产生大量的焦磷酸 根离子，它们能与镁 离 子 结 合 生 成 白 色 的 焦 磷 酸 镁 沉淀，可根据反应体 系 中 是 否 形 成 白 色 沉 淀 来 定 性 判断 ＬＡＭＰ 反 应 是 否 发 生［１０］；通 过 反 应 后 在 体 系 中加入荧光染料来 判 断 结 果；也 可 以 通 过 凝 胶 电 泳 检测来确定。
ＬＡＭＰ 是 利 用 一 种 链 置 换 ＤＮＡ 聚 合 酶 （Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）和 ２ 对 特 殊 引 物，特 异 地 识 别 靶 序列上的６个独立区域，在等温条件下（６５ ℃ 左 右） 保温几十分钟，即 可 完 成 核 酸 扩 增 反 应。 反 应 结 果 可直接靠 扩 增 副 产 物 焦 磷 酸 镁 的 沉 淀 浊 度 进 行 判 断，也 可 以 藉 由 添 加 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ、溴 化 乙 啶 （ＥＢ）或其他核酸 染 剂 进 行 显 色 后 观 察。 该 技 术 由 于特异性强、灵敏 性 高，仅 需 普 通 水 浴 锅 就 能 快 速、 高 效 、简 便 地 对 病 原 微 生 物 进 行 鉴 定 ，因 而 具 有 推 广 性，可 以 作 为 常 规 的 检 测 工 具 。 ［３］ 作 者 对 国 内 外
２ 期
吴禹熹等：ＬＡＭＰ 方法及其在病原微生物检测中的应用
３９１
的要求，李 佳 桐 等 在 ［１２］ ２０１４ 年 根 据 沙 门 氏 菌 ＳＴＮ 基因序列设计引物，建 立 了 检 测 沙 门 氏 菌 的 ＬＡＭＰ 方 法 ，通 过 肉 眼 观 察 和 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 来 判 定 结 果 ， 其最低 检 测 浓 度 为 １０ＣＦＵ／ｍＬ，比 常 规 ＰＣＲ 的 最 低检出浓度高一个数量级；孙 园 园 等 也 ［１３］ 同 样 根 据 ｆｉｍＹ 基因建立了 ＬＡＭＰ 检 测 方 法，用 来 检 测 动 物 饲料中的沙门氏菌，利 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 来 判 定 结 果，该 方 法 的 最 低 检 出 量 为 ６．２ＣＦＵ／ｍＬ，比 常 规 ＰＣＲ 检测 结 果 高 １００ 倍；王 福 厚 等 根 ［１４］ 据ｉｖｎＡ 基 因建 立 了 ＬＡＭＰ 方 法，并 与 常 规 ＰＣＲ 进 行 灵 敏 度 比较，通过平板菌落计数发现 ＬＡＭＰ 方法的灵敏度 为７～８ＣＦＵ／ｍＬ，具 有 较 高 的 灵 敏 度 和 特 异 性 。 邱 索平等 通 ［１５］ 过 ＧｅｎＢａｎｋ 中 沙 门 氏 菌 ｆｉｍＹ 基 因 设 计引物，建 立 检 测 试 验 猴 粪 便 样 本 中 沙 门 氏 菌 的 ＬＡＭＰ 方 法，并 在 反 应 中 加 入 钙 黄 绿 素，根 据 颜 色 的变化来判断结果，这 种 方 法 对 沙 门 氏 菌 纯 培 养 物 的敏感性为 １．３５×１０１ ＣＦＵ／ｍＬ，临 床 样 本 的 敏 感 性为１．３５×１０３ ＣＦＵ／ｍＬ，与 常 规 ＰＣＲ 结 果 相 当， 但 ＬＡＭＰ 方 法 可 以 在 １ｈ 内 完 成 反 应 并 可 肉 眼 观 察结果，具 有 简 便、快 速 等 优 点。ＬＡＭＰ 方 法 的 建 立为快速检测沙门氏菌提供了有用的手段。 ２．１．２ 产 气 荚 膜 梭 菌 的 检 测 ２０１２ 年 刘 哲 等 对 ［１６］ 食源性产气荚 膜 梭 菌 建 立 了 ＬＡＭＰ 检 测 方 法，以产气荚膜梭菌 的 α 毒 素 全 基 因 序 列 为 保 守 序 列，设计引 物，通 过 肉 眼 观 察 白 色 沉 淀 判 断 检 测 结 果。其检出下限为２．９２×１０２ ＣＦＵ／ｍＬ，是 ＰＣＲ 检 测灵敏度的 １ ０００ 倍，检测时间比 ＰＣＲ 缩短了２ｈ， 具有明显优势。通 过 对 １２ 株 肠 道 致 病 菌 的 检 测 结 果 表 明 该 方 法 具 有 良 好 的 特 异 性。 结 果 表 明 ＬＡＭＰ方法具有反应快 速，不 需 要 昂 贵 的 仪 器 设 备 及繁琐的电泳过程 等 优 点，目 前 其 在 有 害 微 生 物 的 检测方面发挥着重要作用 。 ［１７］ ２．１．３ 金黄色葡萄 球 菌 的 检 测 耐 药 性 细 菌 已 成 为 医 院 感 染 的 重 要 病 原 菌 ，因 此 快 速 、准 确 检 测 耐 药性细 菌，对 预 防 耐 药 性 细 菌 的 感 染 具 有 重 要 意 义 。 ［３］ Ｍｉｓａｗａ等 利 ［１８］ 用 ＬＡＭＰ 方 法，根 据ｓｐａ 和 ｍｅｃＡ 基因设计引物，在 ６３ ℃ 恒温的条件下高特 异 性、高效率的扩增目 的 基 因 并 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 来检验结果，以检测 血 培 养 阳 性 的 耐 甲 氧 西 林 金 黄 色葡 萄 球 菌，与 Ｄｒｔ－ＰＣＲ 检 测 结 果 进 行 比 较 发 现， 两者灵 敏 度 分 别 为 ９２．３％ 和 ９６．２％，特 异 性 均 为 １００％，阳性率分别 为 ９６．９％ 和 ９８．４％。 虽 然 两 者 结果几乎相同，但 ＬＡＭＰ 法 更 符 合 成 本 效 益，并 为 临床实验室提供快速优良的检测。
图１ ＬＡＭＰ 引物的设计 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ
１．２ 反 应 原 理 ＬＡＭＰ 反应过 程 是 先 由 外 部 引 物 扩 增 出 内 部
引 物 扩 增 所 需 要 的 模 板 ，即 起 始 反 应 物 模 板 的 合 成 ； 紧接着由内 部 引 物 引 导 合 成 靶 基 因 ＤＮＡ 片 段，由 于内 部 引 物 扩 增 的 ＤＮＡ 片 段 含 有 与 该 引 物 ５′端 ＤＮＡ 片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列 之间通过杂交形成 茎 环 结 构，另 外 一 条 内 部 引 物 与 其互补链退火杂交 后 引 导 链 置 换 合 成 反 应，在 扩 增 ＤＮＡ 片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑 铃结构［６－７］；之后以 之 前 形 成 的 哑 铃 结 构 为 模 板，进 行 扩 增 ，最 后 形 成 花 椰 菜 样 大 小 不 一 的 片 段 ，即 为 反 应 终 止 。 ［８－９］ １．３ 结 果 判 定