乌司他丁预防重症中暑小鼠早期肠粘膜屏障功能损害的实验研究

Occludin和ZO-1与血浆DAO活性(P<0.001,相关系数分别为r=-0.7640、-0.8003)和D-乳酸浓度(P<0.001,相关系数分别为r=-0.7215、-0.7639)呈显著负相关。这一结果提示DAO活性及D-乳酸浓度能较好反映中暑小鼠肠粘膜屏障功能。
2.8 TUNEL法肠粘膜细胞原位凋亡检测42℃C热打击组绒毛顶端及隐窝部可见较多的凋亡细胞。对照组、40℃C热打击组和42℃C热打击组的凋亡指数(AI)分别为3.95±0.96,9.55±2.20和33.72±6.14,与对照组比较,40℃C热打击组和42℃热打击组第细胞凋亡指数均具有显著统计学意义(χ2=47,P=0.000)。
乌司他丁(Ulinastatin,UTI)是从男性尿液分离纯化出来的尿胰蛋白酶抑制剂,能同时抑制磷脂酶A2,胰蛋白酶,弹性蛋白酶等多种水解酶活性;此外,还有改善休克时的循环状态,抑制心肌抑制因子的产生,抑制炎症介质的释放,稳定溶酶体膜等功能,目前广泛应用于临床。目前研究已证实UTI对多种疾病造成的肠粘膜损伤具有保护作用,然而对于UTI是否也对重症中暑肠粘膜损害具有保护作用,目前较少报道。
观察药物治疗效应所有动物均在成模后复温12h处死动物。组织病理和电镜观察各组小鼠肠粘膜组织形态学的改变;细菌学方法观察肠道细菌向肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph nodes,MLN)、肝、脾、肾等移位的频率及组织细菌含量;鲎试剂比色法检测血清内毒素;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA法)检测腔静脉血浆LPS、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-a(Tumornecrosis factor-a,TNF-a)的含量;免疫组化观察TJ蛋白(紧密连接蛋白)Occludin和ZO-1表达;TUNEL法检测肠粘膜上皮细胞凋亡率。
统计学处理所有数据录入SPSS17.0统计软件进行统计学分析,计量资料采用x±s表示,两组资料的均数比较采用t检验。多组间均数比较采用单因素方差分析,若方差齐采用LSD法进行组间比较,方差不齐则采用Games-Howell方法进行组间比较,P<0.05认为有统计学意义。
结果本课题研究主要结果如下1、通过建立的小鼠中暑动物模型,采用鲎试剂比色和酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的技术方法,研究肠粘膜屏障功能的变化对中暑后早期全身炎症反应的影响。使用Kaplan-Mier曲线和Log Rank检验评估中暑小鼠生存时间和生存率的改变。
后来一系列的实验室研究也发现,热打击与肠道衍生脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)有关,而去除LPS或治疗内毒素血症后,则对中暑预后有利,这些结果提示了内毒素血症中炎性细胞因子反过来加重肠粘膜损害,二者形成互为作用、互为因果。因此,要预防中暑肠源性内毒素血症和细菌移位发生,除“快速降温”外,针对于改善肠粘膜屏障功能的“第二关键点”治疗策略同样具有重要意义。
肠屏障功能可因各种因素而改变,各种刺激因素致肠粘膜屏障功能损伤后,使肠内细菌移位,内毒素、细菌、抗体介质不断进入血液和淋巴液,导致多种炎症介质释放,引发和加重失控性炎症反应综合征,而SIRS的发生更加重了肠道损伤,形成恶性循环,最终导致MODS。在对重症中暑的研究中已发现存在胃肠病变,包括肠道粘膜受损,肠上皮细胞凋亡、肠通透性增加等。
乌司他丁预防重症中暑小鼠早期肠粘膜屏障功能损害的实验研究
研究背景和目的随着全球气候变暖以及热浪袭击频率和强度的逐年增加,中暑(Heatstroke,HS)的发病率明显增加。中暑如未得到正确救治,可能导致严重的多脏器损害,病死率高达10%～50%。
目前对于中暑研究的普遍观点认为,中暑的病理生理学反应不仅仅是由热暴露的直接损伤引起的,而更多的是一种继发于热损伤之后的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory responsesyndrome,SIRS),进而引发多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的过程。既往研究表明肠道作为体内最大的“储菌库”和“内毒素库”,以其在体内独特的生理环境参与SIRS和MODS的病理生理过程,因此肠道被称之为“MODS的原动力”。
结果发现:1.1热打击过程中核心体温变化呈“双峰”样改变,在小鼠遭受热打击前15min先迅速升高到达39℃左右,15min～30min又迅速降至近38℃,之后随着热打击时间而逐渐上升,在体温达到41℃之前有一段较长的稳步上升期,其后当体温达到41℃后上升幅度加大,迅速上升至42℃以上。当小鼠体温到达42℃时生命体征极不稳定,可在短短10～30min体温急剧上升到43℃以上并死亡。
2.6免疫组化检测肠道TJ蛋白Occludin和ZO-1表达常温对照组的TJ蛋白Occludin和ZO-1均匀一致的分布于小肠粘膜上皮细胞连接处的尖端,呈蜂巢状;40℃热打击组的Occludin和ZO-1表达分布较一致,但与对照组比较表达减少;40℃热打击组Occludin和ZO-1表达显著减少,染色浅见图2-6和2-7。通过计算免疫组化平均OD值发现:热打击组Occludin和ZO-1蛋白的0D值明显低于对照组,各组之间比较有显著统计学意义(p<0.05),这一结果提示中暑后肠道精密连接受损,即中暑可能早期诱导细胞旁途径的肠粘膜屏障损伤。
2.2电镜观察肠粘膜损伤40℃热打击后小鼠肠黏膜上皮细胞表面微绒毛排列尚整齐,部分上皮细胞轻度肿胀,线粒体肿胀、灶性空化,粗面内质网轻度扩张;42℃热打击后上皮细胞微绒毛稀疏、排列不整、呈倒伏状、部分缺如,上皮细胞连接增宽、形成大量指状突起,部分紧密连接增宽或开放,部分上皮细胞胞质可见空泡样结构,线粒体肿胀,内质网扩张。与对照组比较,热打击组小鼠肠粘膜超微结构改变明显。
2.3小鼠热打击后各脏器细菌检出情况40℃热打击组样本和对照组无显著差异,42℃热打击组小鼠细菌检出了显著高于对照组和40℃热打击组(χ2=100,p=0.000)。2.4中暑小鼠早期出现肠粘膜屏障功能损害对照组比较,血浆中DAO活性在40℃热打击轻度升高,42℃热打击后显著升高,与对照组和40℃热打击组比较有显著统计学意义(F=33.928,P=0.000)。
本研究选取小鼠核心体温达到40℃及42℃后行复温观察,结果发现不同程度热打击后进行复温的体温可短时间(30min)迅速下降,并且热打击程度越重复温时体温降的越低。1.2小鼠全身炎症反应观察小鼠腔静脉血浆LPS、TNF-a和IL-6水平与热打击程度及复温时间相关。
使用重复测量方差分析方法,得到温度与血浆LPS存在交互效应(F=12.685,P<0.001),与对照组比较,40℃组小鼠在复温1h开始血浆LPS开始升高,复温3h显著上升,至24达高峰;42℃组小鼠血浆LPS浓度在热打击后Oh即明显上升,其上升幅度明显大于40℃组。与对照组和40℃组小鼠比较,42℃组小鼠血浆TNF-a和IL-6水平显著上升,并且呈复温依赖性升高,差异有显著统计学意义。
热打击后血浆D-乳酸浓度变化与血浆DAO活性变化有所不同,40℃热打击与对照组比较无明显升高,42℃热打击后显著升高,与对照组和40℃热打击组比较有显著统计学意义(F=49.745,P=0.000)。2.5肠屏障功能障碍与全身炎症反应的相关性分析对代表肠粘膜屏障功能损害的指标二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)活性和D-乳酸浓度与反映全身炎症反应的指标(血浆INF-a、IL-6和LPS)的相互关系进行线性回归及直线相关分析,结果显示:小鼠血浆炎症反应的指标(血浆INF-a、IL-6和LPS)与血浆DAO活性(P值均小于0.001,相关系数分别为r=0.8075、0.8358、0.8341)和D-乳酸浓度(P值均小于0.001,相关系数分别为r=0.8111、0.8001、0.8107)呈显著正相关,说明肠屏障功能损害在中暑全身炎症反应中的发生中起着非常重要的作用。
3、采用前述技术方法,观察UTI预处理对重症中暑早期肠粘膜屏障的保护作用并对重症小鼠行生存分析。结果发现,与HS组(单纯热打击组)相比,UTI预处理组小鼠肠粘膜组织形态学、肠粘膜组织超微结果及肠屏障功能有明显改善;细菌移位率、血浆LPS浓度及炎症因子IL-6、TNF-a明显降低,重症中暑小鼠全身炎症反应明显减轻;肠道TJ蛋白Occludin和ZO-1表达增加;肠上皮细胞凋亡指数明显下降;同时生存分析显示UTI预处理也显著改善重症中暑小鼠的生存时间和生存率。
与对照组比较,40℃组小鼠血浆TNF-a和IL-6水平也有明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)。1.3小鼠生存时间分析本研究中常温对照组和40℃热打击组小鼠全部存活超过72h,而42℃组小鼠复温后72h内全部死亡,死亡率100%,其中大部分在24h内死亡,其中位生存时间为18h。
2.采用组织病理形态学分析、电镜超微结构观察、细菌学分析、酶联免疫吸附(ELISA)、TUNEL及免疫组化等技术方法,探讨肠粘膜屏障功能障碍与全身炎症反应及肠上皮细胞凋亡的相关性。2.1 HE染色观察肠粘膜损伤40℃热打击组小鼠回肠粘膜厚度均匀,肠上皮较为完整,绒毛排列尚规则,固有层略疏松,有少量淋巴细胞浸润,有炎性细胞浸润。
2.9肠粘膜上皮细胞凋亡指数(Apoptotic index AI)与小肠屏障功能损害和全身炎症反应的相关性分析将不同程度热打击后小鼠肠上皮细胞AI分别与血浆DAO活性、D-乳酸浓度以及血浆INF-a、IL-6水平进行线性回归及直线相关分析,结果显示:1、AI与血浆DAO活性(r=0.8687,p=0.000)和D-乳酸浓度(r=0.8388,p=0.000),呈高度正相关。2、AI与血浆INF-a(r=0.9001,p=0.000)和IL-6(r=0.9193,p=0.000)水平呈显著正相关。
鉴于以上现状,本研究通过建立热打击中暑小鼠动物模型,探讨高热对肠粘膜屏障功能的影响及其与全身炎症反应的相关性;进一步使用UTI预处理中暑动物,观察UTI对重症中暑动物模型肠粘膜屏障的影响。方法:采用6-8周龄SPF级雄性BALB/c小鼠(SYXK(YUE)2011-0015]建立中暑模型,随机分为对照组、40℃热打击组、42℃热打击组;观察药物治疗效应随机分为sham组、HS组(42℃热打击)、低剂量UTI组(5000U/kg)及高剂量UTI组(10000U/kg)。
Lambert等观察大鼠肠道(包括十二指肠、空肠、回肠和结肠)对高热打击的反应中,发现当大鼠核心体温达到42.5℃C后可见肠上皮细胞破坏,微绒毛丧失,紧密连接开放,线粒体肿胀、空泡化,并且对异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖的通透性增加。临床死亡的中暑病例主要症状常常包括胃肠道出血、内毒素血症,提示中暑肠屏障功能损害和全身炎症反应密切相关。
2.7肠道TJ蛋白与小肠屏障功能损害和全身炎症反应的相关性分析线性回归及直线相关分析显示:紧密连接蛋白Occludin和ZO-1与小鼠血浆炎症反应的指标(血浆TNF-a、IL-6)(P<0.001,相关系பைடு நூலகம்分别为r=0.8156、0.8858、0.8548、0.9290),呈显著正相关。这一结果提示中暑小鼠全身炎症反应和肠粘膜屏障损害有关。
42℃热打击组小鼠肠粘膜明显萎缩,黏膜层和固有层重度分离,绒毛基本完全脱落,固有层裸露、水肿,淋巴细胞及中性粒细胞浸润。与对照组比较,热打击组在小肠绒毛高度(F=84.833,P=0.000)、厚度(F=116.006,P=0.000)及表面积(F=63.27,P=0.000),差异有显著统计学意义。
对照组/sham组动物始终置于常温下(25±0.5℃),热打击组置于仿真气候舱内,舱内温度(35.5±0.5)℃,湿度(60±5)%,每30min用肛温表测小鼠直肠温度,当小鼠体温达到41.5℃时,每10min测小鼠直肠温度,40℃热打击组小鼠在体温达到40℃时停止热打击,42℃C热打击组小鼠体温达到42℃即停止热打击,各组动物按照不同复温时间点分为0、1、3、6、12、24h。药物治疗组在造模前腹腔注射UTI 5000U/kg或10000U/kg,24h/次,连续3d;sham组和HS组给予腹腔注射等量(容积)生理盐水,24h/次,连续3d。