番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究

番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究

张根伟;张丽萍;李书生;程辉彩

【摘要】[ Objective ] The aim was to screen endophytic antagonistic bacteria and study it' s inhibitive substance to control tomato gray mold. [Method] Forty-six endophytic antagonistic bacteria strains were isolated from 65 healthy tomato plants which had antimicrobial activity to control tomato gray mold, and one strain which could produce antimicrobial substances was screened out by using PDA well-diffusion method. The inhibition of antimicrobial substances to mycelium and spores of Botrytis cinerea was studied, and the antimicrobial substances was i-dentified through acid precipitation, Sephadex G-50 gel chromatography and agarose gel electrophoresis analysis primarily. [ Result] It was observed under microscope that the antibacterial substances had the mechanism of tearing cell membrane. The antimicrobial substances was identified as 3. 3 kDa of proteins or polypeptide primarily. [ Conclusion] The research result provides reference for the development of new biocon-trol preparation.%[目的]筛选番茄灰霉病内生拮抗菌并研究其抑菌物质.[方法]从65株健康番茄植株中分离到内生拮抗细菌46株,在此基础上通过PDA培养基打孔扩散

法进行复筛,获得了1株强烈抑制灰葡萄孢菌的抑菌物质产生菌.研究了该抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用,并经酸沉淀、Sephadex G-50凝胶层析纯化、琼脂糖凝胶电泳分析对其进行了初步鉴定.[结果]显微镜观察发现该抑菌物质具有列膜抑菌机制,初步鉴定抗菌物质为3.3 kDa左右的多肽类物质.[结论]为开发新的生

防制剂奠定了基础.

【期刊名称】《安徽农业科学》

【年(卷),期】2012(000)030

【总页数】3页(P14789-14791)

【关键词】内生菌;短小芽孢杆菌;灰葡萄孢菌;抑菌物质

【作者】张根伟;张丽萍;李书生;程辉彩

【作者单位】河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研

究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081

【正文语种】中文

【中图分类】S182

由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是番茄生产上的一种世界性气传真

菌病害，可侵染花、果、叶、茎多个部位，低温、高湿环境利于发病，常常造成较大损失［1］。目前主要使用化学杀菌剂进行防治，由于病原菌易变异产生抗药性，使得化学杀菌剂的使用浓度不断增加，对人体和环境构成威胁。生物防治由于其高效、低毒、安全等特性成为近年来的研究热点，而植物内生拮抗细菌由于与植物的长期共生关系，成为公认的很有发展潜力的生防菌株筛选来源。为此，笔者进行了番茄内生菌的分离，筛选出对蔬菜灰霉病菌具有强烈抑制作用的抗菌物质产生菌，并对抗菌物质进行了初步鉴定，以期为开发新的生防制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病原菌灰葡萄孢菌由河北省科学院生物研究所在番茄上分离得到。

1.2 方法

1.2.1 内生细菌的分离纯化。将采集的健康番茄的根、茎、叶等组织及种子经表面

消毒后，无菌水冲洗4次，样品在研钵中研磨，稀释平板法分离内生细菌，30℃

培养2～3 d后挑取菌落形态差异明显的菌落保存备用。

1.2.2 拮抗菌的分离与筛选［2］。对分离的菌株在PDA培养基上与灰葡萄孢菌对峙培养初筛，24℃培养3～5 d，挑取、保存抑菌圈大的菌株。将初筛菌株在NB

培养基液体摇瓶培养，28℃培养3 d，发酵液离心，取上清用0.45 μm过滤器除菌，在病原菌高氏平板上打直径4 mm孔，滴加100 μl发酵滤液，平板扩散法对峙培养，观察抑菌圈，进行复筛，筛选抑菌圈大的抗菌物质产生菌。

1.2.3 抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用。挑取抑菌圈周围灰葡萄孢菌

的菌丝，显微镜观察菌丝形态;将稀释至不同倍数的无菌滤液与同体积加入5%葡萄糖的番茄灰霉病菌分生孢子(浓度1×108cfu/ml)悬浮液混合，以无菌水加同体积

孢子悬浮液为对照，滴入凹玻片，(25±1)℃保湿培养，12、18、24 h后显微镜观察灰葡萄孢菌孢子萌发的变化情况，统计抑制率。

1.2.4 抑菌物质的初步鉴定。

1.2.4.1 Sephadex G-50柱层析分离。将NB培养基的发酵液过滤除菌，用pH

2.5的盐酸沉淀过夜，沉淀用60%乙醇抽提、冷冻干燥后，用蒸馏水溶解经Sephadex G-50凝胶层析纯化，检测波长为280 nm，收集各个吸收峰，进行抑

菌活性测定。

1.2.4.2 Tricine-SDS-PAGE检测。截留具有活性的峰，参考《蛋白质电泳试验技术》［3］进行琼脂糖凝胶蛋白电泳分离，低分子量蛋白肽电泳方法见参考文献［4］，对分离的条带进行抑菌活性测定。

1.2.4.3 蛋白酶K和胃蛋白酶处理。将蛋白酶K和胃蛋白酶配成5 mg/ml的溶液，分别取0.1 ml于离心管中，分别加入发酵液0.4 ml，使酶的终浓度为1 mg/ml，