疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

状体区分开， 虫种 鉴 别 较 难， 容易 出 现 误 诊， 并 只 按 单 一疟 原 虫感染进行治疗; 输入性的卵 形 疟 和 三 日疟 在 国 内较 少 见， 准 确 鉴 别 有 难 度 。因 此 ， 准 确 的 诊断 和鉴定 疟 原 虫 种 对 疟疾 防 治具有重要的实用意义。 最近国内外开始将实时荧光 PCR 技术应用于 疟疾 的 快速 ， 它 能 在 短 时 间 内 判 断 疑似 病 例 或 可 疑 媒 介 是否感染疟疾或携带疟原虫， 及 时 采 取 必 要 的 防 控 措 施， 防止 检测 和 分型
［1 ］ 镜检难以查到原虫， 容易出现 漏 诊 ; 当 发 生 疟 原 虫 混 合感 染 时， 镜检不易将恶 性 疟 的 环 状 体 或 早 期 滋 养 体 与 间 日疟 的 环
该传染病疫情在国境口岸的 传 入 和 传 出， 为 早 期 筛查、 快速 诊 断、 有效监测和 控 制 疾 病的 发 生 和 传 播 提 供 支 持 和 依据。 本 文根据疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸( SSU rRNA) 基因序列 ［6 ］ 的高度保守性 ， 建立了疟疾的通用型实时荧光 PCR 方法， 对 60 例血样进行了检测， 并比较 了 该 方法 同 镜检 和 巢 式 PCR 间 的敏感性和阳性检出率。 1 1． 1 材料与方法
中国卫生检验杂志 2011 年 3 月 第 21 卷 第 3 期
Chinese Journal of Health Laboratory Technology，Mar 2011 ; Vol 21
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【微生物检测方法】
疟疾 的实 时荧 光 PCR 快速 检 测方法
师永霞， 苏锦坤， 洪烨， 李小波， 郑夔， 黄吉城， 幸检疫技术中心， 广州 510700 ) ［ 摘要］ 目的: 建立疟疾的实时荧光 PCR 检测方法并 用 于 疟疾 的 快速 检测。 方法: 设 计 了 疟 原 虫 通 用 型 实 时 荧光 PCR 检测的引物和探针， 建立了疟疾的实时荧光 PCR 检测方法。对 40 份 疟疾 镜检 阳 性 样 本 和 20 份 镜检 阴 性 样 本 进 行 实 时 20 分 钟 即 可 完 成。40 荧光 PCR 检测， 并和巢式 PCR 方法检测结果进行了比较。 结 果: 疟疾 实 时 荧光 PCR 检测 速 度 快， PCR 2 PCR ; 20 份镜检阳性样本的荧光 检测均为阳性， 份样本的 巢 式 结果为阴性 份 镜检 阴 性 样 本 中 有 3 份 样 本 为 实 时 荧光 PCR 阳性， 其余 17 份样本为实时荧光 PCR 阴性， 与疟疾巢式 PCR 检测结果相同。结论: 该 实 时 荧光 PCR 方法检测 速度 快 ， 特异性强， 准确性高， 阳性率高， 不易漏检， 适用于疟疾的快速检验， 这对防止 该 病在 国 境 口 岸 的 传 入 提 供了 技术 依据。 ［ 关键词］ 疟疾; 小亚单位核糖体核糖核酸; 实时荧光 PCR; 巢式 PCR ［ ［ ［ 中图分类号］ R531． 3 文献标识码］ A 文章编号］ 1004 － 8685 ( 2011 ) 03 － 0625 － 03
2% EDTA － Na2 抗疑，－ 验室保存。样本采集均为 静 脉 取 血， 20℃ 低温保存。 1． 2 试剂 全 血 DNA 提 取 试 剂 盒 ( QIAamp DNA Blood Extraction
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Chinese Journal of Health Laboratory Technology，Mar 2011 ; Vol 21
扩增长度 1815 bp
扩增长度 240 bp
1． 5
荧光 PCR 检测 使用 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 进行体系配
10 μmol / L 正 向 置， 反应总体积 20 μl， 包括 Master Mix 10 μl、 Plas － FP 1 l 、 10 mol / L Plas － RP 1 μl、 引物 μ μ 反向引物 5 μmol / L探针 Plas － Pro 1 μl、 DNA 7 μl， 同 时 分 别 以 DEPC H2O 和 DNA 阳性模板 作 为 阴 性 和 阳 性 对 照。 扩增 和 检测在 ABI 7900HT Fast 荧 光 定 量 PCR 仪 器 上 进 行， 反 应 程 序 为: 95℃ 20 s; 95℃1 s， 58℃20 s， 40 个循环， 在 58℃ 收集荧光。 1． 6 巢式 PCR 巢式 PCR 两次扩增的体系和条件略有不同。 第 一 次 扩增 PCR buffer 2． 5 μl， 10 mmol / L dNTP 0． 5 μl，10 mmol / L 时， rPLUout － FP 和 rPLUout － RP 引 物 各 0． 5 μl， Taq 酶 0． 25 μl， DNA 模板 5 μl， 双蒸水 15． 75 μl， 总 体 系 25 μl， 混匀后进行 PCR 反 应。 PCR 反 应 程 序 为: 94℃ 2 min; 94℃ 1 min， 52℃ 1 min， 72℃ 2 min， 35 个 循 环; 72℃ 10 min; 4℃ 。 进 行 第 二 次 扩增时， 取 2 μl 的第一次 PCR 产物作为模板， 上下游引物换为 rPLUin － FP 和 rPLUin － RP， 双蒸水增加至 18． 75 μl， 其余同 第 一次 PCR 扩增; PCR 反 应 程序 也 略 有 不 同: 94℃ 2 min; 94℃ 1 min， 58℃ 1 min， 72℃ 1 min， 35 个循环; 72℃ 10 min; 4℃ 1． 7 扩增产物电泳分析 GelGreen 染 取 5 μl 扩增 产 物 经 1． 5% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳， 色， 凝胶成像系统观察结果并拍照。 2 2． 1 结果 疟疾的实时荧光 PCR 将 60 份样本进行疟疾通用型实时荧光 PCR 检测， 检测 时
［基金项目］ 广东检验检疫局科技计划项目( 2007GDK32 ) ［ 作者简介］ 师永霞( 1976 － ) ， 女， 副主任 医 师， 主要从 事 微 生 物 检验方面研究。
［2 ～ 5 ］
样本来源 30 份疟疾镜检阳性血样由广州万孚生 物 技术 有 限公司 提 10 份疟疾镜检阳性血样和 20 份疟疾 镜检 阴 性 血 样 为 本 实 供，
表1 疟疾荧光 PCR 检测的引物和探针以及巢式 PCR 检测的引物
备注 扩增长度 73 bp
有 3 份样 本 为 测均为阳性( 图 1 ) ; 在 20 份镜检阴性的样本中， PCR 2 ) ， 17 实时荧光 阳性( 图 其余 份样本为实时荧光 PCR 阴 性。
引物和探针名称 序列( 5' － 3' ) Plas － FP Plas － RP Plas － Pro rPLUout － FP rPLUout － RP rPLUin － FP rPLUin － RP AGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGA TCATCCAAMRCCTAGTCGGCATAGTTTAT FAM － ACCGTCGTAATCTT － MGB TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA CCTGTTGTTGCCTTAAACTTCC AAGGATAACTACGGAAAAGCTGT TACCCGTCATAGCCATGTTAGGCCAATACC
Real － time fluorescent PCR method for rapid detection of malaria
SHI Yong － xia，SU Jin － kun，HONG Ye，LI Xiao － bo，ZHENG Kui，HUANG Ji － cheng，XING Lu － qin，XIANG Da － peng， GUO Bo － xuan ( Health Quarantine Lab， Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center， Guangdong Entry － Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou 510700 ，China) ［ Abstract］ Objective: To establish real － time fluorescent PCR detection method for rapid detection of malaria． Methods: Universal primers and probes were designed． Forty positive samples and twenty negative samples tested by microscopic examination were detected Plasmodium by real － time fluorescent PCR． Their results were compared with that of nested PCR． Results: Real － time fluorescence PCR detection of malaria was fast and the reaction time only took 20 minutes． All of forty microscopy － positive samples were positive for fluorescent PCR detection， and two samples were negative by nested PCR． Three of twenty microscopy － negative samples were positive for real － time fluorescence PCR and the remaining seventeen samples were negative，which was the same as results of nested PCR detection． Conclusion: The real － time fluorescent PCR is suitable for rapid detection of malaria because of its fast speed， strong specificity， high accuracy and low missing rate． It provides a technical basis to prevent disease from spreading into our country in the border． ［ Key words］ Malaria; SSU rRNA; Real － time fluorescent PCR; Nested PCR 疟疾诊断的 主要 方法 以 镜检 为主， 它 需要 操 作 者 具 有 丰 富的经验。一般认为， 当原虫 密 度 较 低 ( ＜ 50 个 / μl 血 ) 时， 靠
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Minikit) 购自 Qiagen 公司， 荧光 PCR 试 剂 ( TaqMan Fast UniTaq 酶 购 自 versal PCR Master Mix ( 2 × ) ) 购 自 ABI 公 司， Roche 公司， 100bp DNA Ladder Marker、 DL2000 DNA Marker 和 琼脂糖购自 TaKaRa 公司。 1． 3 疟原虫 DNA 提取 参照 QIAamp DNA Blood Extraction Minikit 说明书进行， 提 取的总 DNA 于 － 20℃ 低温保存。 1． 4 引物设计合成 比较恶性疟、 间 日疟、 三 日疟 和 卵 形 疟 的 SSU rRNA 基因 ， 序列 设计了疟疾通 用 型 实 时 荧光 PCR 检测的 引 物 和 探 针以 及利用巢式 PCR 检测 通 用 型 疟疾 所 需 的 引 物， 序 列 见 表 1。 引物和探针委托上海生工生物工程有限公司合成。