蛋白质分离纯化的方法

蛋白质分离纯化的方法

分离纯化蛋白质的四种关键性方法

分离蛋白质的方法有许多种，应根据原材料和生产条件来选择具体的分离纯化方法。例[5][6]如:李凤英等用盐溶法提取葡萄籽的蛋白质。李喜红等用酶法从脱脂米糠中提取蛋白质。

[7]郭荣荣等碱法与酶法与酶法提取大米蛋白工艺及功能特性比较研究得出结论是碱法提取的大米蛋白持水性、吸油性和起泡性优于酶法提取的大米蛋白，而酶法提取的大米蛋白的溶

[8]解性、乳化稳定性和泡沫稳定性优于碱法提取的大米蛋白。王桃云等就是运用这种方法配

[9]合使用加热法提取葎草叶蛋白。陈申如等用酸法提取了鲢鱼鱼肉蛋白质，提取的蛋白质无腥味，色泽洁白，蛋白质产率高，可达90%左右。以下介绍四种分离纯化蛋白质的方法。

1区带离心法

区带离心法是分离蛋白质的有效而且常用的方法。该法的第一步是在离心管中形成一个密度梯度(常用蔗糖梯度)，然后将待分离的蛋白质混合液放在密度梯度顶端。超速离心时，蛋白质即通过密度梯度移动，并根据其沉降系数而被分开，最后各种蛋自质在离心管内被分离成各户独立的区带，可以在管底刺一小孔逐滴放出，分部收集。

2 层析法

最常用的层析法是凝胶过滤和离子交换柱层析。

[10-12]2.1 凝胶过滤(GFC)

凝胶过滤也叫凝胶色谱和分子筛层析，是利用凝胶的网状结构根据分子的大小和形状进行分离的方法。凝胶过滤是一种快速而简便的分离分析技术，可用于蛋白质的脱盐、分离、提纯、分析等等。柱中的填充料是水合程度高而不溶的碳水化合物高聚物，最常用的是葡聚糖凝胶〔其他有聚丙烯酞胺凝胶和琼脂糖凝胶等)。仙聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，不同型号的葡聚糖凝胶其“网眼”大小不同，可以用来分离纯化不同分子大小的物质。当蛋白质混合物通过层析柱时，比“网眼”大的蛋自质分子不能进入凝胶颗粒内部，不能沿着颗粒间隙流动，流程短，流速快，最先流出柱外;比“网眼”小的分子则进入凝胶颗粒内部，沿着孔道移动，从一个颗粒流出，又进入另一颗粒，所以下移速度慢，随后被洗脱下来。这样，不同分子大小的蛋白质由于流经距离不同而得到分离。根据欲分离蛋白质混合物的相

[13]对分子质量的上限和下限选择合适的凝胶。凝胶过滤由于上样量受到柱床体积限制，常用在纯化路线的最后一步，此时的样品蛋白溶液杂质量很低了，经过凝胶过滤就可纯化。当

[14]然，根据样品蛋白溶液的特征，也有把凝胶过滤放在提纯最初步骤中的。

而在在基因工程药物蛋白质的生产中,必须要采取一些合理的措施保护目的蛋白质的活性及稳定性,如在缓冲液中添加还原剂(如二硫苏糖醇)阻止巯基基团被氧化,添加蛋白酶抑制剂防止蛋白质的降解,添加金属鳌合剂(如EDTA)除去重金属离子等,维持蛋白质的结构并保[15、16]持其活性。

[17、18]2.2 离子交换柱层析

离子交换色谱广泛地应用于分离各种生物大分子，且在实际工业纯化过程中包括一步或

[19]几步离子交换的步骤。传统的离子交换色谱一般采用多糖类凝胶作为基质，存在机械强度差、承受压力小等缺点，不能进行快速淋洗，且分离时间长，易

造成生物分子的变性、失[20]活。无机硅胶填料机械强度大、柱效高、孔径和颗粒大小易于控制，但PH应用范围窄(2.0-8.0)，在蛋白质分离过程中硅胶表面残余的硅羟基对蛋白质产生不可逆吸附等缺陷，

[21]从而导致蛋白质的质量回收率低，生物活性损失。硅胶涂敷固定相在连续使用中涂层易

[22、23]脱落、稳定性差。.聚合物基质固定相具有良好的生物兼容性、化学稳定性及易于被衍生化的优点，在生物大分子分离中的地位越来越重要。它的亲水性减小了基质与蛋白之间发生非特异性相互作用的机会，也可在PH=1一12内广泛使用。

离子交换是指液相中的离子与固相(交换剂)上活性基团离子的可逆交换反应，利用此反应将要分离的混合物先在一定pH值的溶液中全部解离，而后流过固相使之与固相上的离子进行交换，吸附于固相上。再根据混合物中各组分解离度的差别，用不同pH值的溶液分别[24]洗脱下来。离子交换还可以与其他方法结合使用。例如HirokiTsukamoto等利用凝血酶和离子交换色谱成功分离纯化了融合蛋白。

分离蛋自质常用的交换剂是纤维素离子交换剂。在纤维素上引入不同的活性基团(分酸性和碱性)，即成为不同类型的离子交换剂，其中，酸性基团能解离出H+于溶液中的阳离子交换，称为阳离子交换剂;碱性基团能解离出OH一与溶液中的阴离子交换，称为阴离子交换剂。常用的阳离子交换剂是弱酸型能羧甲基纤维素(CM一纤维素)，阴离子交换剂是弱碱型的二乙氨基乙基纤维素(DEAE一纤维素)。纤维素离子交换剂对蛋白质的交换容量大，分辨率高，能获得较好的分离效果及较高的回收率。此外，在与液相中的离子交换后，对离子的吸附力较弱，在较温和的条件下即可被洗脱下来，不影响蛋白质的活性。蛋白质混合物的分离可由改变溶液中盐类离子强度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先被洗脱下

来。离子交换层析的一个重要改进是:把离子交换和分子排阻两种效应结合起来，用于这种层析的材料有DEAE一葡聚糖。

由于颗粒小、刚性好，对改善柱效、提高样品的质量回收、保持溶质的生物活性十分有利，特别适合于生物大分子的高分辨分离与快速分析。.层析过程并不产生明显的热量,放大

[25、26]可采用加大柱径和高度的方法。运用计算机进行控制,还可实现操作过程的自动化。 3 电泳

在外加电场的影响下，如果蛋白质不处于等电点状态，它将向着与其自身电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电泳是分离蛋白质和鉴定蛋白质纯度的重要方法，由于不同的蛋白质分子所带的净电荷及分子大小和形状不同，因而泳动速度不同，移动距离不同，从而得到分离。电泳的类型很多，常用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)聚合而成的网状结构物，“网孔”大小可以通过改变Acr和Bis的含量来控制。凝胶具有分子筛的作用，比“网孔”大得多的分子几乎不能移动，比“网孔”小的分子极易通过凝胶而移动，大小居中的分子则以各种不同的难易程度通过凝胶而移动，聚丙烯酰胺凝胶电泳系统可以是连续的，也可以是不连续的。常用不连续的电泳系统，即由两种不同浓度的凝胶，pH及缓冲剂成分组成的电泳系统。这种电泳系统具有高度的筛选效应和浓缩效应。电泳样品首先经过浓缩胶，被压缩成薄层，再进入分离胶电泳分离。这样，减少了电泳各成分间由于扩散而造成的区带重叠，提高了电泳的分辨能力。

在聚丙烯酰胺凝胶中加有SDS(十二烷基硫酸钠)的电泳称为SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳。SDS能破坏蛋白质中几乎所有的非共价键，使蛋白质变性。并且，SDS 和蛋白质结合成净负电荷很多的SDS一蛋白质复合物，复合物的电荷量大大超过了