核酸检测在血液筛查中的应用PCR(新)

实时荧光优点 实时荧光优点
特异性好
引物、探针双重保证特异性 方法学假阳性很少
扩增检测同时进行，速度快，且不对扩 增产物进行处理，不易污染 荧光检测灵敏度高 罗氏第二代的NAT试剂也是使用实时荧 罗氏第二代的NAT试剂也是使用实时荧 光检测
内标设计原理
内标
样本
内标为一已知低含量 的与模板扩增效率相 似的一段DNA片段，将 似的一段DNA片段，将 它加入PCR反应液中， 它加入PCR反应液中， 与模板共同扩增，以 反应每管真实的扩增 情况，如果内标和样 品都未扩增出结果， 则表示该管扩增无效 ，应重新做。
特异性
核酸的特异性高，几乎没有方法学假阳性 但要防止污染
内标（内对照）
为避免假阴性，要求每管阳性质控
自动化
大规模、高通量
关于灵敏度的几个问题
厂家宣传的灵敏度均指单人份检测，而非推荐 pooling方案的实测灵敏度 pooling方案的实测灵敏度 实际应用灵敏度=宣传灵敏度×pooling数 实际应用灵敏度=宣传灵敏度×pooling数 IU才有可比性：WHO标准品以及国家一级标准品均以 IU才有可比性：WHO标准品以及国家一级标准品均以 IU为单位 IU为单位 HCV、HIV窗口期浓度高，因此对灵敏度要求较低。 HCV、HIV窗口期浓度高，因此对灵敏度要求较低。
血液筛查常用的NAT技术 血液筛查常用的NAT技术
核酸提取均使用磁珠法
磁珠提取的原理：wk.baidu.com
将磁珠上标记特异性吸附核酸的物质特异性吸附 核酸，并通过磁分离技术将病毒核酸从裂解液中 提取出来
步骤：
裂解—吸附—洗涤—洗涤—洗涤— 裂解—吸附—洗涤—洗涤—洗涤—洗脱
优点：
磁珠提取特异性高，受标本因素影响小，灵敏度 高 易于实现自动化
试剂的稳定性
试剂的灵敏度 试剂内标的最佳标准 试剂与全自动工作站的磨合
完善实验室管理
• • •
技术要求更高 操做要求更专业 质量控制更严格
降低ELISA检测的阳性率 降低ELISA检测的阳性率
完善采血前的筛查制度 提高血液初筛试剂的质量
完善的NAT阳性献血员的追踪制度 完善的NAT阳性献血员的追踪制度
内标的作用：避免假阴性 内标的作用：避免假阴性
内标的种类：
同源、异源
内标的作用： 内标的作用：
真实反应扩增效率 避免假阴性：假阴性是目前血液筛查中最 重视的问题之一，内标全程进行质量监控 质控
核酸检测中遇到的问题 与解决方案
人员素质和清洁很重要
血筛用NAT对低浓度要求太高，高灵敏 血筛用NAT对低浓度要求太高，高灵敏 度的试剂操作对人员要求高，同样的 平台不同的实验员有很大的差距。
内标与结果的判定
内对照（IC）使质控成为每管质控 内对照（IC）使质控成为每管质控
使用双免荧光，保证内对照和样本反应条件绝对 一致 竞争性设计，保证受影响因素一致 结果判断原则：
样本检测阳性，无诊IC情况均报阳性 样本检测阳性，无诊IC情况均报阳性 样本检测阴性：
内对照阳性，可以报阴性结果 内对照阴性，需要复检
标本处理
标本留样和处理：也是核酸检测质量控制体 系中的重要环节，否则在检测之前病毒核酸已 降解，造成假阴性检测结果。 临床基因扩增检验实验室工作规范》 《临床基因扩增检验实验室工作规范》临床用 RNA(如 RNA)扩增检测的血标本建议进行 于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本建议进行 抗凝处理，并尽快(3小时以内)分离血浆， (3小时以内 抗凝处理，并尽快(3小时以内)分离血浆，以 避免RNA的降解。如未作抗凝处理， RNA的降解 避免RNA的降解。如未作抗凝处理，则抽血后 必须在1小时内分离血清。 必须在1小时内分离血清。 《全国艾滋病检测技术规范》用于核酸定性检 全国艾滋病检测技术规范》 测时，采集的抗凝全血应在4 8h内分离PBMC和 测时，采集的抗凝全血应在4∼8h内分离PBMC和 血浆，否则应在24∼48h内分离血浆和血细胞。 血浆，否则应在24∼48h内分离血浆和血细胞。
核酸检测在血液筛查中的应用
无偿献血的新动态
“ 定期无偿献血者是低危的献血者” 定期无偿献血者是低危的献血者 ” ， 但是“ 以体检为目的定期无偿献血 但是 “ 者是高危献血者” 者是高危献血者 ” 而且这部分人群的 献血队伍正在扩大。 献血队伍正在扩大 。 这部分人群窗口 期的机率高于其他人群。 期的机率高于其他人群 。 因为在他们 中间高危的传播行为经常发生。 中间高危的传播行为经常发生。 经过治疗后的HBsAg 转阴， ELISA 方法 经过治疗后的 HBsAg转阴 ， ELISA方法 检测阴性的献血者。 检测阴性的献血者。
进入计算机管理系统
由于标本多，还要进行pooling。为便于管理， 由于标本多，还要进行pooling。为便于管理， 减少人为错误，最好使用全自动工作站，这样 POOLING号、标本号都统一自动记录，不易搞错 POOLING号、标本号都统一自动记录，不易搞错
提高工作效率
降低工作强度, 降低工作强度,缩短实验时间
阳性率也不同
临床更多的阳性；血筛更多是阴性
对自动化要求不同
临床更多用于病人,单人份检测, 临床更多用于病人,单人份检测,标本量少 血筛更多用于正常人，因此检测量不同，对自动化的要求也不同
血筛用NAT平台的要求 血筛用NAT平台的要求
灵敏度
HBV≤10IU/ml；HCV、HIV≤ HBV≤10IU/ml；HCV、HIV≤200IU/ml
由于有内标进行每管阳性质控，因此批阳性质控 主要目的是监控实验细微的系统误差。因此阳性 质控浓度选择要低 过低的质控会影响工作，因此不宜使用最低灵敏 度浓度 建议灵敏度的3 建议灵敏度的3-5倍较好
多阳性和阴性质控
不宜固定位置，最好随机分布 由于有内标，多阳性质控偶有个别出现问题，实 验结果也有保证
缺点：
成本较高、并需要一定的仪器(半自动、全自动) 成本较高、并需要一定的仪器(半自动、全自动) 。完全手工工作量太大
实时荧光定量 PCR技术原理 PCR技术原理
所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应 中每一个循环产物荧光信号 的实时检测从而实现对起始 模板定量及定性的分析。在 实时荧光定量 PCR 反应中, 反应中, 引入了一种荧光化学物质， 随着 PCR 反应的进行，PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信 号强度也等比例增加。每经 过一个循环，收集一个荧光 强度信号，这样我们就可以 通过荧光强度变化监测产物 量的变化，从而得到一条荧 光扩增曲线图 。
平台建立初期会有较大问题 对人员素质要求与自动化程度成反比
实验室及仪器清洁很重要
由于少有高浓度标本，因此大面积的污染 不易发生。但由于试剂灵敏度高，如不随 时注意清洁，污染有积累效应，会出现散 发性样本污染，引起假阳性
采血样管的处理
玻璃器皿在使用前应高压处理，因为 玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最 玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最 好是热灭菌，250℃烘烤4 好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可 使RNA酶永久性失活。异硫氰酸胍盐 RNA酶永久性失活。异硫氰酸胍盐 (Guanidine thiocyanate,GITC)可使 thiocyanate,GITC)可使 DNA酶和RNA酶立即失活。 DNA酶和RNA酶立即失活。
NAT与ELISA互补 NAT与ELISA互补
病毒变异 免疫静默期 实验操作失误 病毒感染的窗口期
病毒检测窗口期
项目 HBsAg 抗-HCV 抗-HIV ELISA窗口期 ELISA窗口期 项目 56 72 22 HBV HCV HIV NAT窗口期 NAT窗口期 25 59 11
血筛用NAT试剂与临床用的不同 血筛用NAT试剂与临床用的不同
自动化的进程 自动化的进程
手工提 取
半自动 提取
全自动 提取
工作站 式自动 提取
今后面临的问题
降低检测成本
实验室建设成本 人员成本 管理成本 设备成本( 设备成本(各厂家的设备是否兼容，兼 容性强的设备、试剂销路好) 容性强的设备、试剂销路好) 试剂成本 质量成本
合理地进行集中化检测
提高检测质量 降低检测成本 集中的区域要考虑标本运送时间。
通过软件自动判断，但建议要人工复核
核酸实验室管理软件
在实验室管理软件的基础上增加核酸 检测的管理模块，实现计算机管理, 检测的管理模块，实现计算机管理,检 验结果自动控制。
NAT与ELISA检测的配合 NAT与ELISA检测的配合
1 同步检测 2 先做常规检测，再做核酸检测
自动化要求
保证质量
核酸检测对技术要求高，特别是血筛用对灵敏度 要求更高，所以自动化保证质量的持续性
完善制度 持之以恒 不断总结
检测标本量及检测时间因素
扩增检测量=提取量×3(HBV、HIV、 扩增检测量=提取量×3(HBV、HIV、HCV) 与仪器密切相关
影响灵敏度因素
Pooling方案 Pooling方案 内标的浓度 标本的加样量 磁珠的量和混匀 模板制作过程的损失和提取量
批质控的选用及设定
使用低浓度样本为批阳性质控
标本汇集
利用STAR工作平台, 利用STAR工作平台,编制汇集软件。 合理的Pooling方案 合理的Pooling方案
Pooling方案 Pooling方案
灵敏度因素
检出血液中最低的病毒含量与标本汇集数 量呈正比
成本因素
试剂价格以test为单位，检测单位成本与 试剂价格以test为单位，检测单位成本与 pooling方案有关 pooling方案有关
目的和要求不同
定性与定量
临床使用核酸检测主要目的是定量监测，进行疗效分析。 血筛用于病原体的定性筛查
灵敏度和特异性
临床在漏检与误差之间更重视误差 血液筛查用核酸目的是保证用血安全，更重视漏检
质控要求不同
临床用与血液筛查用质控要求也不同。临床试剂以定量准确和防 止误报为质控目标 血筛用以防止漏检为主要目的
美国FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被 美国FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被 检出
HBV的窗口期标本在30-300IU/ml之间，因此对灵敏 HBV的窗口期标本在30-300IU/ml之间，因此对灵敏 度要求高 低于灵敏度也有检出的可能，这与取样几率有关