microRNA反转和定量引物设计原理、实验方法

microRNA的引物设计

以ssc-miR-222-3p为例设计引物，其成熟体序列为：AGCTACATCTGGCTACTGGGTCT

反向引物：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环，

固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，

在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是ssc-miR-222-3p从后面数八个碱基的反向互补序列，就是CTGGGTCT的反向互补：AGACCCAG ，最后得到的反向引物的序列为

5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGACCCAG -3，

正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG

在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：AGCTACATCTGGCTACT

5，-ACACTCCAGCTGGG AGCTACATCTGGCTACT -3，

URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG

U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT

使用方法：

1逆转的引物：所有要做的miRNA反向引物的混合，每个10微升

2PCR的引物：50微升的体系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP

2．hsa-miR-124（hsmq-0032 引物）

推荐退火温度：60℃

hsa-miR-124 扩增曲线示意图hsa-miR-124 融解曲线示意图

3．hsa-miR-125b(hsmq-0034 引物)

推荐退火温度：60℃

hsa-miR-125b 扩增曲线示意图hsa-miR-125b 融解曲线示意图

4．hsa-miR-137(hsmq-0035 引物)

推荐退火温度：60℃

hsa-miR-137 扩增曲线示意图hsa-miR-137 融解曲线示意图

5．hsnRNA U6 引物测试

推荐退火温度：60℃

hsnRNA U6 扩增曲线示意图hsnRNA U6 融解曲线示意图

6. 电泳结果

取5μl PCR 产物进行电泳,胶浓度（3％）,所有检测都为两个阳性,一个NTC

其中泳道1 为hsa-miR-16、泳道2 为hsa-miR-124、泳道3 为hsa-miR-125b、泳道4 为

hsa-miR-137、泳道5 为hsnRNA-U6[img]