番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究
番茄灰霉病菌抗药性及抗药性控制研究的开题报告
番茄灰霉病菌抗药性及抗药性控制研究的开题报告题目：番茄灰霉病菌抗药性及抗药性控制研究一、研究背景和意义番茄灰霉病是一种广泛分布的病害，能够在番茄等多种植物上引起严重危害。
目前，化学防治是控制番茄灰霉病的主要方法。
然而，由于长期使用同一种或同一类杀菌剂，导致灰霉病菌产生抗药性，致使防治效果下降，增加了防治的难度。
因此，为了有效控制番茄灰霉病，研究番茄灰霉病菌的抗药性及抗药性的控制方法，具有重要的理论和现实意义。
这有利于优化防治措施，提高生产效益，降低防治成本，促进农业可持续发展。
二、研究内容和方法1.研究内容(1) 番茄灰霉病菌抗药性鉴定：从不同地区的灰霉病菌分离出不少于50份菌株，通过测定这些菌株的对不同杀菌剂的敏感度，探究灰霉病菌的抗药性状况。
(2) 分析抗药性形成的原因：通过比较不同抗药菌株与不易产生抗药性菌株在基因组中的差异，探索灰霉病菌抗药性形成的原因。
(3) 探究灰霉病菌的生物学特性：测定菌株的产孢量、侵染速度等指标，探究灰霉病菌不同药敏菌株的生物学特性与对药剂的抗性之间的相关性。
(4) 研究抗药性控制方法：通过筛选有效的抗菌剂或者结合化学药剂与生物剂（如拮抗菌）的联合使用，探究抗菌剂抗药性的控制方法。
2.研究方法(1) 分离纯化灰霉病菌菌株，并进行药效测定。
(2) 利用PCR扩增灰霉病菌抗药相关基因，并比较抗药菌株与不易产生抗药性菌株在基因组中的差异。
(3) 测定菌株的产孢量、侵染速度等指标，探究灰霉病菌不同药敏菌株的生物学特性。
(4) 筛选和测试抗菌剂或者结合化学药剂与生物剂（如拮抗菌）的联合使用，探究抗菌剂抗药性的控制方法。
三、预期研究结果(1) 建立灰霉病菌抗药性鉴定的实验方法。
(2) 筛选出具有控制灰霉病菌抗药性的有效药剂。
(3) 揭示灰霉病菌抗药性的形成机制，为后续的抗药性控制提供理论依据。
(4) 探究灰霉病菌生物学特性与对药剂抗性之间的相关性，利用这一结论建立更为科学的灰霉病防治策略。
番茄灰霉病菌拮抗稀有放线菌的分离及其抑菌物质分析
active substances were perform ed bet*ween the aseptic ferm entation brotii of strains witii significant antifun
gal activity. T he antifungal
products from fermentation brotii of rare actinomycetes were identi
resolution flight mass spectrom etry. T he results showed that 13 antifungal actinom ycetes were isolated.
S A 3 2 ，S A 3 3 ，S A 3 7 ，S A 3 9 ，SA45 and SA51 had antagonistic effects against tiie growtii and spore germ ina
采 自 辽 宁 各 地 的 放 线 菌 中 筛 选 植 物 病 原 真 菌 拮 抗 放 线 菌 ，通 过 孢 子 萌 发 生 长 法 和 系 统 发 育 树 分 析
番 茶 灰 霉 病 菌 拮 抗 放 线 菌 的 抑 菌 活 性 和 分 类 地 位 ，测 试 高 抑 菌 活 性 菌 株 无 菌 发 酵 液 活 性 物 质 的 稳
ty. T he antifungal activityand taxonomic status of antagonistic actinom ycetes against Botrytis cinerea were
analyzed by spore
germination metiiod and phylogenetic tree construction. Comparison
番茄灰霉病拮抗菌B26抑菌蛋白的分离纯化与鉴定
2 结果与分析
2. 1 硫酸铵敏感性测定 B2 6菌 株发 酵菌 液的 上清 液经 硫 酸铵 处 理后 对
灰霉病菌不表现抑菌活性, 沉淀溶解液对灰霉病菌 却有较强的抑菌作用, 并且活性显著强于硫酸铵沉 淀前的菌液上清 液原液。这说明 B26菌株 培养液 产生的 抗 菌物 质可 以 通过 硫 酸铵 沉 淀 得以 浓 缩
从图 1中可以看出, 抗菌物质的抑菌活性随硫 酸铵饱和度的提高而增加, 当硫酸铵饱和度提高到 50% 时抑菌活性达到最大值, 以后再增加硫酸铵的 浓度时抑菌活性下降, 说明该抗菌物质用 50% 饱和 度的硫酸铵沉淀效果最好。
2. 2 抑菌蛋白的分离纯化 2. 2. 1 DEAE- 纤维素 ( DEAE - 52) 离子交换层析 分步洗脱并配合核酸蛋白质检测仪在 280 nm 的波
) 98 )
江苏农业科学 2008年第 5期
长下检测结果显示, 在 280 nm 波长下共有 3个蛋白 洗脱峰出现, 分别为 0、0. 3、0. 6 m ol /L NaC l的洗脱 液洗脱出来的。收集各个洗脱峰脱盐并检测其抑菌 活性, 结果表明, 只有 0. 3 m o l/L NaC l洗脱液洗脱出 来的蛋白具有抑菌活性 (图 2) 。
(表 1)。
表 1 B26 培养液的硫酸铵沉淀溶解液对灰霉病菌的拮抗性能
处理
50% ( NH4 ) 2 SO4 沉淀后上清液 50% ( NH4 ) 2 SO4 沉淀的溶解液
对照 ( CK)
对灰霉病菌的拮抗性能 ++ +
注: / - 0表示无拮抗作用; / + 0表示抑菌圈 直径为 20. 0 mm 左 右; / + + 0表示抑菌圈 直径 大于 20. 0 mm; 对照 为未 经 ( NH4 ) 2 SO 4 处理的菌液上清液原液。
番茄青枯病拮抗菌株的筛选、鉴定及发酵条件的优化
山西农业科学2022，50（5）：698-708Journal of Shanxi Agricultural Sciences doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2022.05.13doi番茄青枯病拮抗菌株的筛选、鉴定及发酵条件的优化卢晓虹，许敏，李甜爽，刘海霞，王美琴（山西农业大学植物保护学院，山西太谷030801）摘要：目前，对于番茄青枯病害的发生缺乏有效的预防措施，筛选和利用有益微生物是重要途径之一。
试验以番茄青枯病病原菌为靶标菌，采用稀释涂布分离法、平板对峙法从健康番茄植株根际土壤中分离筛选对青枯病菌有较好拮抗作用的菌株，结合形态学特征、生理生化特征、分子生物学方法等对其进行菌种鉴定，且采用单因素试验及正交试验方法，对拮抗菌株B-6的发酵培养液配方及发酵条件进行优化。
结果表明，从番茄青枯病重病田块的健康植株根际土壤中分离筛选到1株抑菌效果较好的细菌菌株B-6，抑菌圈直径为13.8mm；对拮抗菌株B-6进行鉴定，经16S rDNA测序并进行同源性比较得出，拮抗菌株B-6与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerugi⁃nosa strain Pa84）的16S rDNA序列相似性达到100%；优化后的最佳培养基组合为麦芽糖3%（30g）、蛋白胨1.0%（10g）、氯化钠1.0%（10g）、蒸馏水1000mL，最佳发酵条件为摇床转速180r/min、发酵时间24h、装液量100mL（规格为250mL锥形瓶）、接种量1.0%（1mL），pH值8，经发酵优化后的抑菌圈直径为16.5mm，比原抑菌圈直径增大19.6%。
研究分离筛选到的拮抗菌株B-6为1株具有开发潜力的生防菌株。
关键词：番茄青枯病；稀释涂布分离法；拮抗菌株B-6；发酵优化；单因素试验；正交试验中图分类号：S436.412.1+5文献标识码：文章编号：1002‒2481（2022）05‒0698‒11Screening and Identification of Antagonistic Strains of Tomato BacterialWilt and Optimization of Fermentation ConditionsLU Xiaohong，XU Min，LI Tianshuang，LIU Haixia，WANG Meiqin（College of Plant Protection，Shanxi Agricultural University，Taigu030801，China）Abstract：In the absence of effective preventing measures at present,screening and utilization of beneficial microorganisms is one of the important ways to prevent the occurrence of tomato bacterial wilt disease.In this paper,taking pathogen of tomato bacterial wilt disease as the target bacterium,a bacterial strain with better antibacterial effect was isolated and screened from the rhizosphere soil of healthy tomato plants by dilution separation method and plate confrontation method.By morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics,and molecular biology methods,single factor test and orthogonal test were used to optimize the fermentation medium formulation and fermentation conditions of antagonistic strain B-6.The results showed a bacterial strain B-6with excellent bacteriostatic effect was isolated and screened from the rhizosphere soil of healthy plants in fields with severe tomato bacterial wilt disease,and the diameter of the inhibition zone was13.8mm.The antagonistic strain B-6was identified.The16S rDNA sequencing and homology comparison showed that the antagonistic strain B-6was closely related to Pseudomonas aeruginosa strain Pa84.The16S rDNA sequence similarity reached100%.The optimal medium combination after optimization was as follows:3%of maltose（30g）,1.0%of peptone（10g）,1.0%of sodium chloride （10g）,1000mL of distilled water.The optimal fermentation conditions were180r/min of shaker rotation speed,24h of fermentation time,and100mL of liquid filling volume（the specification was a250mL conical flask）,1.0%of inoculation volume（1mL）,and the pH value was8.The diameter of the inhibition zone after fermentation optimization was16.5mm, which was19.6%larger than the diameter of the original inhibition zone.The antagonistic strain B-6isolated and screened in this paper was a biocontrol strain with development potential.Key words：tomato bacterial wilt;dilution coating separation method;antagonistic strain B-6;fermentation optimization; single factor test;orthogonal test近年来，随着设施番茄种植面积的不断扩大，品种单一，连作现象严重等问题导致土传性病害发生收稿日期：2021-11-10基金项目：山西省重点研发项目（201703D221010-2）作者简介：卢晓虹（1994-），女，山西朔州人，在读硕士，研究方向：植物病害与生物防治。
番茄灰霉病菌颉颃菌的筛选
番茄灰霉病菌颉颃菌的筛选摘要:对从不同生态环境下采集的样品进行分离纯化,共得到菌株68株｡经初筛,得到对番茄灰霉有颉颃作用的生防菌株16株,占分离菌株的23.5%｡并对其中较强颉颃作用的9株菌株进行抑菌活性的测定｡结果表明:滤纸片法得到的各菌株对番茄灰霉的抑制率在65.1%~92.0%之间,抑菌带在2.0~11.0 mm之间,共获得颉颃菌株8株,占分离菌株的11.8%｡关键词:番茄灰霉;颉颃菌;筛选;生物防治Screening of Antagonistic Strain Against Botrytis cinereaAbstract:68 strains were collected from different environments around Xingtai University and purified. 16 strains having antagonistics effect to Botrytis cinerea, which account for 23.5% in total were obtained. Among them, 9 strains having great intensive repression to Botrytis cinerea were detected. According to filter-paper detection, the suppression ratio of varieties maintained ranged from 65.1% to 92.0%; and bacteria-resistance region ranged from 2.0 to 11.0 mm. In addition, 8 anti-bacteria strains were obtained for biological control.Key words: Botrytis cinerea; anti-bacteria; separation; bio-control番茄灰霉病是由番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)引起的一种真菌病害,危害番茄的茎､叶､花及果实,以危害幼果为主,损失率一般在25%~30%,重者可造成绝产｡近年来,随着日光温室､塑料大棚､地膜覆盖等保护措施的改进,番茄种植面积不断扩大,加之茬次增多,为番茄灰霉病的滋生蔓延创造了条件｡番茄灰霉病是一种世界性重要病害,目前化学防治是常用手段,由于频繁施用杀菌剂,病菌抗药性严重｡并且施药时以果实为主要目标,造成了一定的农药污染｡在病害防治措施中,抗性品种的应用是最为经济有效的方法,但灰霉病抗源的匮乏,限制了抗性品种的选育[1]｡因此,近年来利用有益微生物来防治灰霉病已成为新的防治策略｡迄今为止,已有近百种微生物农药来自于微生物的次生代谢物,其中有多抗霉素､农抗120､武夷菌素､新生霉素､中生菌素等环境友好型生物农药｡国外报道多种真菌､细菌对灰霉病菌均有一定的抑制作用,如木霉､粘帚霉､酵母菌､假单胞杆菌等[2]｡在国内,从污水和土壤采样筛选番茄灰霉菌颉颃菌的报道较多,但从植物体采样进行筛选的甚少[3,4]｡本试验从不同生态环境下采样,筛选对番茄灰霉病菌有颉颃作用的菌株,并测定其抑菌效果,为充分挖掘有益微生物资源,利用生防菌防治番茄灰霉病提供理论依据,同时也为研究抑菌活性物质及其抗菌作用机理打下基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1样品分别从邢台学院西边小花园杨树下采集土样,从邢台学院内牛尾河采集水样,从邢台学院西边小花园柳树的不同部位取样(根部､树干､枝条),贴上标签,记下采样时间､地点､环境情况,带回实验室｡1.1.2供试病原微生物从邢台市北郊外新星村一农户蔬菜大棚内采集分离得到｡1.1.3主要仪器恒温光照培养箱,电热鼓风干燥箱,高压蒸汽灭菌锅,电热炉,超净工作台等｡1.2方法1.2.1微生物的分离､纯化采用参考文献[5]中的方法对土壤､污水和植物体中的微生物进行分离纯化｡1.2.2对番茄灰霉颉颃菌的筛选将番茄灰霉病菌菌株接种在PDA平板上培养5 d,然后用打孔器打取菌龄一致的菌片,转接到另一PDA平板中央,在菌片的正上､下方2 cm处各划线接种同一种分离的菌株,每处理3次重复,放于25℃恒温培养｡待菌落将长满培养皿时,观察并记录每种菌株对番茄灰霉病菌生长抑制作用的强与弱,筛选出对番茄灰霉病菌有较强颉颃作用的菌株｡1.2.3番茄灰霉病菌颉颃菌抑菌活性的测定将筛选到的具颉颃作用的菌株分别制成109个/mL菌悬液｡用打孔器打取番茄灰霉病菌菌龄一致的菌片,转接到另一PDA平板中央,在菌片的正上､下方2 cm处,接入沾有待测菌株相同浓度菌悬液的滤纸片2片,各个稀释度重复3次,以接沾有无菌水滤纸片的平板作对照,放于25℃恒温培养｡待对照菌落将长满培养皿时,测量菌落生长量和待测菌菌落边缘至灰霉病菌菌落边缘的间距(抑菌带)确定抑菌程度,计算抑制率｡以抑菌带大于 1 mm 的菌株记为有颉颃作用的菌株;抑菌带大于5 mm的菌株作为颉颃菌株[4]｡抑制率(%)=(对照菌落生长量-处理菌落生长量)/对照菌落生长量×100｡2结果与分析2.1微生物分离､纯化结果对不同生态环境下采集的菌样,通过梯度稀释法,用3种不同培养基进行分离,经过纯化后共分离到菌株68株｡2.2番茄灰霉病菌颉颃菌筛选结果采用室内对峙培养法对分离得到68株菌株进行了颉颃性的测定｡结果表明:有些菌株与番茄灰霉病菌互不干扰;有些菌株表现出抑制作用,但不存在抑菌带;有些菌株表现出颉颃作用,即抑菌带明显,少部分菌株表现出较大的抑菌带｡其中具有颉颃作用的菌株16株,占分离菌株的23.5%(见表1);表现较强颉颃作用的菌株9株,占分离菌株的13.2%,有ZG-2､SP-2､TN-5､SP-1､TP-5､TG-4､SG-1､ZN-4､ZP-4｡2.3番茄灰霉病菌颉颃菌抑菌活性的测定结果采用滤纸片法,对番茄灰霉病菌具颉颃作用的菌株进行了抑菌活性的测定,结果见表2｡由表2可以看出:各菌株对番茄灰霉病菌的抑制率在65.1%~92.0%之间,抑菌带在2.0~11.0mm之间｡其中ZN-4的抑菌效果最佳,抑制率达92.0%,抑菌带达11.0 mm;SP-2､TP-5､TN-5､TG-4､SG-1､ZG-2､SP-1的抑菌带均达5 mm以上,即获得颉颃菌株8株,占分离菌株的11.8%｡3讨论土壤､污水､植物体中的微生物由于其特殊的生存环境,会产生不同的活性物质｡随着生物防治的深入发展,微生物资源的开发利用将会受到世界各国的重视和青睐｡本试验从土壤､污水､植物中共分离到了68株菌株,并在室内测试了它们对番茄灰霉病菌的抑制作用,筛选得到16株具有颉颃作用的菌株｡采用滤纸片法对其中表现较强颉颃作用的9株进行了抑菌活性测定,得到8种颉颃菌株｡值得一提的是,ZN-4是从植物体柳树上采集的菌样,表现出最强的抑菌活性,从而可知,植物体可作为筛选颉颃菌种的良好材料资源｡试验中还发现,SP-2在抑菌活性测定后再培养期间,其抑菌带有较大的外延现象,可能在于它的防治效果依赖于一定量的代谢产物的积累,也可能其抑菌活性物质产生较晚,还有待于进一步研究｡试验充分表明了土壤､污水､植物体中微生物作为新的农用抗生素资源的可能性,在农业病害防治上有一定的潜在价值,也为开发新型生物农药奠定了基础｡但颉颃菌菌种鉴定及其生物特性､颉颃物质的产生条件,颉颃物质的理化性质､酸碱稳定性､热稳定性等均需进一步研究测试｡参考文献:[1] 陈双臣,刘爱荣,邹志荣. 转葡聚糖酶和防御素基因对提高番茄灰霉病抗性的研究[J].植物保护学报,2006,33(4):357-362.[2] 朱宏建,易图永,周鑫钰.土壤放线菌生防活性物质的研究进展[J].作物研究,2007,21(2):149-151.[3] 赵蕾,杨合同. 蔬菜灰霉病生防菌的筛选与防效试验初报[J].应用与环境生物学报,1999,5(1):85-88.[4] 唐蕊. 污水中西葫芦灰霉病拮抗细菌的分离与应用[J].北方园艺,2007(9):43-44.[5] 黄秀梨. 微生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,2004.1-8.。
探究番茄灰霉病生物防治的研究进展
DOI：10.16661/ki.1672-3791.2020.13.074探究番茄灰霉病生物防治的研究进展王欣凯 王硕(河北农业大学生命科学学院 河北保定 071000)摘 要：番茄灰霉病是一种由灰葡萄孢菌感染造成的真菌性病害，这种病害不仅能导致番茄果实的腐烂，而且还会对植株的茎、叶、花产生坏影响，对番茄种植地构成极大的威胁。
番茄灰霉病自发现以来，在我国各番茄种植地均有发生，并逐渐成为番茄培育的重要限制性因素。
该文通过分析番茄灰霉病的生物学特性，阐述了番茄灰霉病生物防治措施并对结果进行分析，探究并展望了番茄灰霉病的生物防治的研究进展，以供参考。
关键词：番茄灰霉病 生物防治 研究进展中图分类号：S641.2 文献标识码：A 文章编号：1672-3791(2020)05(a)-0074-02番茄是我国广泛种植的一种植物，也是我国重要的经济作物，其果实中所富含的大量维生素具有很高的营养价值，深受人们的喜爱。
而在种植过程中，受外部环境的影响，番茄容易受到病菌的侵害，其中灰霉病作为破坏最严重的一种病害，不但影响番茄的健康成长，还会对所种植地造成严重的生产威胁。
灰葡萄孢菌是番茄灰霉病的源头，在温度气候适宜时能够形成真菌性病害，侵染番茄的根、茎、果实，导致番茄减产或绝收。
为减少病害的侵害，提升番茄的生产量，使用生物防治手段对病害进行控制，因该方法有诸多优点所以成为近年来抵抗治疗灰霉病的有效办法，受到业界人士的广泛关注。
1 生物学特性1.1 番茄灰霉病病原菌丝萌发条件灰葡萄孢菌是诱发番茄灰霉病的罪魁祸首，当环境不利时以菌丝或者菌核的方式产生休眠体，寄生在病原菌中过冬，并在合适温度与合适气候条件下，萌发病原菌丝，借助生产活动进行病菌的传播。
经研究发展，灰葡萄孢菌在2℃~30℃之间均能萌发与生长，其中19℃~26℃的外部条件生长最快，10℃以下与30℃以上生长减缓。
且灰葡萄孢菌的生长需要光线的照射，以12h交替光照或黑暗的条件下生长速度最快，最适应的酸碱值为5。
2株内生拮抗细菌对灰霉病菌的抑菌活性研究
菌悬浮液以及高温处理 的发酵液在离体黄瓜上对灰霉病
菌 生 长 的 抑 制 作用 。
１２ １ 拮抗细菌对灰 霉病 菌菌丝 生长的影 响 将灰 霉 ．．
病菌接种 于倒 有 Ｐ Ａ 培 养 基 的 载 玻 片 中央 ，等 距 离 Ｄ ２ｃ ｍ分别点 接 细菌 ｆｌ ｑ ２和 ｙ８ ｅ ，以接 种 灰霉 病 菌作 对
２ 结果与分析
２ １ 拮抗细菌对灰霉病菌菌 丝生长的影响 ． 菌株 ｆ１ ｑ２对 灰霉 病 菌产 生 较 明显 的抑 制作 用 ，镜 检观察 到病原 菌 菌丝变 短 、畸形 ，部分 菌丝 末端 膨大 ， 有的菌丝原生质破裂 ；菌株 ｙ８对病 原菌 菌丝 的抑 制作 ｃ 用表现为菌丝末端变 细 ，有 的菌丝 中间膨大成 畸形 ，部
采用对峙培养法 ，检测 ｙ８和 ｆ１ ｅ ｑ２内生拮抗细菌对 灰霉病菌菌丝生 长的影 响，并观察其 发酵液对灰霉病菌 孢子萌发及病菌生长 的影响 ，同时测定 了其发酵液 、细
芽孢杆菌属和假单胞菌属 ，并对 ２ 内生拮抗细菌对灰 株
霉病菌的抑菌活性进行 了初步研究 ，旨为蔬菜生物 防病
提供新的方法。
８ｈ ０ 、１ 、１ 、２ 、１ ｈ ２ ｈ ４ｈ ０ ｈ和 ２ ４ｈ观 察 孢 子 萌 发 数 ， 并测量 其芽管长度 。 １２ ２２ 高温 处理 的拮 抗 细 菌液 对 病 菌 生 长 的 影 响。 ．．．
分菌丝断裂 ；而无菌水处理 的灰霉病 菌菌丝粗 壮 ，分枝
明 显 ，正 常 生 长 。
收 稿 日期 ：２０ — －６ ０ ８１ ０ ０
照 ，于恒 温箱 中 ２ ＝ ５【 ｃ 培养 ３ ，然后在显微镜下 观察处 ｄ 理与对照中灰霉病菌菌丝的变化 。
作者简介 ：张立新 （ ９ ８一） １７ ，男 ，河北定 兴人 ，博士 ，讲师 ，主要 从事植物病原 细菌学研究Ｔ作。
番茄青枯病拮抗内生放线菌的分离及抗菌活性产物研究
番茄青枯病拮抗内生放线菌的分离及抗菌活性产物研究番茄青枯病的病原菌是茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum),可以侵染200多种植物。
由于病原菌可以长期存活在土壤、水中以及被侵染的植株内,一旦有机会随时会感染新的植株,因此发病率较高,难以进行防治。
番茄作为农业主要的经济作物,因遭受青枯病的危害导致每年产量严重下降。
目前对于青枯病的防治主要以化学农药为主,但由于化学农药长期使用导致宿主植物的抗药性有所提升而且对环境造成了严重的影响。
因此,农业生产迫切需要研制新型、低毒和无害的防治青枯病的抗生素。
本文主要通过筛选青枯病拮抗菌,以及对拮抗菌次生代谢产物进行分离,为番茄青枯病的生物防治提供了新型的拮抗菌和抗菌活性物质。
本研究选取了5种常用的筛选培养基对健康和感染青枯病的番茄植株根内内生放线菌进行筛选,将得到的放线菌进行重复合并、菌属归类、菌株种类统计和菌株丰富度分析。
测试分离得到的菌株对番茄青枯病病原菌的抑菌活性,筛选对番茄青枯病具有抑制作用的拮抗菌,对拮抗作用较强的菌株进行发酵液活性的测试和次生代谢产物的分离,并且对它们进行了形态特征的描述。
此外,本实验还对从根内分离得到的两株野野村新种进行了多相分类学分析,为稀有放线菌的分类学提供了新的资源。
实验结果如下:(1)我们从健康和染病的番茄植株根内共分离得到1465株放线菌,去除重复后,合并为256株不同的放线菌,其中只存在于染病根内的内生放线菌有85株,只存在于健康根内的放线菌有49株,另外的122株在染病和健康的番茄植株根内都存在。
通过对菌株丰富度和种类分析发现,健康番茄植株根内分离的放线菌丰富度高于染病植株根内内生放线菌;而染病植株根内内生放线菌种类上多于健康植株分离得到的放线菌;健康和染病番茄植株根内有大量共存的放线菌。
(2)对分离得到的256株菌测试了对青枯病病原菌抑菌活性,得到23株有抑菌活性的内生放线菌,其中有7株放线菌分离自健康番茄植株,抑菌直径在17.64±0.72-22.04±0.42 mm之间,13株放线菌分离自染病番茄植株根内,抑菌直径大小在18.54±0.87-28.06±1.32 mm之间,3株放线菌在染病植株和健康植株中均存在,抑菌直径大小在17.86±1.86-20.12±1.75 mm之间。
番茄灰霉病菌拮抗放线菌的筛选
菌， 只有 Ｅ０ 、 Ｏ６Ｗ０５ ０ １Ｗ Ｏ 、 ８ 的发酵无菌滤液有较弱的拮抗作用 ， 其他菌株 的则无拮抗作用 。 关键词 ： 灰霉病菌 ； 拮抗放线 菌 ； 筛选
中图分类号 ： ４ ６ ４ ２ １ ￥ ３ ． １ ． ３ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：０２— ３ ２ ２ １ ） ５— １８一 ３ １０ １０ 【０ １ ０ ０３ Ｏ
洲品系的玉米及 野生玉米螟在受到危害时会 释放 引诱天敌线
虫 的挥发物 ， 而美 国品 系的玉米不会 。本研究利用 改 良后
［］ ４ 魏建荣 ， 忠岐 ， 杨 杜家纬 ． 天敌 昆虫 利用信息化学物 质寻找寄主
的“ 形嗅觉仪 来测定腰带长体茧蜂对转基 因及 对照玉米经 Ｙ” 玉米螟咬食后释放的信息化学物 质的反应 ， 以研究转 基 因玉 米是否对腰带 长体 茧蜂 的寄主 搜索 能力 构成 影 响。结果 表 明， 腰带长体 茧蜂对不 同玉米品种的反应差异不显著 ， 明供 说
一
１ ８一 ３
江苏农业 科学
２ １ 年第 ３ ０１ ９卷第 ５期
李欣欣 ， 袁树忠 ， 钱兰娟 ， 番茄灰霉病菌拮抗放线菌的筛选 ［ ］ 等． Ｊ ．江苏农业科 学， １ ， （ ） １ ８ １０ ２ １３ ５ ：３ — ４ ０ ９
番茄灰霉病 菌拮抗放线菌 的筛选
李欣欣 ，袁霉病（ ｏｒｉｃ ｅ ａＰｔ． 是一种真菌性病 害 ， Ｂｔ ｓ ｉ ｒ ｅ ） ｙ ｎ ｅ ｓ 已
经成为许多作物特别是蔬菜作 物的重大病 害之一 ， 也是番茄
前 ， 用拮抗微 生物 的生物 防治方法被认 为是更 安全 、 利 更友 好、 更能在农业生产 中代 替或者至少 能作为减少 化学农药使
５ ４． ７
生物区系 ， 导致农 产品残 留严重超标 ， 甚至危及人畜健康。 目
番茄灰霉病菌拮抗细菌的筛选及其作用机制研究
摘要 ： 辽 宁、 林等省各地番茄种植园区采集土壤样本 ８ 从 吉 ２份 ． 用 土 壤 稀 释 法 进 行 分 离 ， 采 获得 对 番 茄 灰 霉
病菌有拮抗作用的细菌 ５ 株 。其中 Ｋ １ ５的拮抗 能力最 强且稳定 ， 其抑 菌圈可达 ３ ｍ。通过抑制孢子萌发 、 响 ８ｍ 影 菌丝正常生长试验对 Ｋ ５的作用机制进行 了研究 ， 结果表 明 ，５能产生抗 菌物质 ， Ｋ 可有效抑制番茄灰霉病菌生长 ， 其 中对菌丝生长的抑制率为 ７ ． ％ ， ３ ２ 对孢子 萌发 的抑制 率为 ９ ． ％ 。对 Ｋ ８３ ５在 番茄果实上 的防治效果进 行 了测
定 ， 防效可达到 ７ ． ％ ， ５ ％多菌灵 ５０倍液的防治效果相 当， 其 ３１ 与 ０ ０ 是一种有潜力的生防制剂。
关 键 词 ：番茄 ； 霉 病 菌 ； 抗 细菌 ； 用 机 制 灰 拮 作 中图 分 类 号 ： ４ ６ ４２ １ ￥ ３ ． １． ３ 文献标志码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ２一ｌ０ （０ ８ ０ ０ １ ０ １０ ３２ ２０ ）２～ ｌ４— ３
３次 。
参考文献 ：
［ ］ 俊范．药用植物病害防治图册ｆ ．辽宁 ： １傅 Ｍ］ 辽宁科学技 术出版
社 ．９ ９ １９ 、
通讯作者 ： 曹远银 ， 研究员 ， 从事植物免疫和分子植 物病理学研究 。
（ 上接 第 １ ３页 ） １
近年 来 ， 随着紫 草人 工种植 面 积 的增 加 ， 紫草病 害发 生呈 加重 趋 势 。 目前 ， 内外 尚未 见 有关 紫草 国
植 物 资 源 ，０４，３ ２ ：２—１ ． ２０ ２（ ） １ ４
［ 张忠义， ４］ 王英祥 ， 何永 宏 ， 等
巾围柱隔 孢属 的分类研 究 Ⅲ［ ］ Ｊ．
番茄灰霉病高效内生拮抗细菌的筛选与定殖特性
河南农业科学,2020,49(3):88-100Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi :10.15933/ki.1004-3268.2020.03.012收稿日期:2019-07-19基金项目:山西省重点研发计划重点项目(201703D211006);山西省重点研发计划(201703D221026-1,201803D221016-1);山西省农科院特色农业攻关项目(YGG17002)作者简介:高振峰(1988-),男,山西新绛人,助理研究员,博士,主要从事植物病害生物防治及生物菌剂开发工作㊂E -mail:598175483@通信作者:韩巨才(1956-),男,山西盂县人,教授,博士,主要从事农药毒理分析与生物农药开发工作㊂E -mail:sxndhjc@番茄灰霉病高效内生拮抗细菌的筛选与定殖特性高振峰1,2,李㊀娜3,张晓宇1,韩巨才2(1.山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所,山西太原030031;2.山西农业大学农学院,山西太谷030801;3.今日农业杂志社,山西太原030006)摘要:为筛选出既可在番茄根际㊁根部㊁叶片良好定殖,又对番茄灰霉病具有较好防治效果的高效拮抗细菌,采用平板筛选㊁田间筛选㊁利福平抗性标记㊁形态鉴定㊁生理生化鉴定及16S rRNA ㊁gyrA 基因㊁gyrB 基因鉴定相结合的方法对番茄灰霉病高效内生拮抗细菌进行筛选,并对其进行定殖特性测定和分类地位研究㊂结果表明,58株细菌中菌株ZSY -1抑菌活性较优,在室内和田间试验中对番茄灰霉病菌均可保持75%以上的抑菌效果;虽然菌株FG -6在番茄根际㊁根系㊁叶片中的定殖特性(菌落数分别为1.76ˑ106㊁1.54ˑ106㊁0.87ˑ106cfu /g )明显优于菌株ZSY -1(菌落数分别为1.67ˑ106㊁1.46ˑ106㊁0.64ˑ106cfu /g ),但其田间防效较差,仅约30%,明显低于菌株ZSY -1;利用形态学㊁生理生化鉴定及16S rRNA ㊁gyrA 基因㊁gyrB 基因鉴定,将菌株ZSY -1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis )㊂上述结果表明,ZSY -1可作为番茄灰霉病防治菌剂和菌肥开发的优良候选菌株㊂关键词:内生细菌;番茄灰霉病菌;定殖特性;田间防效;分类鉴定中图分类号:S476;S436㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2020)03-0088-13Screening and Colonization Characteristics of Efficient EndophyticAntifungal Bacteria against Botrytis cinereaGAO Zhenfeng 1,2,LI Na 3,ZHANG Xiaoyu 1,HAN Jucai 2(1.Farm Products Storage and Freshening Institute,Shanxi Academy of Agriculture Sciences,Taiyuan 030031,China;2.College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China;3.Today Agriculture Magazine,Taiyuan 030006,China)Abstract :In order to screen out highly effective antifungal bacterium,which can be well colonized in therhizosphere,root and leaf of tomato and has good control effect on tomato gray mold,the methods of platescreening,field screening,rifampicin resistance marker,morphological identification,physiological and bi-ochemical identification,16S rRNA,gyrA and gyrB identification were used to screen and study the colo-nization characteristics and taxonomic status of highly efficient antifungal bacteria against Botrytis cinerea .The results showed that among 58strains,strain ZSY-1had more significantly antifungal activity againstB.cinerea than other strains and had more than 75%antifungal activity against B.cinerea in indoor and field trials.Although the colonization characteristics of strain FG-6in tomato rhizosphere (1.76ˑ106cfu /g),root system(1.54ˑ106cfu /g)and leaf(0.87ˑ106cfu /g)were significantly better than strain ZSY-1(rhi-zosphere:1.67ˑ106cfu /g;root system:1.46ˑ106cfu /g;leaf:0.64ˑ106cfu /g),but its field control effectwas only about 30%,which was significantly lower than strain ZSY-1.Strain ZSY-1was identified as Ba-㊀第3期高振峰等:番茄灰霉病高效内生拮抗细菌的筛选与定殖特性cillus velezensis based on morphology,physiological and biochemical characteristics,16S rRNA,gyrA,and gyrB genes.The above results determined that strain ZSY-1might be an excellent candidate strain against B.cinerea for the development of biological agents.Key words:Endophytic bacteria;Botrytis cinerea;Colonization characteristics;Filed efficacy;Classifi-cation and identification㊀㊀番茄灰霉病害是一种由灰葡萄孢病原(Botrytis cinerea)引起的世界性真菌病害,不仅可在田间危害,而且病原分生孢子耐低温能力强,在番茄采后低温贮藏期间亦可形成暴发,对番茄采前生长㊁发育和品质以及采后贮藏保鲜均具有重要影响[1-3]㊂目前,农业生产中该类病害防治仍以化学药剂为主㊂近年来由于化学农药不合理使用导致病原菌抗药性增强[4-5]㊁农药残留[6]㊁环境污染[7-8]和生态失衡[9],给后期防治带来困难,也不利于农药行业健康可持续发展,给我国农产品安全和人类健康带来威胁,因此,新型㊁绿色农药产品开发成为目前植物保护领域的研究热点之一㊂植物内生拮抗细菌作为一类不同于根际抗病微生物的特殊微生物,可在宿主体内与宿主和谐共生而不引起明显症状,所处环境稳定,营养来源可靠㊁丰富,具有同其他抗病微生物相似的抗菌物质种类㊁作用方式多样㊁抗菌谱广和不易产生抗药性等特点㊂部分内生细菌在侵染宿主根系进入宿主植物体内之前,还可在土壤中稳定定殖,对一些土传病害防治具有重要意义,是生物农药优秀开发源之一[10-12]㊂因此,近年来人们围绕内生拮抗细菌进行了大量研究,且已从番茄[13-14]㊁抱茎苦荬菜[15]㊁梓树[16]㊁地肤[17]和独角莲块茎[18]等植物体内分离到对B.cinerea具有良好抑制作用的内生细菌,说明内生细菌在该病害防治中具有良好应用潜力㊂然而相关研究仍存在一些局限性:研究数量同其他抗病微生物相比较少;抗病研究以室内测定居多,田间测定较少;抗病菌株筛选以室内离体筛选居多,田间筛选较少;部分菌株虽可在来源宿主中内生,但并未有证据表明亦可在番茄体内内生㊂鉴于此,以植物内生细菌防治番茄灰霉病害研究为核心内容,采用平板对峙㊁利福平抗性标记与田间试验相结合的方法,对前期从梓树㊁花椒㊁番茄㊁抱茎苦荬菜和酸枣等植物中分离到的58株植物内生拮抗细菌的抑菌活性㊁定殖特性和田间防效进行测定,筛选对番茄灰霉病菌具有良好拮抗效果且可在番茄体内良好定殖的内生细菌㊂在此基础上对其抗真菌谱及分类地位进行研究,为后期生物菌剂和菌肥的开发与应用奠定基础㊂1㊀材料和方法1.1㊀供试菌株1.1.1㊀内生细菌㊀菌株编号及来源见表1㊂58株菌株均由山西农业大学农药学实验室保存(-80ħ)并提供㊂1.1.2㊀植物病原真菌㊀番茄灰霉病菌(Botrytis ci-nerea)㊁番茄早疫病菌(Alternaria solani)㊁苹果腐烂病菌(Valsa mali)㊁棉花立枯病菌(Rhizoctonia sola-ni)㊁小麦赤霉病菌(Fusarium graminerum)㊁西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)㊁辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.capsicum)㊁梨黑斑病菌(Alternaria alternata)㊁桃褐腐病菌(Monilinia fruc-ticola)㊁菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthia-num)㊁菜豆菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)㊁番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)和胡萝卜腐烂病菌(Ceratocystis fimbriata)均由山西农业大学农药学实验室保存并提供㊂1.2㊀供试培养基PDA培养基:马铃薯200g㊁葡萄糖10g㊁琼脂18g㊁蒸馏水1000mL,pH值自然;NA培养基:牛肉浸膏3g㊁蛋白胨10g㊁NaCl5g㊁琼脂18g㊁蒸馏水1000mL,pH值7.0;BPY培养液:蛋白胨10g㊁酵母浸粉5g㊁牛肉浸膏5g㊁葡萄糖5g㊁NaCl5g㊁蒸馏水1000mL,pH值7.0㊂1.3㊀菌种活化1.3.1㊀内生细菌的活化㊀采用接种环挑取-80ħ甘油法保存的各内生细菌1环,于新鲜NA平板划线,并于26ħ恒温培养48h后用于后续试验㊂1.3.2㊀植物病原真菌的活化㊀将供试植物病原真菌于试验开始前均接种至新鲜的PDA平板,26ħ恒温培养5d后用于后续试验㊂1.4㊀拮抗细菌的筛选以番茄灰霉病菌为靶标,参照谢宗华等[19]的平板对峙法(略作修改)对1.3中活化后内生细菌的拮抗效果进行测定㊂在超净工作台中于每培养皿(直径为90mm)中倒入PDA培养基15mL,完全凝固后,用直径为5mm的打孔器打取活化后的各植物病原真菌菌块,并用接种针接种至PDA平板中央㊂98河南农业科学第49卷表1㊀内生细菌编号及来源Tab.1㊀Number and isolation source of all endophytic bacteria随后再用接种环挑取各内生细菌于距离植物病原真菌2cm处进行接种,以不接种内生细菌为对照,于26ħ恒温培养7d后参照PRABAVATHY等[20]的方法计算各处理抑菌率㊂各处理和试验均重复3次㊂1.5㊀内生细菌定殖特性研究采用抗生素标记法对1.4中具有较好抑菌效果的内生细菌的定殖特性进行测定㊂1.5.1㊀利福平(Rif)抗性菌株诱导㊀采用浓度递增的抗性诱导法对菌株的利福平抗性进行诱导,使菌株的利福平抗性达300μg/mL㊂利福平抗性诱导质量浓度梯度:0.5㊁1㊁2㊁4㊁8㊁15㊁30㊁60㊁120㊁200㊁300μg/mL㊂各菌株在每级利福平质量浓度下均可正常生长后,再转移至下级质量浓度进行诱导,直至菌株可在300μg/mL利福平质量浓度下正常生长为止㊂1.5.2㊀利福平抗性遗传稳定性测定㊀为明确各菌株对利福平抗性的遗传稳定性,在利福平抗性诱导结束后,采用划线法将利福平抗性菌株转接至不含利福平的NA平板上连续转接5代后,再回接至含利福平质量浓度为300μg/mL的NA平板上检测其遗传稳定性㊂正常生长的细菌鉴定为阳性,反之为阴性㊂1.5.3㊀利福平抗性菌株抑菌活性测定㊀为检测利福平抗性诱导过程中菌株抗菌活性是否出现下降或丧失,在明确菌株利福平抗性遗传稳定性后,再次采用平板对峙法对各抗性菌株的抑菌活性进行检测,测定方法及抑菌率计算方法同1.4,以明确利福平抗性菌株的抗菌稳定性㊂各处理及试验均重复3次㊂1.5.4㊀内生细菌番茄定殖特性测定㊀选取当地栽培番茄品种新星101为植物材料,于26ħ恒温催芽,待其露白后,播种于装有2kg灭菌土壤的塑料花盆中,每盆播种10粒㊂五叶期间苗,每盆留取长势一致的幼苗3株,七叶期采用灌根法(每盆接种09㊀第3期高振峰等:番茄灰霉病高效内生拮抗细菌的筛选与定殖特性Rif抗性菌株发酵液100mL)和喷雾法(以表面不形成液滴滴落为宜,接种浓度1.6ˑ107cfu/mL)同时接种各内生细菌㊂每隔5d接种1次,连续接种3次㊂于最后一次接种15d后分别取番茄根际土壤㊁根系和叶片组织,并于含有Rif质量浓度为300μg/mL的Rif抗性平板中对各菌株的定殖情况进行分析,以接种空白发酵液为对照,每处理和试验均重复3次㊂1.6㊀内生细菌对番茄灰霉病害田间防效测定田间应用作为生防微生物研究的最终目的,且田间因素对菌株病害防治效果具有重要影响,因此,在明确内生拮抗细菌在番茄中的定殖特性后,还需通过田间试验对其田间防效进行初步测定,以确保筛选到的目标菌株在田间也具有良好防治效果㊂试验设计:(1)制备发酵液㊂于超净工作台中使用接种环挑取1环活化后的内生细菌,接种至装有300mL BPY发酵液的500mL三角瓶中,于28ħ㊁160r/min 恒温振荡培养72h后终止发酵,获得内生细菌发酵液,用于后续田间试验㊂(2)番茄灰霉病害田间防效测定㊂于山西省晋中市太谷县阳邑乡番茄种植区,寻找3处番茄灰霉病害发病初期大棚进行田间防效测定,在喷洒前对其病情指数进行调查,随后对内生细菌发酵液稀释50倍,并使用手持喷壶进行喷雾处理,以空白发酵液为对照,每处理喷洒番茄2行(36株)㊂在内生细菌50倍发酵液稀释液处理7d 后,再次调查发病指数,计算防效,从而确定内生细菌的田间防效㊂番茄叶片和果实灰霉病分级标准以及病情指数和防效计算参照李瑞环等[21]的方法进行㊂1.7㊀筛选出的高效内生细菌的抗真菌谱测定以12种植物病原真菌为筛选靶标,参照ZHANG等[22]的平板对峙法对筛选出的高效内生细菌的抗真菌谱进行测定,抑菌带越大说明抑菌效果越好㊂1.8㊀筛选出的高效内生细菌的分类地位研究1.8.1㊀形态学鉴定㊀采用稀释涂布法,使内生细菌于NA平板上形成单菌落,对其菌落形态进行观察和记录,从而明确内生细菌在NA平板上的菌落形态特征㊂1.8.2㊀生理生化鉴定㊀参照参考文献[23-24]对内生细菌的生理化特性进行测定和鉴定㊂1.8.3㊀16S rRNA㊁gyrA基因和gyrB基因鉴定㊀参照CHEN等[25]和HASAN等[26]的细菌DNA提取方法,对内生细菌的基因组DNA进行提取,并用1%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测,检测合格后用于16S rRNA㊁gyrA基因和gyrB基因扩增㊂以细菌通用引物27F和1492R[27]㊁gyrA特异引物gyrA F/gyrA R[28]以及gyrB特异引物BS-F/R[29]为扩增引物,以基因组DNA为模板,分别对内生细菌的16S rRNA㊁gyrA基因和gyrB基因序列进行扩增㊂反应体系:primermix12.5μL㊁正引物0.5μL㊁反引物0.5μL㊁DNA0.5μL和ddH2O11μL;扩增程序:94ħ预变性5min;94ħ变性45s㊁适宜退火温度下40s㊁72ħ延伸90s(16S rRNA)/45s(gy-rA㊁gyrB),变性㊁退火和延伸循环30次后,于72ħ继续延伸10min,最后10ħ保存,用于电泳检测和测序㊂扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后,送交北京六合华大基因公司进行常规测序㊂获得测序序列后,使用Ezbiocloud website对内生细菌的16S rRNA序列同模式菌株进行比对分析;使用NCBI在线BLAST对内生细菌gyrA和gyrB 序列进行比对分析,并选取适宜近缘种相关序列,采用Mega5.0构建NJ系统发育树,从分子生物学角度对内生细菌的分类地位进行研究㊂2㊀结果与分析2.1㊀拮抗细菌筛选结果以番茄灰霉病菌为靶标,采用平板对峙法对58株不同来源内生细菌抑菌活性进行测定后发现,各菌株对B.cinerea抑菌效果差异显著,其中28株内生细菌对该病原表现出一定抑菌效果,其余菌株则无抑菌活性㊂28株内生细菌中,以来源于梓树叶片中的内生细菌ZSY-1对该病原抑菌活性较高,抑菌率为96.17%(表2)㊂说明菌株ZSY-1在抑制番茄灰霉病菌方面具有明显优势㊂2.2㊀拮抗细菌在番茄中的定殖特性对28株对于番茄灰霉病菌具有抑菌活性的菌株在番茄叶片㊁根系和根际土壤中的定殖能力进行测定后发现,28株内生细菌表现出5种现象:在根际土壤㊁根系和叶片组织中均稳定定殖;仅在根际土壤中定殖;在根际土壤㊁根系和叶片组织中均无法定殖;可在根际土壤和根系中定殖,而无法在叶片中定殖;在根际土壤中定殖与抑制番茄生长(表3)㊂其中,菌株FG-6㊁ZSY-1㊁FJ-3㊁ZSJ-4在根际土壤中的定殖效果较好,接种15d后菌落数分别为1.76ˑ106㊁1.67ˑ106㊁1.65ˑ106㊁1.35ˑ106cfu/g;菌株FG-6㊁ZSY-1㊁FJ-3在番茄根系㊁叶片中的定殖效果较好,根系中菌落数分别为1.54ˑ106㊁1.46ˑ106㊁1.31ˑ106cfu/g,叶片中菌落数分别为0.87ˑ106㊁0.64ˑ19河南农业科学第49卷表2㊀28株内生细菌对番茄灰霉病菌的抑菌活性Tab.2㊀Antifugnal activity of28endophyticbacteria against B.cinerea㊀Note:Different lowercase letters in a column mean significant differ-ences(P<0.05).The same below.106㊁0.70ˑ106cfu/g㊂菌株ZSJ-4㊁HJJ-1㊁HJG-5虽然可在番茄根际土壤中稳定定殖,但均对番茄生长产生明显抑制,造成幼苗萎焉;菌株ZSG-2㊁ZSJ-3㊁ZSY-3㊁HJJ-3㊁HJY-4㊁HJG-1㊁BJG-1㊁SZJ-5㊁SZY-1既无法在番茄根际土壤中定殖,也无法在番茄根系㊁叶片中定殖或对番茄生长产生抑制作用;菌株BJG-3㊁SZY-3可以在番茄根际土壤中定殖,但在番茄根系㊁叶片中定殖对番茄生长产生抑制作用㊂上述结果表明,菌株FG-6㊁ZSY-1㊁FJ-3在番茄灰霉病害防治以及土壤病原残体清除中具有较好应用潜力㊂2.3㊀3株内生细菌对番茄灰霉病害的田间防效在田间对菌株ZSY-1㊁FG6㊁FJ-3的番茄灰霉病害防效进行测定后发现,菌株ZSY-1对番茄灰霉病害具有较好防治效果,对叶片的防治效果可达80.33%,对果实的防治效果可达75.10%(表4),明显高于菌株FG-6(田间防效仅约30%)㊁FJ-3㊂说明菌株ZSY-1不仅在室内具有良好抑菌效果,而且表3㊀28株内生细菌在番茄根系㊁叶片和根际土壤的定殖特性Tab.3㊀Colonization characteristic of28endophytic bacteria in the root,rhizosphere soil and leaf of tomato㊀Note: represents the stain didn t colonize in plant root or rhizosphere or leaf;∗∗∗represents the strain inhibited the growth of tomato.在田间也可保持较好活性,均可保持75%以上的抑菌效果,应用潜力良好㊂2.4㊀内生细菌ZSY-1的抗真菌谱采用对峙法对内生细菌ZSY-1的抑菌广谱性进行测定后发现,该菌株对12种植物病原真菌均具有一定抑菌活性,其中对番茄灰霉病菌㊁桃褐腐病菌㊁菜豆菌核病菌㊁苹果腐烂病菌㊁番茄早疫病菌抑菌效果较好,抑菌带直径均大于20mm,分别为26.73㊁25.17㊁23.27㊁22.50㊁22.47mm(表5,图1);其次为西瓜枯萎病菌㊁菜豆炭疽病菌,抑菌带直径分别为18.23㊁17.97mm;其他病原真菌中除对棉花立枯病菌抑菌带直径达10mm以上外,其余均小于10mm㊂说明菌株ZSY-1具有较广抑菌谱,在植物病害防治中应用潜力明显㊂29㊀第3期高振峰等:番茄灰霉病高效内生拮抗细菌的筛选与定殖特性表4㊀3株内生细菌对番茄灰霉病的田间防效Tab.4㊀Field effect of three endophytic bacteria against B.cinerea处理Treatment药前病情指数Disease index beforespraying叶片Leaf果实Fruit用药7d后病情指数Disease index at7daysafter spraying叶片Leaf果实Fruit田间防效/%Field effect叶片Leaf果实FruitFG-60.62ʃ0.04 4.14ʃ0.07 4.76ʃ0.1313.47ʃ0.0732.11ʃ0.7c28.52ʃ1.1c FJ-30.61ʃ0.01 4.21ʃ0.03 2.97ʃ0.1110.81ʃ0.0956.95ʃ0.4b43.59ʃ1.6b ZSY-10.58ʃ0.02 4.05ʃ0.04 1.29ʃ0.17 4.59ʃ0.0680.33ʃ0.2a75.10ʃ0.4a 对照Control0.68ʃ0.03 4.33ʃ0.027.69ʃ0.2119.71ʃ0.25表5㊀内生细菌ZSY-1对12种植物病原真菌的抑菌活性Tab.5㊀Antifungal activity of endophytic bacterium ZSY-1against12plant pathogenic fungiA L:桃褐腐病菌㊁番茄灰霉病菌㊁番茄早疫病菌㊁苹果腐烂病菌㊁菜豆菌核病菌㊁菜豆炭疽病菌㊁西瓜枯萎病菌㊁棉花立枯病菌㊁小麦赤霉病菌㊁辣椒枯萎病菌㊁番茄枯萎病菌㊁胡萝卜腐烂病菌A L:M.Fructicola,B.cinerea,A.solani,V.mali,S.sclerotiorum,C.lindemuthianum,F.oxysporum f.sp.niveum,R.solani,F.graminerum,F.oxysporum f.sp.capsicum,F.oxysporum f.sp.lycopersici and C.fimbriata,respectively图1㊀内生细菌ZSY-1对12种植物病原真菌的抑菌效果Fig.1㊀Antifungal effect of endophytic bacterium ZSY-1against12plant pathogenic fungi39河南农业科学第49卷2.5㊀内生细菌ZSY-1的分类地位2.5.1㊀形态特征㊀采用NA固体培养基对菌株ZSY-1形态特征进行观察后发现,该菌株颜色为米白色,表面干燥㊁褶皱,挑取时表面有较薄皮层,但内部湿润,且边缘锯齿状不整齐(图2)㊂2.5.2㊀生理生化特性㊀生理生化试验结果表明,菌株ZSY-1可利用葡萄糖㊁蔗糖㊁甘露醇㊁麦芽糖㊁果糖,能水解淀粉,可利用葡萄糖产酸,接触酶反应呈阳性,VP反应呈阳性,为兼性厌氧菌,生长温度为15~50ħ,且具有一定耐盐特性,可在2%~8%的盐浓度下正常生长(表6)㊂参照参考文献[23-24],发现菌株ZSY-1同枯草芽孢杆菌群菌株生理生化特性基本相似㊂图2㊀内生细菌ZSY-1的NA平板形态Fig.2㊀The morphological characteristics of endophyticbacterium ZSY-1on NA medium表6㊀内生细菌ZSY-1的生理生化特性Tab.6㊀Physiological and biochemical characters of endophytic bacterium ZSY-1㊀Note:+means positive reaction; means negative reaction.2.5.3㊀分子生物学鉴定㊀菌株ZSY-1的16S rRNA㊁gyrA基因和gyrB基因序列经PCR扩增,电泳检测合格,送交华大基因测序后获得长度分别为1417㊁703㊁718bp的相关序列,序列NCBI登录号分别为KT381096㊁KT381097㊁KX855985㊂16S rRNA基因序列经Ezbiocloud website同模式菌株进行比对分析后发现,菌株ZSY-1的16S rRNA序列同枯草芽孢杆菌群模式菌株Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum FZB42T和Bacillus methylotrophicus KACC13105T的序列相似性最高,均为99.93%;选取枯草芽孢杆菌群模式菌株和外群Bacillus cereus ATCC14579T,采用Mega5.0进行序列比对,并构建NJ系统发育树后发现,菌株ZSY-1同上述2个模式菌株聚在同一支,说明利用16S rRNA 序列很难确定菌株ZSY-1的分类地位,但可确定该菌株隶属枯草芽孢杆菌群(图3),同生理生化特性分析结果相似㊂内生细菌ZSY-1gyrA序列经NCBI在线BLAST比对分析后发现,其序列分别同模式菌株B.amyloliquefaciens subsp.plantarum FZB42T㊁B.methyl-otrophicus KACC13105T㊁B.velezensis NRRL B-41580T的相似性最高,均为98%;基于枯草芽孢杆菌群模式菌株和外群Bacillus cereus ATCC14579T gyrA 序列构建NJ系统发育树后发现,内生细菌ZSY-1同样与模式菌株B.amyloliquefaciens subsp.plantarum FZB42T㊁B.methylotrophicus KACC13105T聚在同一49㊀第3期高振峰等:番茄灰霉病高效内生拮抗细菌的筛选与定殖特性支,聚类结果同16S rRNA 序列结果相同(图4),说明内生细菌ZSY -1同上述模式菌株具有较高的同源性,且还需其他特异基因辅助来进一步确定内生细菌ZSY -1的分类地位㊂另外,根据gyrA 序列系统发育树还可发现,该特异基因在枯草芽孢杆菌群菌株有效鉴别中的精度较低,系统发育树结果同16S rRNA 序列差异不大㊂图3㊀内生细菌ZSY -1及其近缘种基于16S rRNA 序列的NJ 系统发育树Fig.3㊀NJ tree showing the phylogenetic positions of endophytic bacterium ZSY-1andother related taxa based on 16S rRNA gene sequences㊀㊀gyrB 作为另一段特异基因,在枯草芽孢杆菌群近缘种鉴别中具有明显优势,目前已对该群内多数菌株实现有效鉴别㊂内生细菌ZSY -1gyrB 基因序列经NCBI 在线BLAST 比对分析后发现,该菌株gyrB 序列同模式菌株B.amyloliquefaciens subsp .plantarum FZB42T ㊁B.methylotrophicus KACC 13105T ㊁B.velezensis NRRL B -41580T 的序列相似性较高,分别为100%㊁99%㊁99%㊂构建系统发育树后发现,该菌株同模式菌株B.velezensis NRRL B -41580T 聚在同一支,因此,将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis )(图5)㊂3㊀结论与讨论植物内生细菌作为生物农药的开发源之一,分布广泛㊁存在于绝大多数植物中,在植物细菌病害㊁真菌病害㊁线虫病害生物防治中具有重要意义[30]㊂目前,从多种宿主植物体内分离㊁筛选到的对植物病㊁虫害具有良好活性的内生细菌多数是以室内平板筛选为主,虽然部分拮抗细菌在室内抑菌效果良好,但在田间相对恶劣环境下可能会丧失活性或活性下降㊂因此,本研究在利用平板对峙筛选出室内抑菌效果良好的拮抗菌株后,还以盆栽试验和大田试验分别对菌株的定殖特性和田间防效进行了测定,以期筛选出既可在番茄中定殖,又能在田间保持良好抑菌活性的优良生防菌株,为其后期开发和应用奠定基础㊂采用平板对峙法,以番茄灰霉病菌为靶标对从番茄㊁梓树㊁酸枣㊁花椒和抱茎苦荬菜中分离到的58株内生细菌的平板抑菌活性进行测定后发现,梓树内生细菌ZSY -1抑菌活性最好,抑菌率为96.17%,其抑菌活性同已报道的地肤内生细菌D -29[17]㊁番茄内生放线菌FQ -017[31]㊁高寒草地禾草内生细菌59河南农业科学第49卷图4㊀内生细菌ZSY -1及其近缘种基于gyrA 基因序列的NJ 系统发育树Fig.4㊀NJ tree showing the phylogenetic positions of endophytic bacterium ZSY-1and otherrelated taxa based on gyrA genesequences图5㊀内生细菌ZSY -1及其近缘种基于gyrB 序列的NJ 系统发育树Fig.5㊀NJ tree showing the phylogenetic positions of endophytic bacterium ZSY-1and otherrelated taxa based on gyrB gene sequencesB -401[32]相比具有更好抑菌活性,说明菌株ZSY -1在番茄灰霉病害防治中具有良好应用潜力㊂在明确菌株ZSY -1的平板抑菌活性后,为进一步明确其在田间条件下的活性,采用利福平抗性标记㊁灌根和喷雾接种方式对其在番茄中的定殖特性和田间灰霉病害防效进行了测定㊂结果表明,内生细菌ZSY -1不仅可在番茄根际良好存活,而且可在根部和叶片组织良好定殖,处理15d 后,根际土壤㊁根系㊁叶片中的数量分别可达1.67ˑ106㊁1.46ˑ106㊁0.64ˑ106cfu /g;田间番茄灰霉病害防效良好,叶部69㊀第3期高振峰等:番茄灰霉病高效内生拮抗细菌的筛选与定殖特性防效可达80.33%㊁果实防效可达75.10%㊂其定殖特性明显好于内生细菌01-144[33]㊁红树植物内生海洋细菌CⅢ-1[34]和番茄内生短短芽孢杆菌QGJ-6[35];番茄灰霉病田间防效同拮抗菌TB-12[36]㊁生防菌株YB-81[37]㊁番茄内生解淀粉芽孢杆菌LNW-FD-05[38]㊁解淀粉芽孢杆菌Ba168[39]㊁植物乳杆菌IMAU10014[40]相比效果更好,但同海洋芽孢杆菌B-9987[41]㊁生防菌株SW11[42]㊁番茄灰霉病拮抗细菌18BS-12[43]等菌株相比防效相似㊂造成这些差异的原因可能与菌株自身差异㊁试验条件㊁番茄品种㊁处理方式和时间不同有关,但依据上述结果仍可发现,非番茄植株土著内生细菌也可在番茄体内有效定殖,而且不同来源菌株和不同种菌株,在植物病害防治和定殖特性上存在一定差异,在后期植物内生抗病细菌研究中,除进行平板活性测定外,还需进一步加强其定殖特性和田间防效研究㊂在确定菌株ZSY-1的田间应用潜力后,还对其抗菌谱进行了研究,结果发现,菌株ZSY-1不仅对番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌具有较好抑菌效果,而且还对桃褐腐病菌㊁苹果腐烂病菌和菜豆菌核病菌具有良好抑菌效果,抑菌带直径均在20mm以上,其抑菌带直径明显高于中药白鲜皮内生枯草芽孢杆菌TS-5[44]和生防菌株YB-81[37];且与枯草芽孢杆菌CQ[45]㊁番茄灰霉生防菌B21[46]和酸枣内生解淀粉芽孢杆菌SZG-23[47]存在一定异同,说明不同菌株或不同来源菌株在抑菌特性上也存在一定差异㊂细菌鉴定作为细菌资源信息统计整理和发现新种的必要措施,对查找和认识相关菌株具有一定意义,因此,在明确菌株ZSY-1的抑菌特性后,采用形态学㊁生理生化特性㊁16S rRNA和特异基因gyrA和gyrB相结合的方法对菌株ZSY-1的分类地位进行了研究,将菌株ZSY-1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Ba-cillus velezensis)㊂在分类地位研究中发现,特异基因gyrB在枯草芽孢杆菌群菌株分类地位研究中应用优势明显[48],使用该基因可有效实现该类群菌株的鉴定,而gyrA基因分辨率则相对较低,且在近缘种鉴定中采用传统的形态学㊁生理生化特性和16S rRNA鉴定很难实现有效鉴定,因此,在后续枯草芽孢杆菌群菌株分类地位研究中可以引入gyrB特异基因,且对活性较好的菌株可以进行基因组测序,从而更加准确地确定其分类地位[49]㊂虽然对贝莱斯芽孢杆菌菌株ZSY-1的抑菌特性㊁定殖特性㊁田间防效和分类地位进行了初步测定,但有关菌株ZSY-1对其他病原菌的田间抑菌活性㊁抗菌机制㊁在番茄发育过程中不同时间点的定殖规律以及大田定殖规律还需进一步进行研究,以期明确菌株ZSY-1的田间应用价值,并为微生物农药和菌肥开发提供新菌株㊂参考文献:[1]㊀陈利军,郭世保,田雪亮,等.产香真菌GS-1菌株鉴定及其挥发性物质对番茄灰霉病的生防效果[J].植物保护学报,2016,43(4):608-613.CHEN L J,GUO S B,TIAN X L,et al.Identification ofaroma-producing fungus GS-1strain and its biocontrolefficacy against tomato gray mold[J].Journal of PlantProtection,2016,43(4):608-613.[2]㊀EGASHIRA H,KUWASHIMA A,ISHIGURO H,et al.Screening of wild accessions resistant to gray mold(Botry-tis cinerea Pers.)in Lycopersicon[J].Acta PhysiologiaePlantarum,2000,22(3):324-326.[3]㊀BAHAMMOU N,CHERIFIL O,BOUAMAMA H,et al.Postharvest control of gray mold of tomato using seaweedextracts[J].Journal of Materials and Environmental Sci-ences,2017,8(3):831-836.[4]㊀RODRÍGUEZ A,ACOSTA A,RODRÍGUEZ C.Fungicideresistance of Botrytis cinerea in tomato greenhouses in theCanary Islands and effectiveness of non-chemical treat-ments against gray mold[J].World Journal of Microbiol-ogy and Biotechnology,2014,30(9):2397-2406. [5]㊀纪明山,刘妍,朱赫,等.辽宁省番茄灰霉病菌对常用杀菌剂的抗药性监测与交互抗药性[J].农药,2017,56(9):676-678.JI M S,LIU Y,ZHU H,et al.Detection of the resistanceof Botrytis cinerea on tomato in Liaoning Province to fun-gicides and cross-resistance[J].Agrochemicals,2017,56(9):676-678.[6]㊀李运朝,及华,王蒙,等.8种杀菌剂在河北番茄和黄瓜中残留分析及其膳食暴露评估[J].食品安全质量检测学报,2018,9(17):4570-4576.LI Y C,JI H,WANG M,et al.Residue levels and dietaryexposure risk assessment of eight fungicides in the tomatoand cucumber planted in Hebei[J].Journal of Food Safe-ty and Quality,2018,9(17):4570-4576.[7]㊀段海明,余利,黄伟东,等.番茄灰霉病菌高效杀菌剂筛选及新型混剂研究[J].浙江农业学报,2016,28(12):2060-2067.DUAN H M,YU L,HUANG W D,et al.Screening of highefficient fungicide for the pathogen of tomato gray moldand research on novel mixed agent[J].Acta AgriculturaeZhejiangensis,2016,28(12):2060-2067.[8]㊀LEE J P,LEE S W,KIM C S,et al.Evaluation of formula-tions of Bacillus licheniformis for the biological control of79。
番茄内生细菌Eb-28对番茄灰霉病菌抑制作用研究
位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。
学位论文作者签名：馍，艳冬 签字日期： 垆子年乡月７日
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本学位论文作者完全了解塑皇垦盎些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，
有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借
阅。本人授权塑皇垦盎些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行
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学位论文作者签名：筵ｋ、．－艳…苎
签字日期： 矽口苫年 ６月 穸日
关键词：番茄灰霉病；子叶筛选法；内生细菌；抗菌蛋白
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｅｂ一２８ ｆｒｏｍ ｔｏｍａｔｏ ｏｎ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｐｅｒｓ
Ａｕｔｈｏｒ：Ｊｉａｏ Ｙａｎ—ｌｉｎｇ Ａｄｖｉｓｅｒ：Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｃａｏ Ｋｅ－ｑｉａｎｇ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｏｌｒｙｔ｛ｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｐｅｒｓ．；ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ； ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经
ｍｍ ａｔ ｎｅｕｔｒａｌ ａｎｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｍｅｄｉｕｍ（ｐＨ ｒａｎｇｅ ｏｆ ６．６－１ ０．６），ａｎｄ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｃｒｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｒａｔｈｅｒ ｇｏｏｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｒａｄｉａｔｉｏｎ．
抗番茄青枯病内生拮抗细菌的筛选及室内防效测定
挑取单菌落 ， 按常规方法纯化后保存备用。
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５ ・ Ｏ
武
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第 ２ 卷 ２
１ １２ 目标病原菌 番茄青枯菌 Ｔ Ｗ 一 ， ．． Ｂ １存放于无菌水 中置 ２ ℃下保存 （ Ｏ 由本实验室从发 病番茄植株上分离获得） 。
１１３ 培养基 ．．
１２ 方 法 ．
Ｎ ： Ａ 牛肉膏 ３ｇ酵母膏 １ ， 白胨 ５ｇ 葡萄糖 １ ， ， 蛋 ｇ ， ０ｇ琼脂 １ ， １０ ｌ ８ｇ 水 ００ｍ ，
抗 番 茄 青 枯 病 内生 拮 抗 细 菌 的筛 选 及 室 内防 效 测 定
赵 健。 兰成忠 ， 陈庆河 ， 邱荣洲 ， 翁启勇 （ 福建省农业科学院植物保护研究所， 福建 福州 ３ ０ １ ） ５ ０３
摘要： 从健康番茄体内分离到了９ ３株内生细菌。采用含菌平板抑菌圈测定法 ， 筛选出了 ３ 株对番茄青枯菌 具有较强拮抗力的细菌菌株 Ｚ １Ｚ ２ Ｚ 一 温室盆栽 防病试验结果表 明， Ｂ一 、Ｂ一 和 Ｂ ６ 内生细菌菌株 ｚ ６ Ｂ一 对 植株进行预处理后 ， 番茄青枯病防病效果可达 ６ — ５ ， ３ ６％ 说明该菌株对番茄青枯病发生具有较好预防效果。 关键词： 番茄； 内生细菌； 拮抗细菌 ； 筛选； 番茄青枯病
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第２ ２卷 ２０ ０６年 １ ２月
武
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ＷＵ Ｉ Ｃ Ｃ ＯＵ Ｎ Ｌ Ｙ 砸Ｎ Ｅ Ｊ Ｒ Ａ ＳＶｏ． ２源自１２ Ｄｅ ． ｏ ６ ｃ２ ｏ
文章编号 ：０ １４７ －２ｏ ０ －０９０ １０ －２ ６ （ｏ６） １ ４ －６ ０
样存在着防效不稳定的问题 。 许多研究 已证明， 健康植物体内存在大量的内生细菌， 内生细菌在植物体 内具有稳定 的生
拮抗放线菌B1菌株鉴定及其防治+番茄灰霉病的初步研究
拮抗放线菌B1菌株鉴定及其防治番茄灰霉病的初步研究谢晨昭 杨毅玲 李 磊 李金云∗ 王建辉 王慧敏∗(中国农业大学植物病理学系,北京100193)摘要:为明确放线菌B1菌株在植物病害生物防治中的应用潜力,采用平板对峙培养法、离体叶片和果实及温室盆栽苗测定其抑菌作用,通过多相分类法研究其分类地位,并且采用单因子试验与正交试验相结合的方法,筛选出该菌株的液体发酵培养基配方。
结果表明:菌株B1对10种植物病原真菌和3种植物病原细菌有抑制作用,其中对番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、小麦纹枯病菌、甘蓝黑腐病菌和西瓜果腐病菌的抑制作用较强,对番茄灰霉病菌的生长抑制率达86.25%;菌株B1的代谢产物对番茄灰霉病菌菌丝有致畸作用;菌株B1发酵上清液在离体叶片和活体植株上对番茄灰霉病具有良好的生防作用,其防治效果分别为68.80%和64.03%。
根据形态特征、培养性状、生理生化特性和16S rDNA 序列分析结果,将菌株B1初步鉴定为淡紫灰链霉菌Streptomyces lavendulae 。
通过正交试验筛选出菌株B1的液体发酵培养基组成为:葡萄糖15g 、玉米浆20g 、NH 4H 2PO 40.5g 、MgSO 41.0g 、自来水1000mL ,pH 7.2~7.4。
关键词:放线菌B1菌株;番茄灰霉病;防治试验;淡紫灰链霉菌Taxonomy of antagonistic strain B1and control effect of tomato gray mouldXie Chenzhao Yang Yiling Li Lei Li Jinyun ∗ Wang Jianhui Wang Huimin ∗(Department of Plant Pathology,China Agricultural University,Beijing 100193,China)Abstract :In order to confirm the potential appliance of an antagonistic actinomycetes strain B1for bio⁃control of plant diseases,the fungistatic and bacteriostatic activity of this strain was determined by con⁃fronting incubation on PDA plates,control tests on detached leaves and fruits in vitro and control on pot⁃ted plants in greenhouse.The taxonomic identification of the strain was also carried out with multiphase taxonomy.The liquid fermentation medium of strain B1was screened out by single factor and orthogonalarray experiments.Results showed that strain B1exhibited strong inhibition activity to all 10plant patho⁃genic fungi tested and 3out of 5plant pathogenic bacteria,especially to Botrytis cinerea ,Alternaria sola⁃ni ,Rhizoctonia cerealis ,Xanthomonas campestris and Acidovorax avenae.In particular,86.25%growth inhibition rate on Botrytis cinerea was observed.The secondary metabolites of strain B1showed teratogen⁃ic effect on the mycelia of B.cinerea .The biocontrol effects of strain B1to gray molds of tomato detached leaves and plants in greenhouse were 68.80%and 64.03%,respectively.Studies on its morphology,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis showed that strain B1be⁃longs to Streptomyces lavendulae .Liquid fermentation medium for strain B1was screened out through opti⁃mization experiment,as with glucose 15g,corn slurry 20g,NH 4H 2PO 40.5g,MgSO 41.0g and tap water1000mL,pH 7.2-7.4.Key words :actinomycetes strain B1;tomato gray mould;control tests;Streptomyces lavendulae 作者简介:谢晨昭,女,1978年生,硕士研究生,研究方向为植物病害生物防治,email:xiechenzhao@∗通讯作者(Authors for correspondence),email:lijinyun@,wanghm69@;收稿日期:2008-02-28第35卷 第4期2008年 8月植 物 保 护 学 报ACTA PHYTOPHYLACICA SINICAVol.35 No.4Aug. 2008 番茄灰霉病是由灰葡萄孢Botrytis cinerea侵染引起的一种重要病害,尤以保护地番茄受害严重。
番茄灰霉病菌拮抗放线菌的分离和筛选
番茄灰霉病菌拮抗放线菌的分离和筛选谷祖敏;苏州;刘宏伟;王英姿;纪明山;程根武;祁之秋;魏松红【期刊名称】《辽宁农业科学》【年(卷),期】2004(000)003【摘要】从沈阳东陵天柱山、小麦田和蔬菜园采集土壤样品,采用平板稀释法分离到212株放线菌,以番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)作为指示菌,通过体外抗菌活性筛选出12株抑菌圈直径大于10 mm的菌株,进行离体叶片防病作用测定,初筛出防病效果较好的F22、F27、F39和F89菌株,然后将其发酵液喷洒在盆栽番茄植株上,测定对病害的实际防治效果,最后筛选出防病效果好,防效持久的F89菌株.【总页数】2页(P1-2)【作者】谷祖敏;苏州;刘宏伟;王英姿;纪明山;程根武;祁之秋;魏松红【作者单位】沈阳农业大学,辽宁,沈阳,110161;沈阳化工研究院,辽宁,沈阳,110021;沈阳农业大学,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学,辽宁,沈阳,110161【正文语种】中文【中图分类】S436.412.1+3【相关文献】1.番茄灰霉病菌拮抗放线菌的筛选 [J], 李欣欣;袁树忠;钱兰娟;张青霞2.番茄灰霉病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及其活性评价 [J], 徐大勇;李志栋;李峰;徐顶泉;吴旺丽3.番茄灰霉病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及其活性评价 [J], 徐大勇;李志栋;李峰;徐顶泉;吴旺丽4.茶炭疽病拮抗放线菌的分离筛选与鉴定 [J], 刘红艳;李维;向芬;周琳;丁玎;曾振;周凌云5.凤丹根腐病拮抗放线菌的分离筛选及鉴定 [J], 王雪;王冉;王晔;丁东玲;位诗棋;郑艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
番茄灰霉病拮抗菌K2的筛选及鉴定
第31卷第2期2015年6月金陵科技学院学报J OURNAL OF JINLING INSTITUTE OF TECHNOLOGYVol.31,No.2June ,2015番茄灰霉病拮抗菌K 2的筛选及鉴定丁永辉1,陈玲英2,梅丽娟2(1.徐州生物工程职业技术学院,江苏 徐州 221006;2.扬州大学环境科学与工程学院,江苏 扬州 225009)摘 要:从土壤中分离出一株对蕃茄灰霉病菌(Botr y tis cinerea )有较强拮抗能力的细菌K 2㊂通过平板对峙培养法对其抑菌效果进行测定,结果表明:1)培养5d 后,K 2菌落周围产生明显的抑菌带,对Botr y tis cinerea 的抑菌率达66.19%,培养15d 后仍保持稳定的抑菌效果;2)K 2的发酵原液对Botr y tis cinerea 孢子萌发具有显著的抑制作用,抑制率为100%;3)K 2对病菌的作用机制表现为使病菌菌丝畸形㊁菌丝扭曲㊁抑制病菌分生孢子的萌发;4)土壤定殖试验表明,拮抗菌K 2会受到土著微生物的影响降低存活率,但仍具有在土壤中存活并较长时间保持拮抗能力的潜力㊂关键词:番茄灰霉病菌;拮抗细菌;拮抗作用中图分类号:S641.2;S436 文献标志码:A 文章编号:1672755X (2015)02007405收稿日期:20150315基金项目:江苏省农业三新工程项目(SXGC [2013]041)作者简介:丁永辉(1975 ),男,江苏丰县人,讲师,硕士,主要从事作物栽培的教学与研究㊂The Screenin g and Identification of an Anta g onism Strain K 2of Botr y tis cinereaDING Yon g -hui 1,CHEN Lin g -y in g 2,MEI Li -j uan2(1.Xuzhou Vocational Colle g e of Bioen g ineerin g ,Xuzhou 221006,China ;2.Yan g zhou Universit y ,Yan g zhou 225009,China )Abstract :One anta g onism strain of bacteria called K -2is se p arated from soil ,which can stron g l y anta g onize Botr y tis cinerea .After 5-da y s culture p late confrontation ex p eriment be -tween K -2and Botr y tis cinerea JY1-4,obvious bacteriostatic belt a pp ears with the bacteriosta -tios ratio of 66.19%,and 15da y s later stable antibacterial effect can still remains.Fermentationli q uor of K -2has si g nificant inhibitor y effect on s p ore g ermination of Botr y tis cinerea JY1-4with the bacteriostatios ratio of 100%.The mechanism of K -2a g ainst g erms p erforms that it can make h yp ha deform distorted and restrain bacteria conidium g ermination.The colonizationex p eriment in soil results shows that in the field of in -situ conditions the anta g onist K -2will re -duce survival rates for the influence of the indi g enous microor g anisms ,but it still has sustainedand stable p otential of anta g onism abilit y .Ke y words :Botr y tis cinerea ;anta g onism bacteria ;anta g onism番茄灰霉病是一种世界性重要病害,是影响番茄产量㊁品质㊁安全等的主要病害之一,在我国20世纪80年代开始发生和蔓延,呈逐年加重的趋势,近年来由于设施蔬菜的大规模发展,蔬菜灰霉病普遍发生,引起作物减产及连作障碍等问题[12]㊂相比广泛使用的化学药剂防治方法,生物防治具有安全㊁无污染㊁不产生抗药性等特点,成为当今病害防治的研究热点,对于病原拮抗菌的分离和研究越来越受到关注㊂目前研究较多的防治番茄灰霉病的微生物有:绿色木霉(T richoderma viride )㊁哈茨木霉(T richoderma harzianum )㊁木素木霉(T richoderma li g norum )㊁出芽梗短霉(Aureobasidium p ullulans )㊁浅白隐球酵母(Cr yp tococcu salbidus )㊁胶粘红酵母(Rhodotorula g luti -57第2期丁永辉,等:番茄灰霉病拮抗菌K2的筛选及鉴定nis)㊁球毛壳(Chaetomium g lobosum)㊁芽孢杆菌(Bacillus s pp.)㊁嗜麦芽黄单孢菌(Xanthomonas malto p hilia)等[35]㊂荧光假单胞菌(Pseudomonas f luorescens)是一类普遍存在于土壤和植物根际的微生物,可通过产生抗生素等生物活性物质来抑制病原菌的生长,现已证实它们可产生10余种具有抗菌作用的次生代谢产物,可抗P y thium ultimum等重要植物病原菌,其中2,4二乙酰基间苯三酚对许多病原微生物具有抑制或杀死作用,因此,荧光假单胞菌对生物防治灰霉病具有重要应用前景㊂本试验通过利用荧光假单胞菌的选择性培养基(KMB培养基),从蔬菜地土壤中分离获得一株对番茄灰霉具有显著抑制作用的拮抗菌K2,并对菌株的抑制效果㊁抑菌机制及其在土壤中的定殖能力进行了初步的研究,旨在为生物防治灰霉病提供材料和依据㊂1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试病菌番茄灰霉病菌Botr y tis cinerea JY14为扬州大学园艺与植保学院赠送㊂1.1.2土样采集拮抗菌筛选土样采自南京栖霞郊区的一块老蔬菜地的蚕豆㊁土豆根际土壤和蔬菜地的表层土壤以及扬州大学农学院试验田中的小麦根际土壤㊂拮抗菌存活试验所用土壤取自扬州市郊的蔬菜地㊂1.1.3培养基 1)KMB+++培养基:10g蛋白胨,10mL甘油,1.5g K2HPO4,1.5g M g SO4㊃7H2O,18g琼脂,自来水1000mL,抗生素含氨苄青霉素40μg㊃mL-1㊁氯霉素13μg㊃mL-1㊁放线菌酮100μg㊃mL-1,p H值7.2㊂2)KMB++培养基:抗生素含氨苄青霉素40μg㊃mL-1㊁氯霉素13μg㊃mL-1,p H=7.2㊂拮抗菌定殖能力的测定中培养基使用㊂3)PDA培养基:去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂18g,自来水1000mL,自然p H值㊂1.2试验方法1.2.1拮抗菌的分离筛选通过稀释平板分离土壤细菌,土壤经过10倍梯度稀释后,取不同稀释度的稀释液100μL涂布于KMB+++平板上,取合适的稀释度的平板培养物进行分离和纯化菌株,纯化后的菌株在PDA平板上和Botr y tis cinerea JY1-4用平板对峙法筛选拮抗菌株,选择对峙试验中能产生较大抑菌圈的菌株做进一步研究㊂1.2.2 拮抗菌K2发酵液的制备 KMB培养基活化菌株后(28ħ,24h),接种到10mL KMB培养液中,置于28ħ㊁100r㊃min-1的摇床上培养48h后,所得菌液为K2的发酵液㊂1.2.3拮抗菌K2对番茄灰霉病菌菌落的抑制效果方法同1.2.1中的平板对峙法,置于22ħ下恒温培养,每处理3个重复㊂观察平板上的抑菌现象,培养至对照霉菌菌落铺满整个培养皿时(约7d)计算菌落生长抑制率㊂菌落生长抑制率=(对照菌落面积―处理菌落面积)/对照菌落面积ˑ100%㊂1.2.4 拮抗菌K2对番茄灰霉病菌菌丝的影响在显微镜下观察对照番茄灰霉病菌菌丝和抑菌带边缘处的菌丝,观察其异同之处㊂1.2.5拮抗菌K2对番茄灰霉菌孢子萌发的影响取PDA平板上培养7d的番茄灰霉病菌,用无菌水配制孢子悬浮液106cfu㊃mL-1,取20μL滴加在载玻片上,再分别滴加20μL不同稀释度的发酵液,发酵液稀释度为1ˑ㊁1/10ˑ㊁1/50ˑ㊁1/100ˑ㊂混匀后置于22ħ下于培养皿中保湿培养,以滴加20μL无菌0.5%葡萄糖溶液作为对照,每处理4个重复,处理20h后观察孢子萌发情况,并计算拮抗菌对番茄灰霉病菌分生孢子的抑制率,同时观察芽管形态㊂孢子萌发抑制率=(对照萌发率―处理萌发率)/对照萌发率ˑ100%㊂1.2.6拮抗菌在不同p H值的KMB培养基中生长曲线测定活化拮抗菌K2,液体培养24h后,各取培养液1mL接种于装有10mL KMB液体培养基的试管中,培养基的p H值设5㊁6㊁7㊁7.24个处理,每处理接种8支试管,以对应p H值不接种的KMB液体培养基为对照,在22ħ下100r㊃min-1振荡培养,分别在培养的4㊁8㊁12㊁24㊁28㊁32㊁36㊁48h取出一支试管测定培养液的OD420值㊂吸光度用棱光UV757CRT紫外可见分光光度计测定㊂1.2.7低温条件下拮抗菌在KMB(p H=7.2)培养基中的生长曲线测定活化拮抗菌K2,液体培养24h后,各取培养液1mL于6支装有10mL KMB液体培养基的试管中,18ħ下100r㊃min-1振荡培养,以不接种的KMB液体培养基为对照,每隔12h取一支试管测定培养液的OD420值㊂1.2.8 拮抗菌在土壤中定殖能力的测定土壤按正常蔬菜种植施肥方式进行施肥,每公斤土壤含复合肥金 陵 科 技 学 院 学 报第31卷5.3g ,有机肥(蚯蚓粪)100g ㊂土壤分灭菌和不灭菌2种㊂用三角瓶盛装土壤,每瓶100g ,塞棉花塞,保持透气㊂灭菌土壤灭菌2h 后25ħ培养1d 再次灭菌,备用㊂液体培养拮抗菌K 248h ,培养液8000r㊃min -1离心5min 后无菌水洗涤,再次离心后加入无菌水,形成109cfu ㊃mL -1的菌悬液,按0.1mL ㊃g -1湿土的量加入菌悬液,与土壤混匀,25ħ培养,每个处理重复4次,以不加菌悬液的土壤为对照㊂分别在培养的0㊁3㊁7㊁15㊁30d 用KMB ++培养基进行平板分离,对拮抗菌K 2进行计数㊂1.2.9 K 2的生理生化特性及鉴定 参考‘伯杰氏细菌鉴定手册“第10版和‘常见细菌系统鉴定手册“(东秀珠等编著)对K2进行鉴定㊂2结果与分析图1 K2与番茄灰霉病菌平板对峙结果Fi g .1 Confrontation results between K2and Botr y tis cinerea on flat2.1 拮抗菌分离与筛选结果本试验从土壤中共分离得到8株对番茄灰霉病菌具有拮抗作用的细菌,根据平板对峙试验中抑菌圈的大小,选择拮抗性最强的菌株K 2作为本试验的目的高效菌株㊂菌株K 2经10次传代后仍保持较强的拮抗作用,平板对峙试验中培养15d 时仍能保持10mm 的抑菌圈,表明拮抗作用稳定㊂2.2 K 2对番茄灰霉病菌的抑制作用将拮抗菌K 2发酵液与番茄灰霉病菌在平板上对峙培养5d 后产生明显的抑菌带(图1),待对照处理中灰霉菌落铺满整个培养皿时,测定菌落生长抑制率可达66.19%,说明拮抗菌K 2拮抗能力较强㊂2.3 K 2对番茄灰霉病菌菌丝的影响镜检对峙培养中抑菌带边缘和对照的病菌菌丝,比较其变化情况,发现抑菌带区域的菌丝出现断裂㊁消融和菌丝细胞泡囊化现象,抑菌带边缘的菌丝呈现致密的泡囊(图2);而正常菌丝细长,光滑而均匀,有分支(图3)㊂图2 抑菌带区域灰霉病菌菌丝形态Fi g .2 Botr y tis cinerea m y celium forms in inhibition zone图3 正常灰霉病菌菌丝形态Fi g .3 Botr y tis cinerea m y celium normal form2.4 K 2发酵液对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用由表1可知:拮抗菌株对病菌孢子萌发具有明显的抑制作用,原发酵液处理灰霉病菌孢子20h 内抑制率达100%,随着稀释倍数的增加,抑制效果逐渐降低㊂此外,番茄灰霉病菌分生孢子经拮抗菌发酵液处理后,少量孢子虽可萌发,但萌发的芽管发生扭曲,且长度明显缩短㊂2.5 K 2在不同条件下的生存能力测定结果从图4可以看出,拮抗菌K 2在酸性条件的KMB 培养基中仍能很好生长,虽然在p H=5㊁p H=6条件下培养的前8h 内内生长缓慢,但在24h 后生长状况和p H=7.2条件下生长接近,说明拮抗菌K 2在酸性土壤环境中也能正常生长㊂从图5可以看出,拮抗菌K 2在低温条件下仍可在72h 内达到最高生长量,结合图4中拮抗菌K 2在22ħ下的生长情况可以看出,其在48h 左右达到的生长量与22ħ条件下同时期的生长量接近,说明拮抗菌K2可以在18ħ下生长良好㊂67第2期丁永辉,等:番茄灰霉病拮抗菌K2的筛选及鉴定表1K2发酵液对番茄灰霉病菌孢子的抑制作用Table1The inhibition of K2broth for Botr y tis cinerea s p ores处理浓度/(107cfu㊃mL-1)浓度对数孢子萌发率/%抑制率/%K2100ˑ9.00.00100.0010ˑ8.010.2389.772ˑ7.334.9865.021ˑ7.051.3848.62 CK--100.000.00图4K2在不同p H值条件下的生长曲线Fi g.4The g rowth curve of K2at different p H values图518ħ下K2的生长曲线Fi g.5The g rowth curve of K2at18ħ图6K2在土壤中的存活情况Fi g.6The survival of K2in the soil 注:S+K2为灭菌土壤接种K2;NS+K2为不灭菌土壤接种K2图6表明,拮抗菌K2在灭菌土壤和不灭菌土壤中的存活数量随着时间推移而逐渐减少,不灭菌土壤中35d时由于分离时稀释度过高,拮抗菌K2未被测出,但可以肯定其数量在干土中已经降到104cfu㊃g-1以下;而在灭菌土壤中,接种35d后拮抗菌K2仍能保持在107cfu㊃g-1干土的数量级,说明拮抗菌可以利用土壤中的营养存活,由于土壤经过灭菌,不存在与土壤中的土著微生物生存竞争的情况,因此,灭菌土壤中拮抗菌K2定殖能力较强㊂但在不灭菌土壤中,由于存在多种微生物,拮抗菌与土壤中的土著微生物存在生存竞争㊂2.6拮抗菌K2的生理生化特性测定结果对拮抗菌K2进行革兰氏染色㊁接触酶㊁硝酸盐还原能力㊁碳源利用情况等特性检测,结果见表2,初步鉴定为荧光假单胞菌(P seudomonas f luorescens)㊂表2拮抗菌K2生理生化特征7787金陵科技学院学报第31卷3结论与讨论利用拮抗菌防治灰霉病,可减轻灰霉病的发生,并减少化学农药使用量,降低病原菌的抗药性,也解决了农药残留问题,提高了农产品的安全和品质㊂目前对番茄灰霉病的生物防治研究工作有很多,获得了很多具有拮抗作用的微生物[314]㊂生防制剂在应用中存在的最大难题是活菌田间接种存活量难以达到要求[15]㊂温度㊁水分㊁土壤p H值㊁辐射㊁营养物质㊁毒物㊁土著微生物等因素既会影响拮抗菌株的存活,又会影响其拮抗作用的发挥㊂因此,能筛选到定殖能力强㊁稳定发挥拮抗作用的微生物是生物防治的关键㊂本研究从土壤中分离到一株番茄灰霉病菌拮抗菌K2,对其在平板上与Botr y tis cinerea JY1-4的拮抗作用和土壤中的定殖能力进行了测定,平板对峙试验的结果表明拮抗菌K2能使番茄灰霉病菌菌丝在生长过程中发生畸变,失去侵染能力,使孢子的萌发率下降,从而起到抑制番茄灰霉病菌生长的作用㊂拮抗菌K2在培养基中不同p H条件下的生长曲线表明其可以在酸性条件中存活,且可以在低温条件下达到较高生长量,说明其在田间灰霉病菌大发生的条件下有存活并发挥拮抗作用的可能性㊂土壤中定殖试验表明,拮抗菌K2在灭菌土壤中存活状况良好,在不灭菌土壤中定殖能力有所下降,可能是受到土著微生物的影响,但在一个月左右的时间内仍能在土壤中保持较高数量,说明该菌株具有长期在土壤环境中稳定发挥拮抗作用的能力㊂本研究仅对拮抗菌K2对番茄灰霉病菌Botr y tis cinerea JY1-4的抑菌效果和定殖能力做了初步研究,对于其抑菌机理并未深入探讨㊂对抑菌机理的了解有利于充分发掘和利用其拮抗性能,改进应用方法㊂对于可以产生抗性物质的拮抗菌,可通过微生物发酵法提取抗性物质用于灰霉病的防治,也可通过抗性基因的研究,采用DNA重组技术㊁细胞质融合技术构建出耐不良环境的工程菌株,稳定发挥抗性基因的作用㊂参考文献:[1]何美仙.番茄灰霉病的生物防治研究进展[J].中国蔬菜,2004(5):29-31[2]关天舒,朱茂山,李柏宏.番茄灰霉病的生物防治措施研究概况[J].辽宁农业科学,2009(1):39-41[3]Elad Y.Biocontrol Trichodema Harzianum T39Pre p aration for Biocontrol of Plant Disease Control of Botr y tis cinerea, Slerotinia Sclerotiorum and Clados p orium Fulvum[J].Biocontrol Science and Technolo gy,2000,10(4):499-507 [4]Elad Y,Fokkema N J.Control of Infection and S p orulation of Botr y tis cinerea on Bean and Tomato b y Sa p ro p h y tic Bac-teria and Fun g i[J].Euro p ean Journal of Plant Patholo gy,1994,100(5):315-336[5]DeMa y er G,Bi g iriman J,Elad Y,er al.Induced S y stemic Resistance in Trichoderma Harzianum T39Biocontrol of Botr y tis cinerea[J].Euro p ean Journal of Plant Patholo gy,1998,104(3):279-286[6]赵蕾.绿色木霉对灰霉病菌拮抗机制的初步研究[J].植物保护,1998,24(2):36-37[7]赵蕾,杨合同.蔬菜灰霉病生防菌的筛选与防效试验初报[J].应用与环境生物学报,1999,5(1):85-88[8]张中鸽,彭于发,张玉勋.多粘芽孢菌B48菌株抑菌作用[J].生物防治通报,1994,10(2):85-86[9]周明国.中国植物病害化学防治研究:第2卷[M].北京:中国农业科技出版社,2000:273-276[10]周明国.中国植物病害化学防治研究[M].北京:中国农业科技出版社,1998:278-281[11]Pristeche p a L I,Voitaka D V.Effectiveness of Trichoderminin p Protection of Tomato and Cucumber a g ainst Diseases[J].Bulletin of the Plish Academ y of Sciences Biolo g ical Sciences,1999,47(2-4):179-182[12]童蕴慧,徐敬友,陈夕军.灰葡萄孢拮抗细菌的筛选[J].中国生物防治,2000,16(3):123-126[13]童蕴慧,徐敬友,陈夕军,等.番茄灰霉病菌拮抗菌的筛选和应用[J].江苏农业研究,2001,22(4):25-28[14]DeMa y er G,Hofte M.Salic y lic acid Produced b y the Rhizo bacterium P sedudomonas aeru g inos a7NSK2induces resist-ance to leaf Infection b y Botr y tiscinerea in Bean[J].Ph y to p atholo gy,1997,87:588-593(责任编辑:湛江)番茄灰霉病拮抗菌K2的筛选及鉴定作者：丁永辉， 陈玲英， 梅丽娟， DING Yong-hui， CHEN Ling-ying， MEI Li-juan作者单位：丁永辉,DING Yong-hui(徐州生物工程职业技术学院,江苏 徐州,221006)， 陈玲英,梅丽娟,CHEN Ling-ying,MEI Li-juan(扬州大学环境科学与工程学院,江苏 扬州,225009)刊名：金陵科技学院学报英文刊名：Journal of Jinling Institute of Technology年，卷(期)：2015(2)引用本文格式：丁永辉.陈玲英.梅丽娟.DING Yong-hui.CHEN Ling-ying.MEI Li-juan番茄灰霉病拮抗菌K2的筛选及鉴定[期刊论文]-金陵科技学院学报 2015(2)。
番茄灰霉病拮抗芽孢杆菌LW-6-1的筛选、鉴定及抑菌活性研究
番茄灰霉病拮抗芽孢杆菌LW-6-1的筛选、鉴定及抑菌活性研究刘伟;宋双;沈小英;安天赐;牛小义;安德荣【摘要】[目的]从福建、四川、陕西等地耕作土壤中筛选对番茄灰霉病有较强生防效果的拮抗芽孢杆菌.[方法]随机采集福建、四川、陕西等地耕作土壤样品30份,采用平板稀释法从中分离芽孢杆菌,以番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌为靶标菌筛选拮抗芽孢杆菌;检测拮抗芽孢杆菌菌株无菌发酵液对供试病原真菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝形态的影响;通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析,对筛选出的拮抗菌株进行鉴定.[结果]从采集的30份土壤样品中分离得到273株芽孢杆菌,经病原真菌定向筛选后,得到1株对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌有较强生防效果的芽孢杆菌LW-6-1,LW-6-1菌株无菌发酵液对番茄灰霉病菌和稻瘟病菌菌丝生长的抑制效果较好,菌丝生长抑制率分别为95.34％和92.56％,EC50分别为10.18和10.84 mL/L;对抑制番茄灰霉病菌和稻瘟病菌孢子萌发的抑制率分别为93.98％和92.09％,EC50分别为2.03和2.67 mL/L.经鉴定,LW-6-1为甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmeth ylotrophicus.[结论]筛选到的拮抗芽孢杆菌LW-6-1对番茄灰霉病有较强的生防效果,能显著抑制番茄灰霉病菌的生长.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(041)011【总页数】7页(P73-79)【关键词】番茄灰霉病;拮抗芽孢杆菌;生物防治;甲基营养型芽孢杆菌【作者】刘伟;宋双;沈小英;安天赐;牛小义;安德荣【作者单位】西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S476.19;S154.39番茄灰霉病由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Persex Fr．)侵染所致，是一种世界性重要病害。
番茄青枯病拮抗微生物的构建及生防机理研究
番茄青枯病拮抗微生物的构建及生防机理研究番茄青枯病拮抗微生物的构建及生防机理研究引言：番茄青枯病是一种常见且具有较高危害性的植物病害，主要由于真菌Pseudomonas syringae pv. tomato引起。
传统的防治措施通常采用农药喷洒，但这种方法存在许多缺点，如环境污染、耗资较多等。
近年来，微生物拮抗技术逐渐崭露头角，成为一种新型的病害防治方法。
本文将探讨番茄青枯病拮抗微生物的构建及生防机理研究。
一、拮抗微生物的筛选拮抗微生物是一种能够抑制病原微生物生长并减少植物病害发生的微生物。
在筛选拮抗微生物时，常用的方法包括富集培养法、肉汤平板法和土壤富集法等。
通过这些方法，可以获得多种具有抗菌活性的微生物。
二、拮抗微生物的构建构建拮抗微生物是指通过基因工程技术，改良微生物菌株使其具有更好的拮抗效果。
构建拮抗微生物一般包括以下几个步骤：选取合适的拮抗菌株，筛选和克隆拮抗相关基因，通过基因转导技术将这些基因导入到目标微生物菌株中，并测试其拮抗效果。
三、拮抗微生物的生防机理拮抗微生物通过多种方式对抗病原微生物，从而达到防治病害的效果。
常见的生防机理包括：产生抗生物质、产生竞争性排除物、诱导植物免疫系统、产生辅助生长物质等。
其中，抗生物质是拮抗微生物中最常见且具有重要作用的一种机制，通过产生抗生物质可以抑制病原微生物的生长和发展。
四、案例研究以拮抗微生物A为例，进行了番茄青枯病的生防实验。
首先，筛选到A能够抑制Pseudomonas syringae pv. tomato的生长。
然后，通过分析A的代谢产物，发现它产生了一种抗生物质X，该抗生物质对Pseudomonas syringae pv. tomato具有很强的杀菌作用。
进一步实验证实，A能够通过产生抗生物质X来有效抑制番茄青枯病。
五、应用前景拮抗微生物作为一种新型的生物防治方法，具有许多优点，如无环境污染、生态友好以及能够形成持久性对抗病原微生物等。
一株拮抗番茄叶霉病菌的放线菌筛选、鉴定及发酵条件研究
进行扫描电镜样品加工处理。样品用 /6 戊二醛室 磷酸缓冲液 （ :;0<"） 冲洗 & 8 0 次， 温下固定 7 8 09， 每次间隔 /,’=>。后经系列丙酮脱水、 醋酸异戊酯 粘样、 镀膜后在扫描电镜下 置换、 ?@! 临界点干燥、 观察菌丝和孢子形态。 参照 《链霉菌鉴 !"%"$ 培养特征和生理生化特征： ［"］ 定手册》 中推荐的部分培养基 （表 7） 和方法进行， !"# 培养 $! 8 $&% 后观察记录特征。 采用快速薄板层析法 !"%"# 细胞壁化学成分分析：
抗菌谱广。其形态特征、 培养特性、 生理生化特性、 细胞壁 #? 种常见植物病原真菌和 & 种细菌有较好的抑制效果， 相同， 组分与放线菌中的淡紫灰链霉菌 （ ()*+,)-./0+1 #&$+23"#&+） >&2 R.S( 序列同源性达 66T&U 。研究发现该菌的摇 瓶发酵配方和培养条件为： 大豆粉 #U 、 葡萄糖 #U 、 （ SW! ） 起始 XW "T$、 S;18 $T%U 、 1;1V? $T#U 、 #%Y 、 # 2V! $T?#U ， 摇瓶培养 &I， 这些结果为该菌株今后的应用、 抗生素的分离提纯和产业化提供了实验依据。 >%$R9ABA、 关键词：番茄叶霉病菌；链霉菌；鉴定；抗菌谱；发酵条件 中图分类号： Z6?6； Z6?/ 文献标识码： ( 文章编号： $$$>=&#$6（#$$"）$!=$&##=$&
［$7］ 。 验结果， 进行分析得到发酵配方
菌的 )*+ 平板中央 （平板制备方法同上） ， 杯中加入 分别置 !&# 培养 /% （ 真菌） 、 !,, ( 无菌发酵滤液， ! （细菌） 后测定抑菌圈直径。 !"# 培养 $% !"% 菌株鉴定
番茄灰霉病菌生物防治菌的筛选试验
番茄灰霉病菌生物防治菌的筛选试验
孙军德;刘灵芝;王辉;鲁婷婷;张玉龙
【期刊名称】《沈阳农业大学学报》
【年(卷),期】2005(036)005
【摘要】采用多种筛选方法,从保护地土壤和番茄病果上,分离筛选对灰霉病菌有营养竞争和抑制作用的菌株.结果表明,在分离获得的细菌165株、真菌93株、放线菌210株中,细菌、真菌以营养和空间竞争作用为主,而放线菌生长缓慢,以产生抑菌物质为主,约有20%的放线菌表现出有抑菌作用;离体叶筛选灰霉病生防菌结果表明,细菌x24、x28,真菌z45、z120与放线菌f15、f111、f163均具有较好防治效果.【总页数】4页(P550-553)
【作者】孙军德;刘灵芝;王辉;鲁婷婷;张玉龙
【作者单位】沈阳农业大学,土地与环境学院,沈阳,110161;沈阳农业大学,土地与环境学院,沈阳,110161;沈阳农业大学,土地与环境学院,沈阳,110161;沈阳农业大学,土地与环境学院,沈阳,110161;沈阳农业大学,土地与环境学院,沈阳,110161
【正文语种】中文
【中图分类】S436.412.1.3;S482.2.92
【相关文献】
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国;席雪冬
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番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究张根伟;张丽萍;李书生;程辉彩【摘要】[ Objective ] The aim was to screen endophytic antagonistic bacteria and study it' s inhibitive substance to control tomato gray mold. [Method] Forty-six endophytic antagonistic bacteria strains were isolated from 65 healthy tomato plants which had antimicrobial activity to control tomato gray mold, and one strain which could produce antimicrobial substances was screened out by using PDA well-diffusion method. The inhibition of antimicrobial substances to mycelium and spores of Botrytis cinerea was studied, and the antimicrobial substances was i-dentified through acid precipitation, Sephadex G-50 gel chromatography and agarose gel electrophoresis analysis primarily. [ Result] It was observed under microscope that the antibacterial substances had the mechanism of tearing cell membrane. The antimicrobial substances was identified as 3. 3 kDa of proteins or polypeptide primarily. [ Conclusion] The research result provides reference for the development of new biocon-trol preparation.%[目的]筛选番茄灰霉病内生拮抗菌并研究其抑菌物质.[方法]从65株健康番茄植株中分离到内生拮抗细菌46株,在此基础上通过PDA培养基打孔扩散法进行复筛,获得了1株强烈抑制灰葡萄孢菌的抑菌物质产生菌.研究了该抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用,并经酸沉淀、Sephadex G-50凝胶层析纯化、琼脂糖凝胶电泳分析对其进行了初步鉴定.[结果]显微镜观察发现该抑菌物质具有列膜抑菌机制,初步鉴定抗菌物质为3.3 kDa左右的多肽类物质.[结论]为开发新的生防制剂奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)030【总页数】3页(P14789-14791)【关键词】内生菌;短小芽孢杆菌;灰葡萄孢菌;抑菌物质【作者】张根伟;张丽萍;李书生;程辉彩【作者单位】河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081【正文语种】中文【中图分类】S182由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是番茄生产上的一种世界性气传真菌病害，可侵染花、果、叶、茎多个部位，低温、高湿环境利于发病，常常造成较大损失［1］。
目前主要使用化学杀菌剂进行防治，由于病原菌易变异产生抗药性，使得化学杀菌剂的使用浓度不断增加，对人体和环境构成威胁。
生物防治由于其高效、低毒、安全等特性成为近年来的研究热点，而植物内生拮抗细菌由于与植物的长期共生关系，成为公认的很有发展潜力的生防菌株筛选来源。
为此，笔者进行了番茄内生菌的分离，筛选出对蔬菜灰霉病菌具有强烈抑制作用的抗菌物质产生菌，并对抗菌物质进行了初步鉴定，以期为开发新的生防制剂奠定基础。
1 材料与方法1.1 病原菌灰葡萄孢菌由河北省科学院生物研究所在番茄上分离得到。
1.2 方法1.2.1 内生细菌的分离纯化。
将采集的健康番茄的根、茎、叶等组织及种子经表面消毒后，无菌水冲洗4次，样品在研钵中研磨，稀释平板法分离内生细菌，30℃培养2～3 d后挑取菌落形态差异明显的菌落保存备用。
1.2.2 拮抗菌的分离与筛选［2］。
对分离的菌株在PDA培养基上与灰葡萄孢菌对峙培养初筛，24℃培养3～5 d，挑取、保存抑菌圈大的菌株。
将初筛菌株在NB培养基液体摇瓶培养，28℃培养3 d，发酵液离心，取上清用0.45 μm过滤器除菌，在病原菌高氏平板上打直径4 mm孔，滴加100 μl发酵滤液，平板扩散法对峙培养，观察抑菌圈，进行复筛，筛选抑菌圈大的抗菌物质产生菌。
1.2.3 抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用。
挑取抑菌圈周围灰葡萄孢菌的菌丝，显微镜观察菌丝形态;将稀释至不同倍数的无菌滤液与同体积加入5%葡萄糖的番茄灰霉病菌分生孢子(浓度1×108cfu/ml)悬浮液混合，以无菌水加同体积孢子悬浮液为对照，滴入凹玻片，(25±1)℃保湿培养，12、18、24 h后显微镜观察灰葡萄孢菌孢子萌发的变化情况，统计抑制率。
1.2.4 抑菌物质的初步鉴定。
1.2.4.1 Sephadex G-50柱层析分离。
将NB培养基的发酵液过滤除菌，用pH2.5的盐酸沉淀过夜，沉淀用60%乙醇抽提、冷冻干燥后，用蒸馏水溶解经Sephadex G-50凝胶层析纯化，检测波长为280 nm，收集各个吸收峰，进行抑菌活性测定。
1.2.4.2 Tricine-SDS-PAGE检测。
截留具有活性的峰，参考《蛋白质电泳试验技术》［3］进行琼脂糖凝胶蛋白电泳分离，低分子量蛋白肽电泳方法见参考文献［4］，对分离的条带进行抑菌活性测定。
1.2.4.3 蛋白酶K和胃蛋白酶处理。
将蛋白酶K和胃蛋白酶配成5 mg/ml的溶液，分别取0.1 ml于离心管中，分别加入发酵液0.4 ml，使酶的终浓度为1 mg/ml，蛋白酶K调pH至7.0左右，胃蛋白酶pH调至2.0～3.0，同时以0.l ml双蒸水加入0.4 ml发酵液作为对照，37℃温育4 h，测定抑菌活性的变化。
2 结果与分析2.1 菌株的筛选2.1.1 拮抗菌的初筛。
从河北石家庄周边菜地采集番茄植株65个，稀释平板法分离得到内生细菌432株。
以灰葡萄孢菌为指示菌，平板对峙培养筛选出46株具有拮抗作用，其中25株具较强拮抗作用，抑菌圈直径均大于2.5 cm。
2.1.2 抗菌物质产生菌复筛。
采用平板扩散法进行复筛，得到8株对灰葡萄孢菌有较强抑制作用的抑菌物质产生菌，抑菌圈直径均超过了21.3 mm(表1)，其中以D-1菌株抑菌圈直径最大，达到25.5 mm。
7 d后D-1的抑菌圈缩小不明显，说明产生的抗菌物质性质稳定。
2.2 抗菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用显微镜下可见菌丝有膨大、断裂、自溶现象(图1);孢子有膨大变形、内容物溢出现象，不能萌发形成菌丝(图2)，说明该抑菌物质具有裂膜抑菌机制。
表1 内生细菌发酵滤液对灰霉菌的抑制作用 mm菌种编号抑菌直径菌种编号抑菌直径D-1 25.5±1.2 C-11 22.5±0.1 B-3 24.3±1.1 D-13 21.9±0.2 C-423.4±1.0 D-18 21.7±0.9 A-7 22.8±1.1 B-20 21.3±1.2由表2可知，抑菌物质D-1原液对孢子萌发抑制率可达98.9%，随着稀释倍数的增大，抑制率有所降低，当稀释倍数为100倍时，抑制率为53.4%。
图1 菌丝形态(×400倍)图2 孢子形态(×400倍)表2 D-1发酵滤液对番茄灰霉病分生孢子萌发的影响 %稀释倍数萌发率抑制率11.1 98.9 10 3.2 96.7 20 16.2 83.4 100 45.5 53.4 CK 97.5 -2.3 抗菌物质的初步鉴定2.3.1 Sephadex G-50柱层析分离结果。
发酵滤液经盐酸沉淀、乙醇抽提，通过Sephadex G-50柱层析，出现2个洗脱峰(图3);活性检测结果表明，峰2具有抑制灰葡萄孢菌活性(图4)。
2.3.2 Tricine-SDS-PAGE测定抗菌物质的分子量。
纯化样品经Tricine-SDS-PAGE电泳分离，用考马斯亮蓝染色脱色后，在凝胶上只出现1条明显谱带(图5)，根据Marker谱带位置，初步确定该条带分子量为3.3 kDa左右。
抑菌活性检测表明，该谱带具有抑菌活性。
图3 抗菌物质的Sephadex G-50柱层析图谱图4 峰2的抑菌效果2.3.3 蛋白酶K、胃蛋白酶处理稳定性。
结果表明，该抑菌物质经蛋白酶K、胃蛋白酶处理后抑菌活性未下降。
图5 Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳结果综上，初步判定该抑菌物质可能为3.3 kDa左右的多肽类物质。
3 讨论植物内生菌是指其生活史阶段生活在活性植物组织中又不引起明显病害的微生物，该类菌对许多作物病害显示出良好的控制效果，具有多种生物学功能，已成为植物病理学、微生物学、植物学等许多学科研究的热点。
目前国内针对番茄内生细菌的研究报道很少，参考国外对其他植物内生细菌的研究，有学者认为植物内生菌由于长期的共生关系，更易分离得到抑制植物病害的拮抗微生物，且一般对植物无害［5］。
该试验从健康番茄植株分离到强烈抑制灰葡萄孢菌的内生拮抗菌D-1，该菌株产生的抑菌物质具有列膜抑菌机制，对孢子的萌发抑制率可达98.9%，稀释100倍仍有53.4%的抑制率;抑菌物质初步鉴定为3.3 kDa左右的多肽类物质。
多肽类抗菌物质大多具有良好的内吸性，有望开发成为新的生防制剂，对其结构、性质的进一步鉴定有待进一步研究。
参考文献［1］杨燕涛.国内保护地蔬菜灰霉病侵染规律及防治技术研究进展［J］.农药，2003，42(l):6-10.［2］张铎，谢莉，张蕾，等.棉花黄萎病拮抗内生菌的筛选鉴定及抗菌物质研究［J］.河北师范大学学报，2008，32(5):673-676.［3］郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.3版.北京:科学出版社，2005:92-118. ［4］曹佐武.小分子肽的Tricine-SDS-PAGE分离方法［J］.生物学通报，2003，38(3):55-56.［5］FISHER P J，PETRINI O，LAPPIN SCOTT H M.The distribution of some fungal and bacterial endophytes in maize(Zea mays L.)［J］.New Phytol，1992，122(2):299-305.。