病原微生物的检测方法研究进展
临床微生物快速检验技术进展
临床微生物快速检验技术研究进展目前感染性疾病是危害人类健康的重大隐患，尤其是对第三世界国家更是一严重的挑战。
随着抗生素的滥用，导致了出现大量严重的耐药菌株，加上新的病原微生物的出现，给临床诊断和治疗带来了极大的困扰。
严峻的现实给病原微生物的检测和诊断提出了更高的要求。
世界卫生组织（who）对临床微生物实验室提出：临床微生物实验室尽可能把目标集中在快速诊断方面。
传统的微生物检验法的最大弱点是慢，难以实现快速诊断与治疗，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。
实现更准确、更快速地检出与监测病原体成为目前临床微生物检验亟待解决的问题。
随着各种生物学技术的发展和相关学科的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学及计算机技术的不断发展，微生物的检验速度明显加快，同时明显提高了微生物的诊断水平。
本文就对近年来微生物的快速检验技术研究进展作一综述。
1.免疫学方法在快速检测微生物抗原或抗体中的应用免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应，检测病原微生物，简化了病原微生物的鉴定步骤，备受关注。
该方法已成为一种微生物实验室常用的成熟的快速检测技术。
应用单克隆抗体结合各种形式的放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析、生物发光免疫分析等，足以检出临床标本中痕量微生物抗原，免去细菌或病毒培养过程，直接完成微生物感染的快速诊断。
如抗血清凝集技术、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。
这些方法操作简单，已经被广泛应用于细菌的分型和鉴定，如沙门菌、霍乱弧菌、流感嗜血杆菌及隐球菌，短时间内就可完成鉴定[1]。
其中，应用酶联免疫技术制造的全自动免疫分析仪，使该技术进一步简化和准确。
许多疾病的检测都已有商品化的试剂盒出现。
2.分子生物学技术在快速检测微生物中的应用随着分子生物学技术的迅速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是立足于分子，特别是核酸水平的检测上，使人们对微生物的认识从外部表型逐渐转向内部基因结构特征，微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平检测。
病原微生物的新研究进展
病原微生物的新研究进展研究者们对病原微生物进行的新近研究，深化了我们对病原微生物的认识，为预防和治疗传染病带来了新的希望。
本文将就病原微生物研究的最新进展进行探讨，并介绍其对传染病防控的意义。
一、基因编辑技术的应用随着基因编辑技术的飞速发展，研究者们能够更深入地了解病原微生物的基因组，以及病原微生物与宿主之间的相互作用。
基因编辑技术的应用不仅可以帮助科学家们揭示病原微生物的致病机制，同时也为开发高效的治疗手段提供了新的思路。
例如，利用基因编辑技术，科学家们成功地改造了某些细菌的基因组，使其失去致病能力，从而探索了新的治疗传染病的途径。
二、新型抗生素的研发随着多年来过度使用抗生素，细菌对传统抗生素的抵抗性也逐渐增强，这给临床治疗带来了巨大的挑战。
然而，最近的研究表明，一些新型抗生素的出现对于解决这一问题具有重要意义。
科学家们通过开展大规模的病原微生物抗性基因研究，发现了一些潜在的抗生素靶点，并利用计算机模拟技术设计出了一批新型抗生素。
这些新药物具有更好的抗菌活性，有望在临床上取得更好的疗效。
三、病原微生物的群体行为研究病原微生物不再仅仅被视为单个单细胞微生物，科学家们发现它们在形成感染过程中展示出了一定的群体行为。
例如，有些细菌会形成生物膜来保护自己免受宿主免疫系统的攻击。
此外，一些研究还揭示了细菌之间通过化学信号相互交流的现象。
这些群体行为的研究为我们理解病原微生物的感染机制提供了新的视角，也为研发新型抗菌药物提供了新的思路。
四、病原微生物与宿主免疫的相互作用病原微生物与宿主免疫系统的相互作用是决定感染病程和结果的重要因素。
最近的研究发现，病原微生物在感染宿主时，可以通过多种方式来干扰宿主免疫系统的正常功能。
这些干扰机制涉及到病原微生物表面的一些分子结构，如细菌的外膜蛋白和多糖结构等。
对这些分子结构的深入了解，可以帮助我们发展出针对性的疫苗和免疫治疗策略，提高人们对病原微生物的抵抗力。
综上所述，病原微生物的新研究进展极大地丰富了我们对于病原微生物的认识，为疾病的预防和治疗带来了新的希望。
病原体检测技术的研究与发展
病原体检测技术的研究与发展随着人类社会的不断发展，人们对于疾病防控和治疗的要求越来越高。
而病原体检测技术的研究与发展也因此成为了一个备受关注的领域。
在这篇文章中，我将探讨病原体检测技术的研究与发展，并介绍一些目前在这个领域中取得的一些重要进展。
第一部分：病原体检测技术的意义与作用病原体检测技术是一种十分重要的技术，它的主要作用是帮助医生和科学家在疾病的早期检测、诊断和治疗中准确地识别病原体。
这些病原体可能是细菌、病毒、真菌或其他微生物。
准确地诊断和早期检测疾病对于疾病治疗和控制至关重要。
病原体检测技术可以提高疾病的诊断水平，帮助医生制定更加精准的治疗计划。
同时，病原体检测技术也可以用于预防疾病的爆发，通过对可能感染病原体的监测，从而帮助我们及时地采取预防措施，防止疫情的扩散和传播。
第二部分：病原体检测技术的分类病原体检测技术的种类很多，可以分为传统检测技术和新兴检测技术两类。
1. 传统检测技术传统的病原体检测技术主要包括培养、镜检和细胞培养等方法。
这些方法都是在显微镜下进行操作的，需要手动进行繁琐的实验操作。
这种方法虽然比较传统，但是也有很大的局限性，因为不同的病原体在培养环境中所需要的条件是不同的，很多病原体是无法被培养出来的。
2. 新兴检测技术新兴的病原体检测技术比传统的检测技术更加智能化和高效化。
这些技术有基于PCR技术的检测方法、基于质谱的检测方法、荧光显微镜等方法。
这些方法都是相对智能化的技术，可以快速地对样本进行测试，并准确地检测出病原体。
第三部分：病原体检测技术的发展现状随着技术和科学的发展，病原体检测技术也在不断地进步和创新。
目前，许多新兴的检测技术已经应用于疾病的检测和治疗中。
下面我简单介绍其中的几种技术：1. 基于PCR技术的检测方法基于PCR技术的检测方法是当前使用最为广泛的病原体检测方法之一。
在这种检测方法中，需要使用PCR扩增技术，通过扩增病原体的核酸序列来检测样本中是否存在该病原体。
食品病原微生物快速检测技术及研究进展
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CRISPR-Cas系统在病原微生物分子诊断中的研究进展
㊃综述㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2024.05.023C R I S P R-C a s系统在病原微生物分子诊断中的研究进展*龙文巧1,许永杰2综述,张华1,2ә审校1.遵义医科大学,贵州遵义563000;2.贵州省人民医院检验科,贵州贵阳550000摘要:快速㊁灵敏㊁准确的病原微生物检测方法对感染性疾病的诊治及防控至关重要㊂基于成簇规律间隔短回文重复序列(C R I S P R)-C R I S P R相关蛋白(C a s)系统的检测技术在病原微生物核酸检测中具有高灵敏度和高特异度的特点,该文概述了C R I S P R-C a s系统的作用机制及不同C a s的核酸酶活性,总结了基于C I S P R-C a s系统的检测技术在病原微生物核酸检测中的研究现状,对该系统在核酸检测应用中的挑战进行了综合分析,并提出了目前存在的一些解决方案㊂目前基于C R I S P R-C a s系统的非核酸分析物检测仍处于前期研究阶段,但其在扩大检测范围㊁缩短检测时间㊁提高检测灵敏度等方面具有较大潜力,为开发基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物检测平台提供新思路㊂关键词:成簇规律间隔短回文重复序列-成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白系统;病原微生物;核酸检测;非核酸分析物检测;应用中图法分类号:R446文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)05-0687-06A d v a n c e s i n C R I S P R-C a s s y s t e m s-b a s e d m o l e c u l a r d i a g n o s i s o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s*L O N G W e n q i a o1,X U Y o n g j i e2,Z HA N G H u a1,2ә1.Z u n y i M e d i c a l U n i v e r s i t y,Z u n y i,G u i z h o u563000,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,G u i z h o u P r o v i n c i a l P e o p l e's H o s p i t a l,G u i y a n g,G u i z h o u550000,C h i n aA b s t r a c t:R a p i d,s e n s i t i v e a n d a c c u r a t e d e t e c t i o n o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i s c r i t i c a l f o r t h e d i a g n o-s i s,t r e a t m e n t,p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s.B a s e d o n t h e h i g h s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y c h a r-a c t e r i s t i c s o f d e t e c t i o n t e c h n i q u e s o f c l u s t e r e d r e g u l a r l y i n t e r s p a c e d s h o r t p a l i n d r o m i c r e p e a t s(C R I S P R)-C R I S P R-a s s o c i a t e d p r o t e i n(C a s)s y s t e m s.T h i s r e v i e w s u mm a r i z e s t h e m e c h a n i s m o f C R I S P R-C a s s y s t e m, t h e n u c l e a s e a c t i v i t i e s o f d i f f e r e n t C a s a n d t h e r e s e a r c h s t a t u s o f C R I S P R-C a s d e t e c t i o n t e c h n o l o g y i n t h e d e-t e c t i o n o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s.M o r e o v e r,t h e c h a l l e n g e s o f t h e C R I S P R-C a s s y s t e m i n t h e a p p l i c a t i o n o f n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n a r e c o m p r e h e n s i v e l y a n a l y z e d,a n d s o m e e x i s t i n g s o l u t i o n s a r e p r o p o s e d.A t p r e s e n t, t h e d e t e c t i o n o f n o n-n u c l e i c a c i d t a r g e t s b a s e d o n t h e C R I S P R-C a s s y s t e m i s s t i l l i n t h e p r e l i m i n a r y r e s e a r c h s t a g e,b u t i t h a s g r e a t p o t e n t i a l t o e x p a n d t h e d e t e c t i o n f i e l d,s h o r t e n t h e d e t e c t i o n t i m e a n d i m p r o v e t h e d e t e c-t i o n s e n s i t i v i t y,w h i c h p r o v i d e s a n e w w a y f o r t h e d e v e l o p m e n t o f p a t h o g e n i c m i c r o b i a l d e t e c t i o n p l a t f o r m s b a s e d o n t h e C R I S P R-C a s s y s t e m.K e y w o r d s:C R I S P R-C a s s y s t e m;p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s; n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n; n o n-n u c l e i c a c i d a n a l y t e s d e t e c t i o n;a p p l i c a t i o n常见的病原微生物如病毒㊁细菌㊁真菌等引起的感染性疾病仍是危害人类健康的主要原因之一[1]㊂因此,快速㊁灵敏㊁准确㊁简便的检测方法对感染性疾病的诊断㊁疗效评估及预防控制具有重要意义㊂基于成簇规律间隔短回文重复序列(C R I S P R)-C R I S P R相关蛋白(C a s)系统的检测技术因具有高灵敏度㊁高特异度㊁快速㊁便携等优点而广泛应用于病原微生物的检测中[2]㊂1987年I S H I N O等[3]在大肠杆菌中首次发现了C R I S P R基因组,2005年H A F T等[4]鉴定了C a s的功能,随后P O U R C E L等[5]证明了C R I S P R-C a s系统是细菌抵抗噬菌体入侵的适应性免疫系统㊂目前C R I S P R-C a s系统除了应用于基因编辑技术外,还广泛应用于病原微生物核酸检测技术[6]㊂基于C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术表现出高灵敏度㊁高特异度㊁快速等优点,可实现现场检测,在感染性疾病诊断方面具有巨大应用前景㊂同时,基于C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术的进一步应用也存在许多挑战,这些挑战包括开发快速高效的核酸提取方式㊁简便的检测程序及高通量检测技术等[7]㊂随着基于㊃786㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5*基金项目:国家自然科学基金项目(82160026)㊂ә通信作者,E-m a i l:780837482@q q.c o m㊂C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术的发展,非核酸分析物的检测也成为当前研究热点[8]㊂本文概述了C R I S P R-C a s系统的作用机制和不同效应蛋白的核酸酶活性,综述了C R I S P R-C a s系统在病原微生物核酸检测中的应用研究进展和挑战,并进一步介绍了C R I S P R-C a s系统在抗原㊁血清学抗体㊁病原体等非核酸分析物检测方面的最新研究热点㊂1 C R I S P R-C a s系统概述C R I S P R-C a s系统由存储记忆的C R I S P R和C a s 基因组成,这两部分共同作用形成C R I S P R-C a s效应复合体,参与核酸识别㊁切割过程[4]㊂C R I S P R-C a s系统通过将外来噬菌体D N A储存到细菌宿主染色体中形成记忆,进而阻止噬菌体再次感染㊂C R I S P R-C a s 系统遵循免疫的3个主要阶段[9]:(1)适应㊂对外来核苷酸序列识别㊁处理后将间隔序列整合到C R I S P R 基因座中,由此存储首次感染的记忆㊂(2)C R I S P R R N A(c r R N A)成熟㊂间隔序列翻译成c r R N A和反式激活R N A通过碱基配对形成向导R N A(s g R N A),用于募集C a s㊂(3)干扰㊂C a s通过结合s g R N A形成效应复合物,在原间隔相邻基序(P AM)的协助下对靶标识别并切割,完成对外来核苷酸序列的特异性清除㊂不同的C a s具有不同的核酸内切酶活性,当前研究主要集中于C a s9㊁C a s12㊁C a s13㊁C a s14,C a s9结合s g R N A后特异性识别和切割靶标,通过对切割产物的分析实现靶标的检测[10]㊂而C a s12㊁C a s13㊁C a s14识别并结合c r R N A及靶标后形成效应复合体,该复合体可非特异性切割任意单链D N A或单链R N A,该过程被称为反式切割㊂此类蛋白反式切割大量带有标记的单链D N A或单链R N A报告探针,进而输出检测信号㊂基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物检测技术可分为两类[11]:第1类是通过提取基因组,联合C R I S P R-C a s系统建立核酸检测方法;第2类是通过适配体或抗体识别非核酸分析物,直接或间接与C R I S P R-C a s系统联合,实现非核酸分析物的检测㊂2基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物核酸检测基于C R I S P R-C a s系统的核酸检测技术常通过对样品中的微量核酸进行特异性识别和信号放大完成相关检测㊂目前,基于C R I S P R-C a s9/C a s13/ C a s12/C a s14系统的检测技术具有高特异度㊁高灵敏度㊁快速等特点,已被广泛应用于核酸检测中㊂基于C R I S P R-C a s9系统的检测技术依赖于该系统识别及切割双链D N A(d s D N A)的能力,用于病原微生物的核酸检测㊂P A R D E E等[12]将基于C R I S P R-C a s9及含有激发序列的t o e h o l d传感器联合依赖核酸序列的扩增(N A S B A)方法开发一种显色纸片检测技术,建立了可视化检测寨卡病毒检测技术,该技术通过比色法输出检测信号,检测灵敏度可达3f m o l/L,能鉴别美洲和非洲寨卡病毒株,且不需要昂贵的设备㊂但N A S B A需要3种酶使得反应成本较高,反应成分较复杂,检测时间较长㊂选择合适的核酸扩增方法对提高检测平台的综合检测性能至关重要㊂此外,去核酸酶活性的C a s9(d C a s9)保留了d s D N A的结合能力,对目标核酸序列无切割活性,也可用于核酸检测㊂H A I J I A N等[13]开发了C R I S P R芯片(C R I S P R-C h i p)技术,该技术将d C a s固定于石墨烯电子晶体管,在s g R N A辅助下,加入目标d s D N A后在晶体管上形成d C a s-s g R N A-d s D N A复合物,该复合物会改变晶体管电导率,可根据电导率变化得出检测结果㊂C R I S P R-C h i p技术无须对靶标进行检测前扩增,可直接检测到1.7f m o l/L的目标d s D N A,耗时15m i n㊂C a s9和d C a s9常用于核酸检测,但此类技术的信号放大及输出过程较复杂㊂C a s12a㊁C a s13a㊁C a s14等具有反式切割活性的发现为开发更简便㊁快速㊁精准的基于C R I S P R-C a s系统的检测平台提供更多可能㊂基于C R I S P R-C a s12/C a s13/C a s14系统的检测技术通常利用C a s的反式切割活性直接切割带标记的检测探针,从而产生各种信号(如荧光㊁比色㊁电化学等),直接㊁快速地获得较高的检测灵敏度㊂K E L L-N E R等[2]将重组酶聚合扩增技术(R P A)联合C R I S P R-C a s13a系统,建立了S H E R L O C K技术㊂该技术通过切割淬灭的荧光报告探针放大和输出检测信号,在寨卡病毒检测中可达到单碱基分辨率,并极大地提高了检测的灵敏度㊂此外,C a s12a同样具有强大的反式切割活性,C H E N等[14]将C R I S P R-C a s12a 系统联合R P A开发了D E T E C T R技术㊂S H E R-L O C K及D E T E C T R技术具有高灵敏度㊁高特异度和快速等优点,并为开发更多新的基于C R I S P R-C a s 系统的检测技术提供基础㊂但此类技术有两步反应,增加了检测过程中被污染的风险,进一步的研究可通过将核酸扩增过程与C R I S P R检测过程整合于单一反应体系中进而降低检测过程被污染的风险㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在实际应用中面临着复杂的核酸提取方式和检测程序,以及难以实现对单一c r R N A及C a s进行多重靶标检测等挑战,这些挑战限制了新技术在实际样本检测中的应用㊂3病原微生物核酸检测的挑战基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物核酸检测在临床应用上面临需开发简易的核酸提取方法,简化检测程序,建立多重检测平台等诸多挑战[7],笔者进一步讨论了目前的一些解决方案㊂3.1核酸提取的简化简化核酸提取过程仍然是快速核酸检测技术发展的主要瓶颈,因此需要开发快速高效的核酸提取方法促进基于C R I S P R-C a s系统的检测技术的应用㊂MY H R V O L D等[15]建立了样本加㊃886㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5热消除核酸酶非提取(HU D S O N)技术,将HU D S O N 与S H E R L O C K技术联合,在提取和纯化D N A或R N A的情况下裂解病毒,可以直接从临床样本中检测病毒核酸,极大地简化了操作步骤,降低了气溶胶污染的风险㊂然而,HU D S O N技术缺乏纯化和浓缩核酸的步骤,可能会降低检测复杂样本中目标核酸的能力㊂纳米材料和技术可以通过简便的工艺从复杂样品中提取目标核酸㊂纳米级的隔离膜具有较大的比表面积,R O D R I G U E Z等[16]开发了基于纸张核酸扩增的流控芯片技术,该技术使用的隔离膜通过静电作用和氢键结合力将高盐溶液中的目标核酸快速㊁高效地分离,使吸附在膜上的核酸保持稳定的结合,通过环介导等温扩增(L AM P)技术在原位扩增,实现目标序列的富集㊁纯化和扩增,完成从样品到结果的集成检测㊂目前,芯片上的等温放大步骤需要外部热源,该技术使用加热模块来辅助等温扩增,因此,若在基于纸张的微流控检测平台中整合一个集成的加热系统将大大加强其便携性㊂3.2检测过程的简化大多数基于C R I S P R-C a s系统的检测技术仍然使用标准的两步检测法,此类方法增加了检测的时间和检测过程中交叉污染的风险,这促使研究者开发单管检测策略㊂常规两步检测法首先利用核酸扩增技术提高靶标的浓度,再联合C R I S P R-C a s系统产生放大的检测信号[2]㊂但核酸扩增技术扩增靶标的同时,还增加了非特异性扩增的风险,故研究者们开发了无须靶标扩增的超灵敏的检测方法㊂3.2.1单管检测策略基于C R I S P R-C a s系统的单管检测技术将核酸扩增和C R I S P R-C a s系统反应整合于一个缓冲体系,用于快速现场检测㊂单管检测是在反应管底部添加核酸扩增试剂,在反应管盖上也添加C a s12a和c r R N A试剂,反应管底部的核酸扩增完成后,将预先加在管盖上的C a s12a和c r R N A试剂通过离心移至管底,使C a s12a和c r R N A试剂与扩增子混合,实现在1管内完成扩增和检测,避免了气溶胶污染[17]㊂但此技术先进行靶标扩增再将扩增产物与C R I S P R-C a s系统反应,检测时间较长㊂因此,研究者们将靶标的扩增与C R I S P R-C a s系统整合于一个缓冲系统中同时进行反应,缩短了检测时间㊂根据核酸扩增步骤和C R I S P R-C a s系统反应的温度偏好, J O U N G等[18]将L AM P介导的核酸扩增反应(55~ 65ħ)与耐高温的C a s12b(31~59ħ)集中于一管中同时完成核酸扩增与信号检测,建立了单管检测技术㊂该技术不但降低了交叉污染的风险,还明显缩短了检测时间㊂同样,该技术的核酸扩增过程也需要加热,未来的研究可通过开发集成加热系统,进一步简化工作流程,进而在不同环境下均可进行相关核酸检测㊂3.2.2无扩增检测策略无核酸扩增步骤的检测策略具有快速㊁避免非特异性扩增㊁不易产生交叉污染等优势,但可能会造成检测灵敏度下降㊂为解决灵敏度下降这一问题,研究者们通常使用超灵敏信号报告系统㊁信号级联放大技术,以及微小体积等方式提高灵敏度[13]㊂首先,电化学传感器㊁金属纳米材料㊁高性能的表面增强拉曼散射技术等可放大来自C R I S P R-C a s系统的微弱信号,超灵敏地检测低浓度靶标㊂其次,因实验中C R I S P R-C a s系统反应速率与C a s-c r R N A复合物的数量呈正比,基于C R I S P R-C a s系统的检测用多个C a s-c r R N A复合物直接靶向目标序列的不同位点,通过加快信号积累速率,在更短的时间内达到检测信号阈值[19]㊂此外,根据C a s的反式切割活性与底物浓度呈正比的原理,空间限制检测体系可浓缩底物进而提高检测灵敏度[20]㊂不同无扩增策略的组合可提高检测的灵敏度㊂基于C R I S P R-C a s系统的无扩增数字R N A检测技术通过采用多个C a s13a-c r R N A复合物靶向多个位点在空间限制体系(反应体积减小到n L水平)中检测新型冠状病毒(S A R S-C o V-2),检测限为5f m o l/L,耗时5m i n[21]㊂因此,合理整合上述策略可以实现无扩增㊁快速㊁灵敏的靶标检测㊂但由于缺乏靶标扩增步骤,用来增加灵敏度的策略可能会增加检测方法的复杂性和费用,在选择或设计检测方法时,必须综合考虑这些策略的优缺点㊂3.3多重检测多重检测可以提高诊断效能,实现大规模样本的高通量检测㊂G O O T E N B E R G等[22]利用P s m C a s13b㊁L w a C a s13a㊁C c a C a s13b和C a s12a分别切割富含特定核苷酸序列的报告探针,实现了四重检测㊂但在该检测方法中,C a s的反式切割可能会产生信号重叠以降低检测的特异度,且该技术涉及较多的蛋白质种类,导致检测成本较高㊂因此,一种通过D N A阻断剂调控C a s反式切割活性的检测方法以单一蛋白实现了多重靶标的检测一定程度上降低了检测成本㊂H A N等[23]开发了一种基于C a s12a-D N A 阻断剂的多重检测(C A S T I)技术㊂C A S T I可以通过联合R P A扩增靶标,以一种C a s实现人乳头瘤病毒(H P V)16和H P V18基因的检测,检测限为1a m o l/L㊂该多重检测平台有助于在设备有限的条件下进行病原微生物的检测㊂然而,与检测人工合成的D N A靶标相比,该技术在细胞系和临床样本中检测目标D N A的效率较低,因此,需要进一步优化实验条件以避免样本中其他D N A或R N A的干扰㊂此外,A C KE R MA N等[24]将核酸多重评估的组合排列反应(C A R M E N)联合C R I S P R-C a s13a系统,开发一种多通道检测方法(C A R M E N-C a s l3)㊂C A R M E N-C a s l3已可同时检测169种人类病毒,还能区分多种㊃986㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5亚型的流感病毒,检测时间为5m i n㊂C A R M E N-C a s13的灵敏度和特异度可与S H E R L O C K技术匹配,这对病原微生物高通量检测及流行病学研究至关重要㊂该技术可检测来自不同人群的数千份样本,需要专业人员对检测结果进行仔细分析解释㊂该技术若能与移动电话应用程序连接将直接读出检测结果,会有更大的应用潜力㊂4基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物非核酸分析物检测病原微生物及其抗原和血清学抗体等非核酸分析物往往在发病早期和治疗开始后以低浓度出现㊂灵敏和可定量的基于C R I S P R-C a s系统的检测技术有助于发现早期病变和准确评估疾病疗效[25]㊂近年来,基于C R I S P R-C a s系统的检测技术已用于检测多种类型靶标,包括病原体㊁抗原㊁血清学抗体等㊂4.1基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物直接检测基于C R I S P R-C a s系统的病原微生物直接检测常通过抗体或适配体识别致病菌,再与C R I S P R-C a s系统联合放大检测信号,实现免培养㊁免提取的病原微生物直接检测㊂基于抗体的检测方法利用抗体对靶细菌识别,通过免疫夹心法联合C R I S P R-C a s12a 系统输出检测结果㊂D U A N等[26]开发了一种基于C R I S P R-C a s12a系统引导㊁无D N A提取和扩增㊁可快速直接检测病原体的生物传感器(C A T C H E R)㊂C A T C H E R通过免疫夹心结构(标记鼠伤寒抗体的磁珠㊁靶细菌㊁标记鼠伤寒抗体和D N A核酸内切酶Ⅰ的胶体金),经磁分离后巧妙地利用D N A核酸内切酶Ⅰ将溶液中单链D N A激活探针降解为短寡核苷酸,改变C R I S P R-C a s12a系统生物活性,进而输出检测结果,检测限为7.9ˑ101C F U/m L㊂该方法为非核酸分析物的检测提供了一个通用平台㊂相比价格较贵的抗体识别方法,适配体识别方法成本较低且步骤更简便㊂基于适配体的方法,研究者通常识别适配体靶标后释放一个D N A或R N A激活探针用于激活C R I S P R-C a s系统,进而完成信号的放大及输出㊂S H E N等[27]开发了将核酸变构探针(A P)与C R I S P R-C a s13a系统联合的A P C-C a s检测方法㊂该方法通过A P识别靶细菌后暴露引物结合位点,引物在D N A聚合酶和T7启动子作用下进行D N A序列的延伸和转录,产生大量单链R N A激活探针及C R I S P R-C a s13系统,通过荧光信号输出结果㊂该技术可快速㊁直接㊁定量检测各种样本中肠炎单胞菌数(1~ 105C F U/m L)㊂以上病原微生物直接检测技术省去了检测前核酸提取和扩增步骤,明显缩短了检测时间㊂4.2基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物抗原检测病原微生物抗原与致病力密切相关,抗原检测也是传染性疾病诊断的主要方式之一㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术检测抗原时大多需利用适配体识别抗原后将抗原转化为核酸信号,联合C R I S P R-C a s系统放大检测信号,实现抗原快速检测㊂生物毒素是细菌产生的一类重要抗原,会引起人类急性中毒㊁致癌或致畸等,生物毒素的检测有助于评估细菌感染严重程度和预防毒素引发的休克㊂A B-N O U S等[28]利用核酸适配体联合C R I S P R-C a s12a系统识别黄曲霉毒素M1(A F M1),开发了简便㊁高效的抗原检测技术㊂在添加了A F M1的牛奶样品中,该技术在0.5~50.0n g/L呈现出较宽的线性关系㊂该技术利用比色法,通过颜色的变化输出检测结果,不需要昂贵设备,信号输出方式简便,便于现场检测,但比色这一信号输出方式灵敏度相对较低㊂研究者可探索使用包括金属有机框架在内的新型纳米材料来提高传感器的灵敏度㊂此外,病毒抗原往往决定了病毒的宿主㊁组织嗜性及其致病的能力,也成为检测的重要靶标㊂通过适配体联合C R I S P R-C a s12a系统,研究者建立了S A R S-C o V-2抗原的电化学检测平台[29],实现核衣壳蛋白的检测㊂与常规抗原检测法相比,基于C R I S P R-C a s系统的抗原检测技术提高了抗原检测的特异度和灵敏度,并可对抗原进行定量检测㊂4.3基于C R I S P R-C a s系统相关的病原微生物抗体检测抗体检测在疾病诊断㊁疗效评估和流行病学调查中具有重要意义㊂B A R B E R等[30]建立了C R I S P R-C a s9系统介导的自组装固定肽(P I C A S S O)技术㊂P I C A S S O技术通过将能与靶分子特异性结合的重组肽段与d C a s9融合形成复合物,利用s g R N A引导该复合物与微阵列表面上特定位置的D N A进行自组装,构建D N A-蛋白质微阵列,用于检测不同抗体㊂P I C A S S O技术能快速识别样本中的上千种抗体,实现了病原微生物血清学抗体快速高通量检测㊂P I C-A S S O技术已被用于检测新型冠状病毒感染(C O V-I D-19)恢复期患者血清S A R S-C o V-2的抗体㊂但该技术难以避免非特异性背景信号,未来的研究可通过改变微阵列表面寡核苷酸的间距密度及d C a s9与其融合蛋白之间的连接长度等进一步优化实验条件,提高检测特异度㊂5总结与展望基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在病原微生物核酸和非核酸靶标的检测中迅速发展,实现对超低浓度样品的精确㊁灵敏检测㊂本文归纳了基于C R I S P R-C a s系统的检测技术的构建和应用,讨论了该技术目前存在的挑战及可能的解决办法,进一步阐述了基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在病原微生物非核酸分析物检测方面的最新研究热点㊂核酸靶标的检测通过开发简易的核酸提取方法,简化检测程㊃096㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5序,建立多重检测平台等方式提高了检测性能㊂非核酸靶标的检测则需通过适配体㊁抗体及其他方式将靶标转换成核酸信号进一步完成检测,在病原微生物检测领域展现出了更广阔的应用前景㊂尽管C R I S P R-C a s系统在病原微生物检测中具有各种优势,但仍有一些挑战需要克服㊂(1)靶基因片段选择的局限性㊂C R I S P R-C a s系统在C a s锚定目标序列时依赖于P AM,在选择检测的靶基因片段时存在一定的局限性㊂(2)c r R N A和单链D N A㊁单链R N A报告探针在添加R N A酶抑制剂的临床复杂样本中仍存在降解风险㊂(3)C a s存在一定的背景活性,不同批次的背景活性不同,导致样品检测结果不同㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术在临床应用上具有巨大的潜力㊂基于C R I S P R-C a s系统的检测技术与人工智能相结合,可以促进感染性疾病的早期诊断,直接向卫生专家甚至普通人群发出警报㊂此外,基于C R I S P R-C a s系统技术的检测结果可以通过移动电话应用程序连接到云数据进行分析和储存,可用于构建医疗大数据分析平台,为临床诊疗及科学研究提供有力证据㊂C R I S P R-C a s系统现在能够检测的不仅是基因组材料,还有望扩展到更多领域㊂除病原微生物及其抗原和血清学抗体等非基因组目标外, C R I S P R-C a s系统在癌症生物标志物㊁人体样本罕见突变㊁食品水样污染检测㊁植物病原微生物检测等领域的新应用仍有待进一步探究㊂参考文献[1]D I L N AWA Z F,A C HA R Y A S,K A N U N G O A.A c l i n i c a lp e r s p e c t i v e o f c h i t o s a n n a n o p a r t i c l e s f o r i n f e c t i o u s d i s e a s e m a n a g e m e n t[J].P o l y m B u l l(B e r l),2023:1-25. [2]K E L L N E R M J,K O O B J G,G O O T E N B E R G J S,e t a l.S H E R L O C K:n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n w i t h C R I S P R n u c l e a-s e s[J].N a t P r o t o c,2019,14(10):2986-3012. [3]I S H I N O Y,S H I N A G AWA H,MA K I N O K,e t a l.N u c l e-o t i d e s e q u e n c e o f t h e i a p g e n e,r e s p o n s i b l e f o r a l k a l i n e p h o s p h a t a s e i s o z y m e c o n v e r s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i,a n d i-d e n t i f i c a t i o n o f t h e g e n e p r o d u c t[J].J B a c t e r i o l,1987,169(12):5429-5433.[4]HA F T D H,S E L E N G U T J,MO N G O D I N E F,e t a l.Ag u i l d o f45C R I S P R-a s s o c i a t e d(C a s)p r o t e i n f a m i l i e s a n dm u l t i p l e C R I S P R/C a s s u b t y p e s e x i s t i n p r o k a r y o t i c g e-n o m e s[J].P L o S C o m p u t B i o l,2005,1(6):e60.[5]P O U R C E L C,S A L V I G N O L G,V E R G N A U D G.C R I S P Re l e m e n t s i n Y e r s i n i a p e s t i s a c q u i r e n e w r e p e a t s b y p r ef e r e n-t i a l u p t a k e o f b a c t e r i o p h a g e D N A,a n d p r o v i d e a d d i t i o n a l t o o l s f o r e v o l u t i o n a r y s t u d i e s[J].M i c r o b i o l o g y(R e a d i n g), 2005,151(P t3):653-663.[6]V A N B E L J O UW S P B,S A N D E R S J,R O D RÍG U E Z-MO L I N A A,e t a l.R N A-t a r g e t i n g C R I S P R-C a s s y s t e m s[J].N a t R e v M i c r o b i o l,2023,21(1):21-34.[7]Q I U M,Z HO U X M,L I U L.I m p r o v e d s t r a t e g i e s f o rC R I S P R-C a s12-b a s e d n u c l e i c a c i d s d e t e c t i o n[J].J A n a lT e s t,2022,6(1):44-52.[8]L I Y,D E N G F,G O L D Y S E M.A s i m p l e a n d v e r s a t i l eC R I S P R/C a s12a-b a s e d i mm u n o s e n s i n g p l a t f o r m:t o w a r d s a t t o m o l a r l e v e l s e n s i t i v i t y f o r s m a l l p r o t e i n d i a g n o s t i c s[J].T a l a n t a,2022,246:123469.[9]J I N E K M,C H Y L I N S K I K,F O N F A R A I,e t a l.A p r o-g r a mm a b l e d u a l-R N A-g u i d e d D N A e n d o n u c l e a s e i n a d a p-t i v e b a c t e r i a l i mm u n i t y[J].S c i e n c e,2012,337(6096): 816-821.[10]K O O N I N E V,MA K A R O V A K S,Z HA N G F.D i v e r s i-t y,c l a s s i f i c a t i o n a n d e v o l u t i o n o f C R I S P R-C a s s y s t e m s [J].C u r r O p i n M i c r o b i o l,2017,37:67-78.[11]L I J J,Y A N G S S,Z U O C,e t a l.A p p l y i n g C R I S P R-C a s12a a s a s i g n a l a m p l i f i e r t o c o n s t r u c t b i o s e n s o r s f o rN o n-D N A t a r g e t s i n u l t r a l o w c o n c e n t r a t i o n s[J].A C S S e n s,2020,5(4):970-977.[12]P A R D E E K,G R E E N A A,T A K A HA S H I M K,e t a l.R a p i d,l o w-c o s t d e t e c t i o n o f z i k a v i r u s u s i n g p r o g r a mm a-b l e b i o m o l ec u l a r c o m p o n e n t s[J].C e l l,2016,165(5):1255-1266.[13]HA J I A N R Z,B A L D E R S T O N S,T R A N T,e t a l.D e t e c-t i o n o f u n a m p l i f i e d t a r g e t g e n e s v i a C R I S P R-C a s9i mm o-b i l i z e d o n a g r a p h e n e f i e l d-e f f ec t t r a n s i s t o r[J].N a t B i-o m e d E n g,2019,3(6):427-437.[14]C H E N J S,M A E B,H A R R I N G T O N L B,e t a l.C R I S P R-C a s12a t a r g e t b i n d i n g u n l e a s h e s i n d i s c r i m i n a t e s i n g l e-s t r a n-d e d D N a s e a c t i v i t y[J].S c i e n c e,2018,360(6387):436-439.[15]MY H R V O L D C,F R E I J E C A,G O O T E N B E R G J S,e ta l.F i e l d-d e p l o y ab l e v i r a l d i a g n o s t ic s u s i n g C R I S P R-C a s13[J].S c i e n c e,2018,360(6387):444-448.[16]R O D R I G U E Z N M,WO N G W S,L I U L N,e t a l.A f u l l y i n-t e g r a t e d p a p e r f l u i d i c m o l e c u l a r d i a g n o s t i c c h i p f o r t h e e x t r a c-t i o n,a m p l i f i c a t i o n,a n d d e t e c t i o n o f n u c l e i c a c i d s f r o m c l i n i c a l s a m p l e s[J].L a b C h i p,2016,16(4):753-763.[17]W A N G B,W A N G R,W A N G D Q,e t a l.C a s12a V D e t:aC R I S P R/C a s12a-B a s e d p l a t f o r m f o r r a p i d a n d v i s u a l n u c l e i ca c i d d e t e c t i o n[J].A n a l C h e m,2019,91(19):12156-12161.[18]J O U N G J,L A D HA A,S A I T O M,e t a l.D e t e c t i o n o fS A R S-C o V-2w i t h S H E R L O C K o n e-p o t t e s t i n g[J].NE n g l J M e d,2020,383(15):1492-1494.[19]D I N G X,Y I N K,L I Z Y,e t a l.U l t r a s e n s i t i v e a n d v i s u a ld e t e c t i o n o f S A R S-C o V-2u s i n g a l l-i n-o n e d u a l C R I S P R-C a s12a a s s a y[J].N a t C o mm u n,2020,11(1):4711.[20]T I A N T,S HU B W,J I A N G Y Z,e t a l.A n u l t r a l o c a l i z e dC a s13a a s s a y e n a b l e s u n i v e r s a l a n d n u c l e i c a c i d a m p l i f i c a-t i o n-f r e e s i n g l e-m o l e c u l e R N A d i a g n o s t i c s[J].A C S N a n o,2021,15(1):1167-1178.[21]F O Z O U N I P,S O N S,DÍA Z D E L E N D E R B Y M,e t a l.A m p l i f i c a t i o n-f r e e d e t e c t i o n o f S A R S-C o V-2w i t hC R I S P R-C a s13a a n d m o b i l e p h o n e m i c r o s c o p y[J].C e l l, 2021,184(2):323-333.(下转第717页)㊃196㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5e t a l.T h e p r e d i c t i v e v a l u e of t h r o m b o e l a s t og r a m i n th e e-v a l u a ti o n o f p a t i e n t s w i t h s u s p e c t e d a c u t e v e n o u s t h r o m-b o e m b o l i s m[J].Ac t a H a e m a t o l,2020,143(3):272-278.[8]B R OWN W,L U N A T I M,MA C E R O L I M,e t a l.A b i l i t y o f T h r o m b o e l a s t o g r a p h y t o d e t e c t h y p e r c o a g u l a b i l i t y:a s y s t e m a t i c r e v i e w a n d m e t a-a n a l y s i s[J].J O r t h o p T r a u-m a,2020,34(6):278-286.[9]V A N HA R E N R M,T HO R S O N C M,V A L L E E J,e ta l.H y p e r c o a g u l ab i l i t y a f t e r b u r n i n j u r y[J].J T r a u m a A-c u t e C a r e S u r g,2013,75(1):37-43.[10]L L O Y D-D O N A L D P,V A S U D E V A N A,A N G U S P,e t a l.C o a g u l a t i o n i n a c u t e l y i l l p a t i e n t s w i t h s e v e r e c h r o n i c l i v-e r d i s e a s e:i n s i g h t sf r o m t h r o m b o e l a s t og r a ph y[J].J C ri tC a r e,2017,38:215-224.[11]F A N D,O U Y A N G Z,Y I N G Y,e t a l.T h r o m b o e l a s t o g r a-p h y f o r t h e p r e v e n t i o n o f p e r i o p e r a t i v e v e n o u s t h r o m b o-e m b o l i s m i n o r t h o p e d i c s[J].C l i n A p p l T h r o m b H e m o s t, 2022,28:10760296221077975.[12]R Y A N M L,V A N HA R E N R M,T HO R S O N C M,e ta l.T r a u m a i n d u c e d h y p e r c o a g u l ab l i t y i n p e d i a t r ic p a t i e n t s[J].J P e d i a t r S u r g,2014,49(8):1295-1299. [13]S C H E R E R A G,WH I T E I K,S HA I K H K A,e t a l.R i s ko f d e e p v e n o u s t h r o m b o s i s i n e l e c t i v e n e u r o s u r g i c a l p r o-c e d u r e s:a p r o s p e c t i v e,d o p p l e r u l t r a s o u n d-b a s e d s t u d y i n c h i l d r e n12y e a r s o f a g e o r y o u n g e r[J].J N e u r o s u r g P e d i-a t r,2017,20(1):71-76.[14]HA R A H S H E H Y,D U F F O C,HO K M.T h r o m b o e l a s-t o g r a p h y p r e d i c t s t h r o m b o e m b o l i s m i n c r i t i c a l l y i l l c o a g-u l o p a t h i c p a t i e n t s[J].C r i t C a r e M e d,2019,47(6):826-832.[15]M E I Z O S O J P,K A R C U T S K I E C A,R A Y J J,e t a l.As i m p l i f i e d s t r a t i f i c a t i o n s y s t e m f o r v e n o u s t h r o m b o e m b o-l i s m r i s k i n s e v e r e l y i n j u r e d t r a u m a p a t i e n t s[J].J S u r g R e s,2017:138-144.[16]R I Z Z A A,R I C C I Z,P E Z Z E L L A C,e t a l.K a o l i n-a c t i v a t e d t h r o m b o e l a s t o g r a p h y a n d s t a n d a r d c o a g u l a t i o n a s s a y s i n c y a n o t i c a n d a c y a n o t i c i n f a n t s u n d e r g o i n g c o m p l e x c a r d i a c s u r g e r y:a p r o s p e c t i v e c o h o r t s t u d y[J].P a e d i a t r A n a e s t h, 2017,27(2):170-180.[17]HAWK I N S R B,R A YMO N D S L,HA R T J E S T,e t a l.R e v i e w:t h e p e r i o p e r a t i v e u s e o f t h r o m b o e l a s t o g r a p h y f o r l i v e r t r a n s p l a n t p a t i e n t s[J].T r a n s p l a n t P r o c,2018,50(10):3552-3558.[18]杨涛.儿童骨折流行病学调查[D].重庆:重庆医科大学, 2018.[19]M I R A B E L L A L,C O T O I A A,C O L A C I C C O G,e t a l.R e f e r-e n c e v a l u e sf o r c o ag u l a t i o n a s s e s s m e n t i n f u l l-t e r m n e w-b o r n s[J].M i n e r v a A n e s t e s i o l,2017,83(4):369-374.[20]S C HO T T N J,E M E R Y S P,G A R B E E C,e t a l.T h r o m-b o e l a s t o g r a p h y i n t e r m n e o n a t e s[J].J M a t e r n F e t a l N e o-n a t a l M e d,2018,31(19):2599-2604.(收稿日期:2023-09-11修回日期:2023-12-22)(上接第691页)[22]G O O T E N B E R G J S,A B U D A Y Y E H O O,K E L L N E R M J,e t a l.M u l t i p l e x e d a n d p o r t a b l e n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n p l a t f o r m w i t h C a s13,C a s12a,a n d C s m6[J].S c i e n c e, 2018,360(6387):439-444.[23]HA N J,S H I N J,L E E E S,e t a l.C a s12a/b l o c k e r D N A-b a s e d m u l t i p l e x n uc l e i c a c id de t e c t i o n s y s t e mf o r d i ag n o-s i s o fhi g h-r i s k h u m a n p a p i l l o m a v i r u s i n f e c t i o n[J].B i o-s e n s B i o e l e c t r o n,2023,232:115323.[24]A C K E R MA N C M,MY H R V O L D C,T HA K K U S G,e ta l.M a s s i v e l y m u l t i p l e x e d n u c l e i c a c i d d e t e c t i o n w i t hC a s13[J].N a t u r e,2020,582(7811):277-282.[25]Z HO U B,X U K,Z H E N G X,e t a l.A p p l i c a t i o n o f e x o-s o m e s a s l i q u i d b i o p s y i n c l i n i c a l d i a g n o s i s[J].S i g n a l T r a n s d u c t T a r g e t T h e r,2020,3;5(1):144.[26]D U A N M L,L I B Y,Z HA O Y J,e t a l.A C R I S P R/C a s12a-m e d i a t e d,D N A e x t r a c t i o n a n d a m p l i f i c a t i o n-f r e e,h i g h l y d i r e c t a n d r a p i d b i o s e n s o r f o r S a l m o n e l l a T y p h i-m u r i u m[J].B i o s e n s B i o e l e c t r o n,2023,219:114823. [27]S H E N J J,Z HO U X M,S HA N A A,e t a l.S e n s i t i v e d e-t e c t i o n o f a b a c t e r i a l p a t h o g e n u s i n g a l l o s t e r i c p r o b e-i n i t i-a t e d c a t a l y s i s a n d C R I S P R-C a s13a a m p l i f i c a t i o n r e a c t i o n[J].N a t C o mm u n,2020,11(1):267.[28]A B N O U S K,D A N E S H N M,R AM E Z A N I M,e t a l.An o v e l c o l o r i m e t r i c a p t a s e n s o r f o r u l t r a s e n s i t i v e d e t e c t i o n o f a f l a t o x i n M1b a s e d o n t h e c o m b i n a t i o n o f C R I S P R-C a s12a,r o l l i n g c i r c l e a m p l i f i c a t i o n a n d c a t a l y t i c a c t i v i t yo f G o l d n a n o p a r t i c l e s[J].A n a l C h i m A c t a,2021,1165: 338549.[29]L I U N,L I U R,Z HA N G J J.C R I S P R-C a s12a-m e d i a t e dl a b e l-f r e e e l e c t r o c h e m i c a l a p t a m e r-b a s e d s e n s o r f o r S A R S-C o V-2a n t i g e n d e t e c t i o n[J].B i o e l e c t r o c h e m i s t r y, 2022,146:108105.[30]B A R B E R K W,S H R O C K E,E L L E D G E S J.C R I S P R-b a s e d p e p t i d e l i b r a r y d i s p l a y a n d p r o g r a mm a b l e m ic r o a r-r a y s e l f-a s s e m b l y f o r r a p i d q u a n t i t a t i v e p r o t e i n b i n d i n ga s s a y s[J].M o l C e l l,2021,81(17):3650-3658..(收稿日期:2023-08-16修回日期:2023-11-08)㊃717㊃检验医学与临床2024年3月第21卷第5期 L a b M e d C l i n,M a r c h2024,V o l.21,N o.5。
病原微生物检测技术研究进展
生物技术进展 2024 年 第 14 卷 第 2 期 189 ~ 195Current Biotechnology ISSN 2095‑2341进展评述Reviews病原微生物检测技术研究进展张春雷上海伯杰医疗科技股份有限公司，上海 201401摘 要：随着新兴技术的不断发展，传感器和人工智能技术的应用让病原体检测更加便捷、快速和准确。
然而，目前对于传感器和人工智能技术在病原体检测中的综合应用研究尚比较缺乏。
对病原体检测技术进行了综述，包括传统的培养技术、分子检测技术和免疫检测技术，重点总结了基于传感器和人工智能图像识别技术的病原体检测方法，并介绍了它们各自的优势和特点，以期更清晰地了解各种病原体检测技术的优势，把握未来病原体检测技术的发展方向。
关键词：病原体；分子检测；免疫检测；传感器；图像识别；人工智能DOI ：10.19586/j.20952341.2023.0120 中图分类号：Q93-332 文献标志码：APathogens Detection Technology: A ReviewZHANG ChunleiShanghai BioGerm Medical Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201401， ChinaAbstract ：With the continuous development of emerging technologies ， the application of sensor technology and artificial intelli‐gence technology has brought convenient ， fast and accurate advantages to pathogen detection. However ， there is a lack of overall research on pathogen detection technology ， as well as a summary study on sensor technology and artificial intelligence technology. A review of pathogen detection technologies was presented ， including traditional cultivation techniques ， molecular detec‐tion techniques ， and immune detection techniques. The focus was on summarizing pathogen detection methods based on sensors and artificial intelligence image recognition techniques ， and introducing their respective advantages and characteristics ， in orderto gain a clearer understanding of the advantages of various pathogen detection technologies and to gain an understanding of the future development direction of pathogen detection technologies.Key words ：pathogens ； molecular detection ； immunodetection ； sensor ； image recognition ； artificial intelligence感染性疾病是由病原微生物引起的一类具有传染性的疾病，其发病率较高且致病微生物和寄生虫种类繁多。
基于电化学传感技术的病原微生物检测研究
基于电化学传感技术的病原微生物检测研究近年来，人们对病原微生物的检测日益重视。
传统的病原微生物检测方法通常需要耗费大量的时间、资源和人力。
因此，基于电化学传感技术的病原微生物检测技术不断发展壮大，成为最受关注的研究领域。
1、什么是电化学传感技术？电化学传感技术是利用电化学方法来监测化学反应过程或探测分析化学物质的一种技术。
该技术能够提供快速、高灵敏度、易控制和低成本等优势。
同时还可以实现即时监测和无标记检测等特点。
常见的电化学传感技术包括电化学阻抗谱、电化学交流阻抗、循环伏安法和方波伏安法等。
2、基于电化学传感技术的病原微生物检测方法基于电化学传感技术的病原微生物检测方法主要包括生物电化学传感和电化学测量两种。
2.1 生物电化学传感法生物电化学传感法即使用生物体根据与微生物的相互作用来转换信号或产生电能以进行检测。
该方法具有灵敏度高、速度快、准确性高等特点。
电化学检测可以利用来自生物传感器的信号，在短时间内快速检测病原微生物。
2.2 电化学测量法电化学测量法即在电极上引入病原微生物或其产物后，根据其在电极表面引发的电信号进行检测。
该方法直接反映了病原微生物和电化学反应之间的关系。
以银电极为例，通过表面修饰技术，很容易将银盐还原成银电极。
在细菌的氧化代谢过程中，病原微生物释放出电子，使银离子还原成银电极上的金属银。
3、电化学传感技术的优势和应用电化学传感技术作为一种高灵敏度、高选择性和快速的检测方法，在生物体系，特别是在病原微生物检测领域具有非常广泛的应用。
同时，电化学传感技术还具有无标记检测、即时监测和快速分析等优点。
3.1 优势3.1.1 灵敏度高电化学传感技术的灵敏度可以达到pM级别，甚至更高，能够在较低浓度下检测到微生物污染。
3.1.2 高选择性电化学传感技术的高选择性可以通过适当的生物分子修饰来实现。
例如，针对病原微生物的特异性受体，可以设计出高度选择性的电化学传感器。
3.1.3 高速性利用电化学传感技术，只需要最多数分钟就能快速完成分析，从而大大加快了检测的速度。
病原微生物检测方法研究进展综述
病原微生物检测方法研究进展综述作者：贺国华来源：《当代旅游（下旬）》2018年第01期摘要：目前用于病原微生物鉴定的高通量检测技术主要有多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、变性高效液相色谱分析技术、焦磷酸测序技术等，本文就这些高通量检测技术在病原微生物检测中的应用情况做一简短综述。
关键词：病原微生物；PCR技术；微生物检测一、前言目前，应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有培养法、免疫学方法、PCR技术等，这些方法可以准确、灵敏地鉴定病原微生物，但是每次只能鉴定一种或少量几个样品。
2003年SARS引起了全球性恐慌，随后禽流感爆发，接着出现猪链球菌和牛炭疽感染人类事件，以及甲型H1Nl流感病毒引起的全球流感的爆发流行，上述事件的出现对病原微生物的检测和诊断提出了更高的要求。
鉴于可引起传染病的病原体种类繁多，并且不断发生变异，如何在最短时问内对病原体进行诊断成为目前研究的重点。
高通量检测技术是近年发展起来的前沿技术，具有所需样品和试剂较少，自动化操作程度较高，快速省时、无污染、诊断结果精确等特点，很适合病原微生物的诊断与检测。
目前用于病原微生物鉴定的高通量检测技术主要有：多重PCR 技术、实时荧光定量PCR技术、变性高效液相色谱分析技术、焦磷酸测序技术和芯片技术等，本文就这些高通量检测技术在病原微生物检测中的应用情况做一综述。
二、多重PCR技术的应用刘家云等初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系，可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断。
多重PCR还常用于病原微生物分子类型鉴定和抗药性研究，Kirschberg等应用多重PCR成功鉴定了乙肝病毒的6种基因型，此种方法与聚合酶链反应——限制片段长度多态型分析法相比，更简捷、准确率更高，且便于大量标本的检测。
但多重PCR技术也存在较明显的不足：如扩增效率不高，敏感性偏低；扩增条件需要摸索与协调；可能出现引物问干扰等问题。
高通量测序在病原微生物学方面的研究进展
高通量测序在病原微生物学方面的研究进展随着高通量测序技术的广泛应用，病原微生物学的研究进入了一个全新的时代。
高通量测序技术能够快速、准确地测序大量DNA或RNA分子，为病原微生物的识别、分类以及基因组学研究提供了强有力的工具。
本文将对高通量测序在病原微生物学方面的研究进展进行探讨。
一、高通量测序在病原微生物的鉴定与分类中的应用高通量测序技术在病原微生物的鉴定与分类方面具有巨大潜力。
传统的鉴定方法往往基于生物学特性以及小分子标记物的检测，这种方法需要长时间培养细菌，且对于一些未知的病原微生物无法有效应用。
而高通量测序技术可以通过直接测序样本中的DNA或RNA，快速鉴定病原微生物，无需进行复杂的培养过程。
基于高通量测序的病原微生物鉴定与分类主要通过比对测序数据与数据库中已知的基因组序列进行比对，从而快速确定病原微生物的物种以及亚种。
通过分析样本中的测序数据，可以获得病原微生物的基因组信息，进一步研究其致病机制以及耐药性等相关特性。
例如，利用高通量测序技术可以快速检测出致病蛋白基因以及毒力基因的存在，为病原微生物的研究提供了新的手段。
二、高通量测序在病原微生物基因组学研究中的应用高通量测序技术在病原微生物基因组学研究方面发挥着重要作用。
病原微生物的基因组序列可以提供大量的信息，例如基因的组成与结构，后者可用于新毒株与变异株的溯源研究，进而为流行病学调查提供参考。
高通量测序技术可以迅速测序整个病原微生物基因组的序列，揭示其基因组结构与功能，进而研究病原微生物的遗传变异、群体进化、毒力遗传等方面的问题。
基于高通量测序的基因组学研究还可以在抗药性研究中发挥重要作用。
高通量测序技术可以快速确定病原微生物中的耐药基因、突变位点以及基因组变异等信息，为抗生素研发以及临床抗菌治疗提供理论基础。
通过高通量测序技术，可以对耐药性基因的存在与分布进行深入研究，以了解不同基因型对抗菌治疗的敏感性差异，并针对性地制定治疗方案。
病原微生物检测技术研究进展
病原微生物检测技术研究进展作者：徐梦娇高姗姗肖尧来源：《智富时代》2018年第06期【摘要】对于病原微生物的检测技术主要有常规检测、免疫学检测以及基因检测等，但由于各种检测方法均有其优缺点、检测范围以及使用领域，因此，为适应现代社会对检测病原微生物的要求，必须加强对病原微生物检测技术的研究、创新，在实际工作中，依据检测设备技术条件，综合考量各自检测方法，以选取检测效果较好的方法。
文章主要对各种病原微生物检测技术进行分析。
【关键词】病原微生物；检测技术；研究进展病原微生物主要指对人和动物存在致病性的各类微生物，包括细菌、病毒、真菌、放线菌、螺旋体、朊粒、立克次体、支原体、衣原体等。
病原微生物会影响食品以及水源的安全，人和动物感染病原微生物以后，会出现过敏反应或者痴呆、肿瘤等多种疾病。
随着现代检验技术的不断发展，病原微生物检测技术也得到了发展，从常规检测发展到免疫学检测技术、基因检测技术等，并广泛用于医疗、疾控、食品安全检验等方面。
一、病原微生物常规检测方法（一）涂片镜检法在染色和形态上具有明显特征的病原微生物适合使用涂片镜检法进行检测。
例如，白喉棒状杆菌、葡萄球菌或结核分枝杆菌等引起感染性疾病的病原微生物，经过适当处理，将标本置于显微镜下检测，分别呈现有异染颗粒的棒状杆菌、革兰阳性葡萄串状球菌以及抗酸性细长杆菌等；对于粪便中的霍乱弧菌和志贺菌等，也可通过涂片镜检法，在荧光显微镜下进行快速检测。
应用涂片镜检法进行病原微生物检测时，只需要革兰染色液和普通光学显微镜，是各类微生物检测实验室的常用检测方法。
（二）组织细胞培养检测法及生物化学试验组织细胞培养检测法适用于组织细胞内生存的病原体，例如病毒、立克次体以及衣原体等。
由于不同的病原体其组织敏感细胞也有差异，因此，可以从病原体敏感的动物组织中，提取活细胞于体外实施原代培养，或者实施传代培养，并将病原体接种到相应的组织细胞内，使病原体在细胞中进行繁殖增长，从而使特异性的细胞产生病变反应；还可以通过直接在敏感动物体内接种病原体，使相应的组织器官出现特异性的病理变化，从而根据出现的特异性病变鉴定病原体。
高通量测序在病原微生物学方面的研究进展
高通量测序在病原微生物学方面的研究进展引言：近年来，高通量测序技术的快速发展和广泛应用，为病原微生物学研究带来了革命性的突破。
通过高通量测序，人们可以更深入地了解病原微生物的基因组结构、功能以及进化规律，为疾病的预防、诊断和治疗提供了重要的科学依据。
本文将从病原微生物的基因组学、菌群组成与疾病关联、抗菌耐药性以及疫苗研发等方面，介绍高通量测序在病原微生物学方面的研究进展。
一、病原微生物基因组学的突破高通量测序技术的问世，为病原微生物基因组学研究提供了极大的便利。
传统的基因测序方法主要是采用Sanger测序技术，费时费力且成本较高。
而高通量测序技术，如Illumina测序平台，具有高效、高通量和低成本的特点，大大加快了病原微生物基因组的测序速度。
通过高通量测序，研究人员可以对各种病原微生物的基因组进行全面的分析。
首先，利用高通量测序技术，可以确定病原微生物的基因组序列，揭示其遗传信息和基因组结构。
其次，通过对多个病原微生物株系的基因组测序，并结合比较基因组学的方法，可以鉴定出致病基因和毒力因子，进一步揭示病原微生物的致病机制。
二、菌群组成与疾病关联的研究进展除了研究单一病原微生物的基因组，高通量测序技术还可以对复杂菌群的组成进行深入研究。
人体内存在着大量的共生微生物群落，这些微生物与宿主密切相关，对宿主的生理功能和健康状态产生重要影响。
通过高通量测序技术，可以对这些微生物群落的组成和功能进行全面的分析。
近年来，研究人员发现菌群组成的失衡与多种疾病的发生和发展密切相关。
例如，肠道菌群的失调与肠道炎症性疾病、肠道肿瘤等疾病的发生有关；皮肤菌群的失衡则可能导致皮肤病的发展。
通过高通量测序技术，可以对不同疾病患者和健康人群的菌群组成进行比较，从而揭示菌群组成与疾病之间的关联。
三、抗菌耐药性的研究进展抗菌耐药性是当今医学面临的重要挑战之一。
高通量测序技术的应用，为抗菌耐药性的研究提供了新的途径。
通过高通量测序技术，可以对抗生素耐药基因的突变和传播进行快速检测和分析。
微生物学的现代研究进展和应用
微生物學的現代研究進展和應用微生物学是研究微观生命体的学科，它包括单细胞生物（细菌、真菌）和病毒。
近年来，微生物学的现代研究取得了飞跃性进展，关于微生物世界的认识进一步深化，相应的微生物学应用也有了广泛的发展。
本文将着重介绍微生物学的现代研究进展和应用。
一、新型病菌分离和诊断随着生活水平的提高，人们的生活方式和环境发生了大量的改变，为病原微生物的繁殖、分布和传播提供了条件。
新型病菌的发现和诊断成为其中一项重要挑战。
基于PCR (聚合酶链反应) 技术和序列比对，医学科学家们对病原体的检测和监控能力得到了极大提升。
在近期的 COVID-19 疫情中，精确、快速检测并隔离感染者显得至关重要。
二、微生物交互、环境和进化微生物之间相互影响和与环境的相互作用，是微生物学研究的主要方向之一。
不同种类的微生物之间相互作用既可以是竞争，也可以是互惠互利的合作关系。
通过对微生物间相互作用的深入研究，我们可以识别出特殊作用的微生物对我们的生态环境具有重要的作用。
此外，微生物的进化和遗传演化，也成为微生物学研究的重要内容之一。
通过对微生物基因的全基因组测序分析，人类对微生物的进化和适应过程理解更进一步。
三、微生物的发酵过程基于微生物的发酵过程已经成为一种重要的产业链。
例如，乳制品中的酸奶、干酪等；与食品相关的食醋、酱油、啤酒等；生物燃料生产的甲烷、乙醇等。
微生物的发酵过程在解决能源和食品问题中可谓功不可没。
四、微生物的药物研究和开发微生物药物研究和开发在医学领域中也起到了重要作用。
例如，在目前的抗菌素中，很多是来源于微生物。
微生物中的生产各种自然物质，其中包括激素、酶、抗生素、菌藻色素等，具有广泛的临床应用前景。
随着抗生素抵抗力的日益严重，寻找新的微生物药物也成为当前研究的热点之一。
五、微生物学在环境科学中的应用微生物学在环境科学中的应用包括环境中微生物群落的分离和鉴定、微生物生物修复和防治疾病的应用等。
例如，废气氧化和毒性的降解、污水处理中对细菌群落的研究等，都需要微生物学研究的支持。
微生物快速检测方法及应用进展
微生物快速检测方法及应用进展引言随着人类对生物学研究的不断深入，微生物在生物学和医学领域中的重要性得到了越来越多的认可。
不过，传统的微生物检测方法通常需要耗费数天的时间来进行培养和鉴定，这限制了微生物检测在临床和生产中的应用。
因此，发展快速、准确和可靠的微生物检测方法对于促进微生物学和相关领域的发展至关重要。
本文将介绍目前微生物快速检测的主要方法以及相关应用进展。
常见的微生物检测方法传统的微生物检测方法传统的微生物检测方法主要包括培养方法、镜检法和生化鉴定法。
这些方法耗费时间长、技术难度高，需要经验丰富的操作人员才能够保证检测结果的准确性。
•培养方法：利用不同的培养基和培养条件来培养需要检测的微生物，通过菌落形态、生理和生化特性等进行鉴定。
但这种方法需要耗费时间长、耗能和培养基等精细化配置。
•镜检法：通过直接观察或染色后观察微生物，并对其形态、染色性状等进行判断。
然而，这种方法的准确性往往受到操作人员的影响较大。
•生化鉴定法：基于微生物分解特定化学元素的反应来进行鉴定。
该方法有着较高的准确性和可靠性，但是却需要多次的培养和处理，耗费时间较长。
新型的微生物检测方法为解决传统微生物检测方法中的问题，越来越多的研究者开始开发一些新型的微生物检测方法，包括 PCR、免疫诊断、生物传感器、质谱分析等。
•PCR PCR（聚合酶链式反应）是一种以DNA为目标分子、通过逐步扩增目标序列为特征的技术。
利用反向引物与待扩增DNA链的特异性连接，确定扩增所需的起始热变性。
在扩增过程中，产生的DNA片段可利用凝胶电泳或是其他方法进行检测。
由于PCR技术操作简单、灵敏度高，已成为现代分子生物学研究领域的必备手段。
而且，PCR技术也逐渐应用于微生物检测领域，以检测微生物DNA、RNA等。
•免疫诊断免疫诊断检测法是利用抗原与其相应的特异性抗体之间反应的特性，通过荧光、发光、放射性同位素、酶、生物素等标记对该反应产物进行检测的一种检测技术。
食品病原微生物分子检测技术研究进展
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检 测方法 （ 细菌培养 、 生化鉴 定、 血清分型 等） 比， 相 基
物化学技术 ， 如利用培 养基方法根 据菌落特性 和 生化 反应特 点进行检测 ， 些方法都 能定量或 定性分析 病 这
家蚕病原微生物检测诊断研究进展
产生 的伴孢 晶 体 占 内毒 素 引起 的 ， 见 于 ５龄 一 常
蚕， 主要 为 急性 。
国进 境 动物二 类传 染病 。家 蚕微孢 子虫 是专 性寄
生 于家 蚕 的微 孢子 虫 ， 也是 Ｎｏ ｅ ｓｍａ属微 孢 子 虫 的代 表 种之一 ， 被归 于真 菌类 的“ 现 古怪 ”寄 生虫 （ｄ ａａ ｉ ｓ［ ５。 由于 其 特殊 的经 卵 传 染 方 ｏ ｄｐ ｒｓ ｅ ）２ ］ ｔ － 式， 对蚕 业生 产尤其 是蚕 种 生产造 成严 重危 害 。
意 义 ｌ ｌ。 １ 家 蚕 病 原 种 类 １ １ 微 粒 子 ．
１３ 细菌病 ．
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常见 的败血 病 有黑 胸 败 血 病 ， 由芽 孢杆 菌 是 属黑胸 败血 病菌 （ ａ ｉ ｕ ） 起 而发 病 ， Ｂ ｃ ｌｓ ｐ． 引 ｌ ｓ 尸体 胸部及 腹 部 １ —３环节 出现 墨绿色 的尸 斑 ； 菌败 灵 血病 ， 由粘 质沙 雷 氏菌 （ ｅｒ ｔ ｒｅｃｎ ） 是 Ｓ ｒａｉ ｍａ ｃｓ ｓ 引 ａ ｅ
６
北方蚕业 ２１． （） ０１ ２ ３４
・综
述 ・
家 蚕 病 原 微 生 物 检 测 诊 断研 究 进 展
周洪英 孙 波 吴洪丽 吴 恢 胡兴明
（ 北省农业科学院经济作物研究所 。 汉 湖 武
摘
４０ ６） ３ ０ ４
要 简述 了 家蚕 病 原 微 生 物 主 要 种 类 ， 并从 传 统 镜 检 、 疫 学 和 分 子 生 物 学 三 个 方 面 ， 绍 了 已 用 于 家蚕 免 介
子 虫 （ ｓｍａｂｍｂ ｃｓ Ｎ．６ 寄 生而 引起 ， Ｎｏｅ ｏ ｙ ｉ， ） 是一
病原微生物分子分型技术研究进展(一)
病原微生物分子分型技术研究进展(一)现代分子分型技术主要包括质粒DNA图谱分析、限制性内切酶消化后的染色体DNA分析、核酸探针杂交、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR和多位点序列分析(MLST)技术。
DNA重复序列PCR技术(Rep-PCR)的实用性强、低用费、可再现性好，可用来进行普查工作。
PFGE技术分辨力高，是病原微生物分子分型的最佳选择。
而有更高分辨力和再现力的MLST新技术正在逐渐被使用。
这些分子分型技术将有助于在全球范围内进行病原微生物流行病学研究。
本文对近年来常用的病原微生物分子分型技术的研究进展作一综述。
1评估分型技术标准的可行性评估一项分型技术是否可行的标准有2个：完成标准(有效性)和便利标准(效率性)。
完成标准包括分型能力、分辨力和分型技术间的一致性，而便利标准包括通用性、快捷性、解释和执行的容易程度。
一项分型技术的分型能力意味着通过这项分型技术，分离株被划分为所属类型的比例。
再现性是指通过这种技术对同种样品在重复检测时，产生相同结果的能力。
分辨力是指拥有一致的或非常相似的相关图谱的分离株事实上具有相同的传播途径的可能性。
2种分型技术的一致性通过使用这些技术把高度相似的分类株分组归类而被评价〔1，2〕。
因此，对一种分型技术来说首选标准是有效性〔3〕。
当应用于细菌病原菌时，一种分型技术必须要有效率性优点。
通用性就是用于任何病原菌的能力，这对于医源性病原菌感染的研究是一个非常重要的优点。
操作和解释结果的容易度以及所需费用、试剂和仪器的可行性都是选择一项分型技术的重要标准〔2-4〕。
2现代分子分型技术质粒DNA图谱分型技术细菌质粒分析是较早被使用的对病原微生物流行病学进行调查的分子分型技术〔4〕。
这种技术包括萃取质粒DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA。
这是一种容易操作和理解的技术。
由于不同菌株质粒DNA序列和大小不同，通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA质粒图谱也将不同，因此，与流行病相关的分离株能够被分类分型。
病原微生物的检测及诊断技术的进展
病原微生物的检测及诊断技术的进展病原微生物是引起人类大量传染病的主要原因，检测及诊断病原微生物是保障人类健康的主要手段之一。
近年来，随着科技的发展和生物学研究的深入，病原微生物的检测及诊断技术得到了快速的发展。
本文将从检测和诊断两个方面来探讨病原微生物的检测及诊断技术的进展。
一、病原微生物的检测技术的进展1.基因检测技术基因检测技术是经过不断改进和发展的一种新型病原检测技术。
这种技术通过在样本中检测特定DNA或RNA序列的存在来识别感染病原微生物的种类。
由于其高敏感度、高特异性、高速度、高准确度等优势，已经成为了现代病原微生物检测的主要手段之一。
目前，常用的基因检测技术包括聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光PCR、逆转录PCR、DNA芯片等。
2.胶体金检测技术胶体金检测技术是一种无标记的免疫检测方法。
该方法利用胶体金团簇的形成来判断样品中是否存在病原微生物。
与传统免疫检测方法相比，其敏感度和特异性都更高，并且不需要特殊的设备和复杂的试剂盒。
该技术适用于诊断多种病原微生物感染，包括病毒、细菌、真菌等。
3.质谱分析技术质谱分析技术是一种新型的病原微生物检测技术。
该技术利用质谱仪来测定样品中的化学物质分子量和相对丰度，从而确定样品中是否存在病原微生物。
质谱分析技术在病原微生物检测中，具有速度快、准确度高等优势，并且可以同时检测多种病原微生物。
二、病原微生物的诊断技术的进展1.体外诊断技术体外诊断技术是一种常规的病原微生物诊断技术。
该技术主要包括血清学诊断、转录组分析、细胞培养技术等。
其中，血清学诊断是一种常见的体外诊断方法，其通过检测病原微生物的抗原或抗体水平，快速、便捷地诊断病原微生物感染。
2.体内诊断技术体内诊断技术是一种新型的病原微生物诊断技术。
该技术利用生物体内的检测方法，如脑脊液检测、血液检测等，对病原微生物感染进行诊断。
这种技术的优势在于其检测结果更加客观和真实，尤其适用于复杂或难以确定病原微生物的感染。
病原微生物生态学研究新进展
病原微生物生态学研究新进展近年来，病原微生物生态学研究在相关学科里面越来越受到重视，人们发现病原体与环境的关系密切，病原体的生存和繁殖与其所处的生态环境息息相关。
病原体通过与环境的相互作用来适应生存环境并进行进化，也会受到环境因素的影响而产生适应性变化。
病原微生物生态学研究的新进展包括以下几个方面。
一、生态位理论的应用生态位是指在一个生态系统中，一种生物种群所占据的生存空间、生态需求和适应环境的方式。
病原体也具有生态位，其会受到相邻生物群落和其他环境因素的影响，合适的生态位则使得病原体生存繁衍更加稳定。
生态位理论的应用为医学上的病原微生物定位提供了一种新的视角，即不仅需要从病原体本身去寻找病因，也需要考虑病原体的生态位置及其所处的生态系统。
二、微观环境下的生态研究微生物常常生存在复杂的微观环境中，包括土壤、水、沉积物和生物膜等。
这些独特的微观环境有助于维持病原微生物的生存和繁殖。
因此，对微观环境的研究有助于解决微生物在生态系统内的定位和分布规律。
此外，对于病原微生物的药物治疗和预防，对微观环境下的生态研究也有着重要的作用。
三、病原微生物的群落与生物多样性病原体虽然是单一的微生物，但是在同一生态系统内往往存在着多种病原体，它们之间存在竞争和共生关系。
此外，病原体也与其他生物的关系密切相关，比如某些寄生虫只能寄生在特定的宿主体内，与宿主之间存在共进化关系。
因此，病原体的生态位和生态适应性不能独立于所处的生物群落和生态系统。
生物多样性与疾病爆发之间的关系也受到了越来越多的关注，而了解生态位对病原体的影响实现可持续发展可能会有益于对许多传染病的管理和控制。
四、宏观尺度的研究宏观尺度的病原体生态学研究关注的是病原体在大的生态系统中的分布和生态功能，包括疾病流行情况、全球范围内的物种多样性、生态系统健康状况等。
这方面的研究对于了解病原体与环境的关系及其对生物多样性和环境健康的影响具有重要意义。
病原微生物生态学研究的新进展，在提高疾病管理和治疗水平，掌握疾病流行规律方面具有重要的意义。
微生物和病原微生物学的新进展和新技术的应用和发展
微生物和病原微生物学的新进展和新技术的应用和发展微生物学是研究微生物的科学。
它探究的对象是非常小、单细胞或单细胞类生物体群体所构成的微生物世界。
微生物包括细菌、真菌、病毒和原生动物等等。
病原微生物学是微生物学的一个分支，研究的是有害微生物，如细菌、病毒、真菌、寄生虫等，它们会引起人体或动物的感染。
随着科技的发展，微生物学和病原微生物学也在不断进步。
我们可以看到，在这个领域里新的进展和技术的应用正在推动微生物学和病原微生物学的发展。
一、新进展1. 新的发现最近的研究表明，在传统意义上认为没有细胞核的原核生物中，确实存在着一种类似于细胞核的有机体结构，即"Nucleus-like Structures"（NLS）。
科学家发现，NLS具有类似细胞核的跨膜与线粒体的氧化出单电子还原物质，这些结构的共同点表明，细胞核和NLS在生命起源过程中具有相似的历史，并在进化过程中各自发展了不同的功能。
同时，在病原微生物学方面，科学家们发现细菌感染鱼类的机制与人类感染机制有很多相似之处，这为研究人类病原微生物提供了新的思路。
2. 新的理论"新菌基因"（novelty genes）是一个新的理论，近年来越来越受到微生物学家的重视。
它们是指基因组中不同于已知序列的长基因，是由未知蛋白质编码产生的。
随着技术的发展，这个领域正在不断扩大。
1995年，第一次发现一种含有大量新菌基因的病原菌---耶尔森氏菌（Yersinia pestis）。
科学家通过分析这些基因，发现新菌基因可以大幅度增强耶尔森氏菌对人体的侵袭能力。
这个发现为人们了解病原体的侵染机制和控制疾病提供了新的线索。
二、新技术1. 基因测序技术基因测序技术是微生物学研究的基础。
目前，第三代测序技术比第二代测序技术更快、更准确、更便宜。
熟知的是，病毒基因序列的测定是在第一代测序技术的基础上进行的，而手段则是第二代测序技术。
现在牢固在微生物学中的技术是第三代测序技术。
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病原微生物的检测方法研究进展
摘要：本文章主要对病原微生物的检测方法研究进展进行综述，具体介绍食品、环境方面的病原微生物的检测方法研究进展。
以及本人对病原微生物检测方法发展的一些看法及体会。
关键词：病原微生物检测方法PCR技术食品检测
Abstract: This article mainly summarized research progress on detection methods of
pathogenic microorganism，Specific introduction food, environment research progress of methods used for the detection of pathogenic microorganisms. And I have some views on the development of pathogenic microorganism detection method and experience
Key words: Pathogenic microorganisms Detection method PCR technology Food testing
病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。
病原体中，以细菌和病毒的危害性最大。
病原微生物指朊毒体、寄生虫（原虫、蠕虫、医学昆虫）、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。
本文主要介绍的是在食品、环境、医药方面病原微生物检测方法的应用及研究，目的在于了解病原微生物的检测方法及其研究进展，增加生物学科普知识。
1病原微生物概述
1.1 病原微生物概念
病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。
病原体中，以细菌和病毒的危害性最大。
病原微生物指朊毒体、寄生虫（原虫、蠕虫、医学昆虫）、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。
1.2 病原微生物检测方法
病原微生物的检测方法包括以下几类：1）生物化学方法2）血清免疫学方法3）分子生物学方法4）分子生物学与免疫学相结合的方法5）用生物传感器进行病原微生物的鉴定6）生物芯片7）蛋白质指纹图谱技术8）LANP技术
2病原微生物的检测方法在食品方面的应用及研究进展
食品病原微生物传统检验方法步骤非常繁琐，需要耗费大量人力、物力，且检测周期长灵敏度较低，难以满足国内外对食品检测的要求。
这里介绍几种效益高且易操作现代食品病原微生物的检测方法。
2.1 微生物培养法
微生物快速检测方法始于80年代早期，主要根据各种菌体的理化特性进行分析。
而后不断出现改进方法，通过加入抑制剂、指标剂或者荧光物质等或借助快速的预处理方法缩短增菌时间，合并检验步骤，使培养和鉴定一步完成，从而达到快速检测的目的。
常用的检测方法有1）疏水网膜法2）葡萄糖苷酶荧光法3）Oxoid沙门氏菌快速检测法。
微生物培养法是食品检测中较常用切简单易行的食品检测方法。
2.2 免疫学方法
免疫学法在食品检测中应用最为广泛，此技术是以抗原抗体的特异性反应为基础，通过病原物刺激机体产生免疫球蛋白建立的。
根据检测技术的不同可分为免疫扩散法、凝集反应、酶联免疫吸附法和探针检测法。
免疫学方法具有高度的特异性和灵敏性，且易操作，价格便宜，所以在食品的检测中是最为常用的方法。
2.3 分子生物学方法
分子生物学方法可针对病原微生物的核酸分子特征进行鉴定。
主要分为3种：1）核酸分子杂交2）基因重组法3）PCR技术。
核酸分子杂交是有特异探针识别特异碱基序列实现杂交；基因重组法无需对待测菌株进行纯培养，而且无需什么特殊的试剂和设备简便易行，所以是一种很有前途的食品鉴定方法。
PCP技术是一种核酸体外扩增技术，该方法灵敏度高，效果好，往往在很短时间内就能检测出食品中的病原微生物。
3病原微生物的检测方法在环境方面的应用及研究进展（主要介绍水环境）
当今水污染隐患令人担忧，世界卫生组织估计全球约有88%腹泻类疾病是由饮用水被病原微生物污染引起的。
饮用含有病原微生物的水可以引发多种疾病，如霍乱、军团菌病、肺炎等等。
1993年美国密尔沃基市因为应用水中包含隐孢子虫菌导致100人死亡。
所以水污染的防治与检测迫在眉睫！下面是目前比较前沿的检测水污染的方法。
3.1 聚合酶链反应技术(PCR技术)
PCR技术是当今较流行的分子检测技术。
虽然PCR检测技术应用广泛，但是缺点是稳定性差，容易产生非特异性产物且水体出现假阳性现象较高。
所以目前出现了很多改进的PCR 技术，缩小其缺点，使其可信度变高，特异性更好。
以下是利用相关PCR技术对水中病原微生物的报道，见表1
3.2 RPA检测技术（Rationmetricpre-rRNA
analysis,RPA）
PCR检测方法缺点很明显，稳定性差，容易产生非特异性产物。
检测水体假阳性的概率相当高，可信度不高。
RPA检测技术与PCR检测技术相比，RPA用于检测细菌在受到营养刺激后pre-rRNA的变化情况从而检测水中活的病原株。
减少PCR检测技术中假阳性的干扰。
同时该方法也避免了了由于试验过程中引入的DNA污染或者由于PCR试剂造成的污染的影响。
3.3 DNA芯片检测技术
DNA芯片检测水中病原微生物是生物技术检测法中的新突破。
DNA芯片也称DNA微阵列，是利用机械系统将DNA探针阵列分布于玻璃或硅基片上形成多个点，可在同一时间对大量样品进行高通量分析的技术。
利用此技术检测水污染的流程图见图 1 芯片检测法的最
大优点是快速，特别是是在水源处可能污染的情况下，尽快得到检测结果尤为重要。
4本人的对病原微生物检测方法研究进展的一些看法及体会
病原微生物对我们人类的危害极大，检测与防治病原微生物是一项重要的任务。
所以我认为对于病原微生物的检测方法的研究应被鼓励，在未来希望有更优秀的检测方法出现，帮助人类去认识并且消灭病原微生物，让人类远离病原微生物的侵害，使人们的生活更加和谐与健康。
参考文献
矢野郁也内山竹彦病原微生物学M 东京化学同人2002年8月
李淑英李燕水中病原微生物分子检测技术研究进展J 生物技术通报2012年第一期
王辉张伟食品中病原微生物快速检测技术与研究进展J 食品研究与开发期刊2012年
第4期
宋宏新马娜食品中病原微生物检测方法研究进展J 生物技术通报2010年第4期
汪长中吴璇病原微生物检测技术进展M 安徽医药2013年3月
李维彬郭从文病原微生物检测技术研究进展J 生物技术通报2006年7月。