核酸检测在血液筛查中的应用PCR(新)
实时荧光定量PCR 核酸检测在献血者HIV 病毒筛查中的应用价值分析
２０２１年６月 第１１期影像学及诊断检验实时荧光定量ＰＣＲ核酸检测在献血者ＨＩＶ病毒筛查中的应用价值分析邵长年山东省济宁市中心血站，山东 济宁 272100【摘要】目的：研究在献血者人类免疫缺陷病毒(HIV)筛查中通过实时荧光定量PCR核酸检测的应用价值。
方法：抽取本站于2019年9月到2020年9月，此期间接受HIV病毒筛查的献血者共640例，对其血液样本均采用核酸测定(NAT)与酶联免疫吸附剂测定(ELISA)方式，其中核酸检测采用PCR-实时荧光定量法。
结果：NAT阳性样本19例，HIV病毒筛查阳性率为2.97%；ELISA阳性样本15例，HIV病毒筛查阳性率为2.34%；ELISA阳性、NAT阴性标本7例，约占1.09%；ELISA阴性、NAT阳性标本为11例，约占1.72%。
ELISA或NAT检测结果呈阳性的26例血液样本进行复检，共有23例确认为HIV感染。
与ELISA(+)NAT(-)相比，ELISA(-)NAT(+)、ELISA(+)NAT(+)的HIV病毒检出率更高；且与ELISA(-)NAT(+)相比，ELISA(+)NAT(+)的HIV病毒检出率更高。
结论：实时荧光定量PCR核酸检测对于提高HIV病毒筛查准确率，提高临床输血安全性等有十分重要的意义。
【关键词】献血者；筛查；应用价值；HIV病毒；实时荧光定量PCR核酸检测[中图分类号]R440 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249(2021)11-0153-02由于异体输血可能会造成艾滋病等传染病的传播，而艾滋病是一种由HIV病毒引发的感染性疾病，传染性与致死率较高[1]。
而对献血者血液样本进行筛查，是降低HIV感染的有效方式，可杜绝由于输血导致的疾病感染[2]。
有相关报告指出，将实时荧光定量PCR核酸测定应用于献血者HIV病毒筛查中，收效较为理想[3]。
可排除HIV 病毒阳性血液，降低输血传播病毒的风险，使血液使用更加安全。
核酸扩增技术在血液筛查中的应用研究
核酸扩增技术在血液筛查中的应用研究摘要：目的探究采用核酸扩增技术进行血液筛查的应用价值。
方法选取2013年6月—2014年4月在我献血站进行无偿献血者的血液标本32202例，且按筛选方法分为实验组和对照组。
实验组采用双试剂酶联免疫吸附试验（ELISA）对血液进行筛查，对照组采用核酸扩增技术（NAT）对血液进行筛查。
将两组标本的筛查结果进行统计学比较。
结果实验组32202例中检出HBV DNA阳性286例，其阳性检出率为1.77%，对照组32202例中检出HBV DNA阳性346例，其阳性检出率为2.15%。
结论 NAT对HBV DNA的阳性检出率明显高于ELISA，不仅避免了血液筛查中漏检情况的出现，很大程度上降低了输血传播疾病的风险，而且保证了临床上的输血安全，值得在临床上推广应用。
关键词：核酸扩增技术；血液筛查；窗口期；输血安全随着社会经济的快速发展，因输血引起的相关传染病的预防和控制已经引起了全社会的高度关注，而预防和控制输血相关传染病的源头就是要对献血者的血液标本进行严格的筛查。
双试剂酶联免疫吸附试验，临床上简称ELISA，是在免疫酶技术基础上发展而来的一种免疫测定技术，其过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上为包被，加待测抗体（抗原），再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）--待测抗体（抗原）--酶标记抗体（抗原）的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物，最终借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产物的生成量成正比[1]。
核酸扩增技术，临床上简称NAT，包括聚合酶链反应技术、荧光定量PCR技术和其他核酸扩增技术（核酸序列依赖性扩增、连接酶链反应和分枝DNA信号放大系统），其中最主要且最常用的是聚合酶链反应技术，其基本原理类似于DNA的体内复制，首先将待扩增的DNA模板加热至变性解链，随之将反应混合物冷却至一定的温度，且这一温度可将引物与它的靶序列发生退火，之后再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶的作用下延伸，这个过程就是PCR的一个循环，也就是说这种循环在适合的条件下是不断重复的[2]。
PCR技术在新冠病毒核酸检测中的应用分析
PCR技术在新冠病毒核酸检测中的应用分析【摘要】目的：新冠冠状病毒检测内使用PCR技术的效果。
方法：从2020年2月-2022年10月疑似新冠5例新型冠状病毒肺炎患者作为实验研究对象，通过对研究人员展开回顾性分析。
对患者使用PCR技术，分析检测效果。
结果：PCR技术系统用于新冠病毒检测内，其检出阳性率较高，特异性以及敏感度较好。
结论：将PCR技术用于新冠病毒临床检测内，可以根据其检查结果为医生提供部分数据依据，值得临床应用，但最终结果仍需结合其他数据以及患者症状确诊。
关键词：PCR技术；新冠病毒；核酸检测新型冠状病毒肺炎患者在患病的早期症状和感冒、上呼吸道感染十分相似，早期患者会出现发热以及呼吸道的表现，患者进行CT影像学检查并不存在显著的表现，很难和其他的肺炎疾病所区分[1]。
众所周知，当前检测新型冠状病毒肺炎患者地首选方法，是核酸鼻咽拭子检测[2]。
基于此，本文从2020年2月-2020年4月我院收入的5例新型冠状病毒肺炎患者作为实验研究对象，通过对研究人员展开回顾性分析，从而分析PCR技术系统在新型冠状病毒检测价值，如下。
1 资料与方法1.1一般资料从2020年2月-2022年10月疑似新冠5例新型冠状病毒肺炎患者作为实验研究对象，通过对研究人员展开回顾性分析。
实验研究人员的年龄范围主要集中在22-45周岁，平均年龄范围则大约为（36.84±2.69）周岁。
参与本次临床实验研究的患者中，男2例，女3例。
获取实验研究患者的痰液标本与咽拭子。
纳入标准：（1）知情同意，且积极参与。
（2）确诊为新冠肺炎患者。
排除标准：（1）无法正常沟通。
（2）存在呼吸道病变。
1.2方法采用全自动核酸提取仪，实验所用试剂盒均采用国家批准的试剂。
病毒采集过程中需使用拭子涂抹患者的动咽后壁，保证力度适中，避免接触舌根，迅速将采集后的拭子放入采集管内，靠近顶端部位折断拭子管，旋转盖子封闭保存。
随后严格按照说明书对患者进行核酸提取、标本稀释、核酸扩增等处理。
核酸检测技术在基层血站血液筛查中的应用
核酸检测技术在基层血站血液筛查中的应用吴洪明【摘要】目的:探讨核酸检测技术在基层血站血液筛查中的应用及存在的问题.方法:对2016年3月-2017年3月本血站采用ELISA进行检测后,对检测结果为阴性的无偿献血血液标本进行HIV、HBV、HCV核酸检测,分析检测结果,以了解核酸的检出率和阳性标本的感染性.结果:对21214例血液标本进行筛查,HBV-DNA阳性标本的共有70例,阴性标本共有21144例,阳性率为0.329％,本次血液标本中未发现HCV RNA、HIV-RNA.结论:核酸检测技术应用于基层血站的血液筛查,能够有效提高对血液传播性疾病的筛查水平,配合相关血清学检测,可显著提高临床用血的安全性.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2018(031)001【总页数】2页(P111-112)【关键词】核酸检测;基层血站;血液筛查;ELISA;血清学检测【作者】吴洪明【作者单位】福建省莆田市中心血站 351100【正文语种】中文【中图分类】R446.6临床常用的检测血液标本的筛查方法为血清学检测和核酸检测[1]，筛查血液疾病病原体对于提高用血安全、预防血液传播性疾病、提高血液制品的安全性方面有重要的意义。
我国通常采用ELISA(酶联免疫法)联合乙肝五项等血清学检测[2]，但诸如隐匿性感染、窗口期感染等因素的影响，可能产生部分假阳性或假阴性结果，造成了输血传播性疾病的风险有所增加，特别是间接检测的标志物，其检测窗口期的时间较长，例如免疫滴度、病毒变异等因素难以被消除，血液传染性疾病仍然不时有发生，而NAT(核酸检测技术)作为一种直接检测的标志物[3，4]，能够直接对病原体基因进行检查，且其敏感性高、特异性强，能够有效缩短窗口期的时间，对感染的情况进行明确，进而提高了血液制品的使用安全，本站对2016年3月—2017年3月开展的核酸检测技术情况进行汇报如下。
1 材料和方法1.1 材料来源选取本站2016年3月—2017年3月采集到的21 214例无偿献血者的标本，所有献血者的筛选均符合卫计委《献血者健康检查要求》的标准，献血者的年龄在18～55岁，排除HBsAg阳性、ALT>50U/L的血液标本，每位献血者均采集2管血液，其中1管血液量为5ml，用于NAT的监测，1管血液量为5ml，用于ELISA监测和保存，所有血液标本均保存于2～8℃的环境中，在采血后的4h内，在正常室温环境下，1 600g离心20min，待分离出血浆后，放入2～8℃的环境中，核酸标本在72h内完成检测工作。
核酸检测技术在国内外血液筛检中的应用
关于血液筛查核酸检测
关于血液筛查中HBV、HCV、HIV核酸检测
答：
（1）HBV、HCV、HIV是输血传播疾病的主要病原体，为防止因输血引起的HIV、HBV及HCV传播，目前国内外已广泛将核酸检测技术应用于血液筛查，核酸检测可以缩短病毒的“窗口期”。
（2）目前血液筛查核酸检测运用的方法主要是实时荧光定量PCR法和TMA法。
●实时荧光定量PCR法是在普通PCR基础上在反应体系中加入荧光基团，利
用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。
●TMA法是指利用RNA聚合酶和逆转录酶在约42℃等温条件下从靶核酸产生
大量RNA扩增子的靶核酸扩增方法。
（3）下面主要介绍实时荧光定量PCR法检测HBV、HCV、HIV病毒核酸
●HBV基因组是部分双链的环状DNA，HCV基因组为单股正链RNA，HIV
基因组是双股正链RNA。
因为HCV和HIV基因组为RNA，所以扩增前需要将基因组RNA逆转录成cDNA再进行PCR。
●一般情况下根据三种病毒基因组的保守区域设计引物和探针，HBV可以选
择S、C、P、X编码区基因进行设计，HCV主要选择5′UTR进行设计，HIV 可以选择gag、env、pol、tat基因中某些核苷酸序列进行设计。
●将DNA或cDNA模板、DNA聚合酶、引物和探针、PCR反应底物和缓冲液
等加入PCR反应管中进行PCR，经过几十个变性—退火—延伸循环后，通过扩增曲线的Ct值了解病毒核酸检测情况，Ct值越小表明病毒载量越高，反之，Ct值越大表明病毒载量越低或没有。
核酸检测技术在无偿献血者血液筛查中的应用分析
漏检 ， 而近 年来 发展 的 高度 敏感 、 异 的核 酸扩增 技术 （ Ａ 特 Ｎ Ｔ）
可使 ＨＢ ＨＣ Ｖ、 Ｖ和 ＨＩ 毒 的 “ 口期 ”明显缩短 ， Ｖ病 窗 大大提
高 了输 血和血 液 制 品的 安 全。现 将 笔者 所 在血 站 ２ １ ０ ０年 １ ２
月 ～ ０ 年 ７月 Ｅ ＩＡ检 测阴性献 ｍ者 的标本进行 Ｎ Ｔ检测 ２１ １ ＬＳ Ａ
剂 ： Ｖ、 Ｖ、 Ｖ （ Ｏ Ａ Ａｍ ｌ ｒｐ Ｃ Ａ Ｔ ｑ ｎ） ＨＩ ＨＣ ＨＢ Ｃ ＢＳ ｐｉ ｅ ／ ＯＢ Ｓ ａ Ｍａ ， ｐ
ｅｅ ｓｓ ０ ０电化 学发光分 析仪 配套试 剂。 以上 所使用 的试剂 ｌｃｙ １ ２ 均 为 国家生 物检定所批批 检定合格 ， 且存有效 期内使用 。
偿 献血者 血液筛查 ， 有助于提 高献血者 的血 液质量 ， 保证输血 安全 。
［ 关键词 】 酸检测 ； 核 无偿献 血者 ；粗液筛查 ； 口其 窗 ｝ 】
［ 中图分类号 】 ４ ６６ Ｒ４． ［ 文献 标识码 】 Ａ ［ 文章编 号 ］ ０ ５ ０ １ ２ １ ） ９ ｌ— ２ ２ ９ — ６ ６（ ０ ｌ 一 ６ ０ １
６ ％１， 一 Ｖ阳性牢也 达到了 ３２ ， ０ 抗 ＨＣ ．％１ 艾滋病也 有快速发展 的趋 势 。现 有 的血清学方 法避免 不 了对 病毒感染 “ 口期 ”的 窗
Ｅ ＩＡ筛查 试剂 ： Ｂ Ａ 上海科 华 、 ＬＳ Ｈ ｓ ｇ（ 厦门新创 ）Ｈ Ｖ （ ， Ｃ 上
海 科华 、 门新 创 ） Ｈ Ｖ（ 海 丽珠 、 京 万 泰 ｏＮ Ｔ试 剂 ： 厦 ， Ｉ 珠 北 Ａ 核 酸定 性 筛查 试 剂盒 （ ｏ ａ Ｔ ｑ ｃｅｎ Ｃ ｂｓ ａ Ｓ ｒｅ ＭＰ ｔｓ ｏ确 证试 Ｘ ｅｔ
核酸检测技术在血液检测中的应用
2020年5月第12卷第10期45核酸检测技术在血液检测中的应用李 岚【摘要】 目的 探讨核酸检测技术应用于血液检测的价值。
方法 抽取2019年1月至3月5000份献血者血液标本展开研究，先进行受ELISA 检测，对于两种试剂均无反应或是对1种试剂有反应的样本进行核酸检测。
分析检测结果。
结果 ELISA 检测结果显示5000份血液样本中有4992份样本经过HBsAg、抗-HIV-1/2均无反应或是只对1种试剂有反应；4992份样本接受核酸检测，52份样本的检测结果呈现为阳性结果，阳性检出率为1.12%（56/4992）。
阳性结果使用HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 进行分项定量确证，结果56份样本中有48份结果为HBV DNA 阳性，阳性率为85.71%（48/56），其余8例样本未检出HCV RNA、HIV RNA 的阳性。
结论 血液检测中应用核酸检测技术能够在很大程度上弥补ELISA 检测的不足，更早的发现HBV、HCV、HIV 病毒，对相应疾病的早期诊断和早期治疗有重要意义，也对输血安全有重要意义。
【关键词】血液检测；核酸检测；应用价值文献表明核酸检测技术能够提高多种病毒检出率，与ELISA 检测方法形成良好的互补，弥补血液检测的缺陷，。
但是也有研究指出，核酸检测方法会受到多种不同因素的影响，导致结果不准确[1]。
本文对我院血液检测中应用核酸检测技术的结果和价值展开回顾性分析，详情如下：1 资料与方法1.1 一般资料 血液样本收集于2019年1月至3月，来源于与我院门诊采血科室，抽取了5000份，其中包括2736份全血标本和2264份单采血小板样本，本次研究所使用的血液样本均符合《献血者健康检查标准》。
1.2 方法 所有患者均采集2管血液，1管使用抗凝真空管采集5ml 用于ELISA 方法检测，另一管使用带分离胶及EDTA 抗凝真空采血管采集8ml 用于核酸检测，所有样本均由专业护士采集，采集后放入4摄氏度冰箱中进行保存，在24h 内需要离心处理分离血浆并放入冰箱待检查。
PCR技术在医学检验中应用
通过扩增DNA片段，PCR技术能够在医学检验中发挥重要作用。本演示将介绍 PCR技术的原理以及其在疾病诊断、基因检测、药物研发和法医学中的广泛应 用。
PCR技术的原理
聚合酶链式反应（PCR）利用DNA复制过程的原理，通过DNA模板、引物和聚 合酶来扩增目标DNA片段。PCR不仅快速而敏感，还可以生成大量目标序列。
型预测个体对药物的反应和副作用。
3
药效评估
PCR可用于评估药物对疾病的治疗效果，指 导个体化治疗方案。
PCR技术在法医学中的应用
刑事犯罪鉴定
PCR可用于鉴定犯罪现场的体液、血迹和其他DNA样本，提供可靠的法医证据。
灾难人员身份确认
PCR可用于灾难现场遗骸的DNA鉴定，帮助确认身份并亲属回收遗体。
基因警示
PCR技术在疾病诊断中的应用
感染性疾病
PCR可以检测和鉴定病原体，如病毒、细菌和真菌，帮助医生做出更准确的诊断。
遗传疾病
PCR可用于检测基因突变和异常，帮助早期发现遗传病并提供遗传咨询。
肿瘤诊断
PCR可以检测肿瘤相关标记物，辅助肿瘤诊断、分期和治疗选择。
PCR技术在基因检测中的应用
基因测序
PCR可用于扩增待测DNA片段，然 后进行测序，帮助确定遗传信息和 基因组分析。
PCR可用于鉴定携带遗传病基因的个体，以预测潜在的遗传病风险。
PCR技术的优势和局限性
1 优势
PCR反应快速、敏感，可以扩增极少量的DNA， 可用于复杂或低浓度样本。
2 局限性
PCR可能会产生假阳性或假阴性结果，需要严格 的实验室操巨大作用，并且持续不断地发展和创新。未 来，PCR技术有望在更多领域实现应用，进一步提高诊断准确性和个体化治疗。
核酸检测在血液传染病筛查的应用价值探讨
核酸检测在血液传染病筛查的应用价值探讨摘要：目的：分析探究核酸检测在血液传染病筛查过程中的临床应用价值。
方法：选取我院于2019年3月至2021年11月因手术需要或者输血需要检测乙肝五项和抗HCV、HIV抗原抗体的400例患者血清样本作为研究对象，采取化学发光法来进行乙肝五项的检测，抗HCV、HIV抗原抗体，提取核酸定性检测HBV DNA、HCV DNA、HIV RNA。
对比分析两组检测方法的结果，不一致的标本检测病毒载量确认最终结果。
结果：HBV CNA、HCV RNA、HIV RNA检测下限为 5 IU/mL、50 IU/mL、50 IU/mL；检测出11例HBV化学发光与核酸定性结果不一致的标本，HCV、HIV化学发光与核酸定性结果未出现不一致的标本；2例HBsAg阳性HBV DNA筛查阳性标本，确认实验显示HBV DNA 定量小于检测限。
9例HBsAg阴性HBV DNA筛查阳性标本，1例定量为22.5IU/mL，6例可见扩增曲线定量小于检测限，2例无扩增曲线。
结论：HBV、HCV、HIV病原体核酸检测有利于检测出窗口期和免疫状态异常的感染者。
关键词：核酸检测；血液传染病筛查；应用过血液传播的一些传染性疾病还是比较多的。
临床上最常见的个就是传染性病毒性肝炎，包括乙型肝炎，丙型肝炎，人类免疫缺陷病毒等都是通过血液传播。
同时HRV感染也是通过血液传播，肾中心出血热也可以通过血液传播。
所以，通过血液传播的传染病的最有代表的是传染性的乙丙丁型肝炎，还有艾滋病。
其通过血液传播相对来于其他疾病，在临床上出现情况比较多[1]。
一、资料与方法1.1 一般资料选取我院于2019年3月至2021年11月因手术需要或者输血需要检测乙肝五项和抗HCV、HIV抗原抗体的400例患者血清样本作为研究对象，。
分离血清，留取1.5mL做核酸检测，其余样本进行化学发光检测抗原抗体。
1.2 方法1.2.1 核酸筛查检测下限验证阴性血清将WHO标准物质（HBV：NIBSC code10/266，HCV：NIBSC code 14/150，HIV：NIBSC code 16/194）稀释到试剂说明书注明的检出限浓度，即HBV CNA 5IU/mL、HCV RNA 50IU/mL、HIV RNA 50 IU/mL。
核酸检测技术在血液筛检中的应用研究
核酸检测技术在血液筛检中的应用研究高磊【摘要】目的探讨核酸检测技术(NAT)在血液筛检中的应用价值.方法选取无偿献血者血液样本5667例,均行EIA检测再行NAT检测,将两种检测结果进行对比.结果 5667份样本中,共有17份样本NAT与EIA检测结果不一致,其中12份EIA(+)NAT(-)样本经复检显示均为阴性,5份EIA(-)NAT(+)样本经复检结果仍为阳性.结论核酸检测能提高HBV检测灵敏度,提高输血安全性.【期刊名称】《现代诊断与治疗》【年(卷),期】2017(028)021【总页数】2页(P3935-3936)【关键词】核酸检测;血液筛检;输血【作者】高磊【作者单位】周口市中心血站检验科,河南周口 466000【正文语种】中文【中图分类】R446.61血站血液全面质量管理是安全输血的重要前提，目前主要通过严格挑选合适的献血人员、加强血液筛检及提倡合理输血三个步骤来确保输血质量［1］。
其中筛查血液可有效排除病毒阳性血液、避免携带病毒血液应用于临床。
而检测技术的进步是提高血液安全性的重要环节，可降低输血传播相关病毒的危险性［2］。
但目前临床上常用的ELLSA法主要用于筛查病毒抗原或抗体，会受到病毒滴度、病毒变异等因素的影响以致HBV、HCV和HIV漏检［3］。
NAT是近年来新兴的血液传染病检测技术，本研究将此项技术用于献血者的血液筛查中，对其应用价值进行探讨，报道如下。
1 资料和方法1.1 一般资料选取2015年11月～2016年11月于本中心进行无偿献血者的血液样本5667例，男3489例，女2178例；年龄 18～37 均（27.9±3.1）岁；体重45～77（63.4±3.9）kg；身高156～189（167±0.9）cm。
1.2 方法所有样本均取全血4ml与乙二胺四乙酸EDTA按4：1的比例混合，于2～8℃冰箱内保存，并于24h内分离血浆检测。
所有样本均先行酶免检测（EIA）再行NAT检测，其中EIA结果为阴性者以24份样本为基数混合行NAT检测；EIA结果为阳性者单独行NAT检测。
核酸检测技术在盐城地区献血者血液筛查中的应用
核酸检测技术在盐城地区献血者血液筛查中的应用刘专;姜斌;王晖;尹诗雨;耿雪芹【摘要】目的分析核酸检测技术在盐城地区献血者血液筛查中的应用效果及必要性.方法选取在2015年3～12月盐城地区采集的至少一种酶免试剂阴性的无偿献血者标本55 186例,采用Roche Cobas s201检测系统和中山大学达安基因股份有限公司的仪器及试剂开展HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA联合NAT检测,采用6/8人份混样池血液筛查核酸检测.对筛查阳性的部分标本送至江苏省血液中心进行确证.结果至少一种酶免试剂阴性的55 186份标本共检测了7 965个pool,其中罗氏系统检测3 930个pool,检出47个反应性pool,pool阳性反应率为1.20％.达安系统检测4 035个pool,检出39个反应性pool,pool阳性反应率为0.97％.拆分检测共筛查出42份核酸反应性标本,总反应性率为0.076％.其中罗氏核酸检测系统反应性率为0.12％,达安核酸检测系统反应性率为0.047％,两者差异有统计学意义,P＜0.05.36份送检标本中,有25份被确认为HBV DNA阳性,确认阳性率为69.44％.所有标本中无HCV RNA和HIV RNA的检出.结论在常规血清学检测的基础上进行核酸检测,能降低常规血清学检测漏检率,提高血液安全性.【期刊名称】《临床输血与检验》【年(卷),期】2019(021)002【总页数】5页(P155-159)【关键词】核酸检测;血液筛查;献血者【作者】刘专;姜斌;王晖;尹诗雨;耿雪芹【作者单位】224005 江苏省盐城市中心血站血液检测中心;224005 江苏省盐城市中心血站血液检测中心;224005 江苏省盐城市中心血站血液检测中心;224005 江苏省盐城市中心血站血液检测中心;224005 江苏省盐城市中心血站血液检测中心【正文语种】中文【中图分类】R392.11;R193.2血液及血液制品是输血性传染病的重要传播载体，对输血相关病毒的抗原或抗体进行检测，可大大降低输血传播疾病的发生率，但输血传播疾病仍有发生[1，2]，可见单纯抗原或抗体检测无法确保血液及血液制品100%安全。
PCR技术在新冠病毒核酸检测中运用
数字PCR技术具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点， 能够进一步提高新冠病毒核酸检测的准确性和可靠性，尤 其适用于少量样本的检测。
提高新冠病毒核酸检测的准确性和效率的方法
标准化操作流程
建立标准化的操作流程， 确保检测结果的可靠性和 可比性，提高检测准确性 和效率。
自动化检测设备
研发自动化检测设备，减 少人为操作误差，提高检 测效率，并降低检测成本 。
PCR技术在肝炎病毒检测中的应用
肝炎病毒包括甲型、乙型、丙型等多 种类型，PCR技术可以用于检测这些 病毒的核酸，有助于肝炎的诊断和分 类。
对于一些慢性肝炎患者，PCR技术可 以帮助监测病毒载量，评估病情和治 疗效果，指导治疗方案。
PCR技术在艾滋病病毒检测中的应用
艾滋病病毒是一种逆转录病毒，PCR 技术可以用于检测艾滋病病毒的核酸 ，以及CD4+T淋巴细胞计数，有助 于评估病情和制定治疗方案。
温度控制
PCR过程中，温度的控制至关重要， 需要精确控制变性、复性和延伸等温 度，以保证DNA的准确复制。
PCR技术的发展历程
1985年
Kary B. Mullis发明了 PCR技术。
1989年
PCR技术获得诺贝尔化 学奖。
1993年
实时荧光定量PCR技术 问世，提高了检测的灵
敏度和特异性。
2020年
在新冠病毒核酸检测中 ，PCR技术发挥了重要 作用，为疫情防控提供
了有力支持。
02 新冠病毒核酸检测中PCR技术的应用
新冠病毒核酸检测的重要性
01
02
03
确诊感染
通过新冠病毒核酸检测， 可以确诊患者是否感染了 新冠病毒。
防控疫情
及时发现感染者，有助于 控制疫情的传播，保护公 众健康。
核酸检测技术在血液筛查中的应用及分析
核酸检测技术在血液筛查中的应用及分析【摘要】由于通过血液可以传播乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病和梅毒等多种严重的传染病。
为了保障临床用血的安全，血液制品的质量，防止供受者血液及血液制品之间的交叉感染和采血及血液制品工作者的健康，必须防止上述疾病的感染者再次进入供血队伍，防止上述疾病病原体阳性血及成分血直接输注于病人或用于血液制品生产。
为此必须用当前质量最好、最可靠的诊断试剂筛查供血员及其血样。
血清学酶联免疫吸附法（ELISA）检测技术作为国家规定的血液筛查标准方法，但ELISA技术本身的固有缺陷却成为进一步提高临床用血安全的障碍，主要由病毒感染者存在较长的“窗口期”导致。
而采用核酸检测技术（NAT）能够提高血液筛查的效率。
本文就近年来国内外NAT在血液筛查中的应用情况进行总结分析。
【关键词】核酸检测技术；血液；筛查；应用引言：核酸检测和技术能够直击艾滋病病毒的RNA结构，检测血液中是否存在病毒核酸，诊断有无病原体感染。
采用PCR技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂和自行研究开发设计的复合引物，覆盖常见的HIV毒株，具有很高的灵敏度。
使用二次扩增的套式PCR扩增方法，提高检测的特异性，降低假阳性的概率。
核酸检测将艾滋病病毒的检测窗口期缩短至11天，并且核酸检测这项技术目前可将乙肝、丙肝病毒的检测“窗口期”分别由原来的50天、72天缩短到25天、59天。
下文针对核酸检测技术在血液筛查中的应用和检测原理进行分析，并进行探讨。
一、NAT用于血液筛查的意义及检测原理输血相关传染病的预防和控制是采供血机构的永恒主题。
根据我国现行法律法规要求，采供血机构对临床供血检测模式为：用两种不同厂家的ELI-SA检测试剂筛查HBsAg、抗-HCV、抗-HIV及梅毒螺旋体抗体（抗-TP）。
这种筛查模式有效降低了输血传染疾病的风险，特别是第三代酶免试剂的启用，而艾滋病检测已使用可同时检测P24抗原的第四代试剂盒。
但由于ELISA检测的是抗原或抗体，“窗口期”、病毒变异以及低水平携带者等漏检问题相对突出。
核酸检测与酶免检测在血液筛查中的联合应用价值
核酸检测与酶免检测在血液筛查中的联合应用价值【摘要】目的：研究核酸检测与酶免检测应用于血液筛选中的价值。
方法：2012年1月~2014年1月在我院献血的志愿者3506名，回顾性分析其临床资料。
结果：3506例标本使用酶免检测，检验出病毒（HBV、HIV、HCV）显阳性率总为10.58% （371/3506），显阴率总为89.41% （3135/3506）；酶免检测的标本中显阴性的有3135例，采用核酸检测对其进行复检，显阳率 2.99%，p<0.05。
结论：核酸检测技术在血液筛查中不仅可提升输血的安全性，且能降低风险。
【关键词】血液筛选；核酸检测；酶免检测【Abstract 】 objective：to study the nucleic acid test and elisa detection is applied to the value of blood screening. Methods：from January 2012 to January 2012 in our hospital blood donation volunteers，3506，the clinical data were retrospectively analyzed. Results：3506 casesof specimens by using enzymes to avoid detection，check out the virus （HBV，HIV and HCV）show positive rate was 10.58% （371/3506）always，show negative rate was 89.41%（3135/3506）；Elisa test specimen show negative with 3135 cases，using nucleic acid testing for the re-inspection，show positive rate was 2.99%，p < 0.05）. Conclusion：the nucleic acid detection technology in blood screening not only can improve the safety of blood transfusion，and can reduce risk.【Key words】 blood screening；Nucleic acid detection；Elisa detection随血站研究室质量的加强管理，酶免检测（ELISA）试剂的质量不断提升与改进，加强实验室人员培训等，均降低了输血所致的传播病风险[1]。
验血测试新冠肺炎的原理
验血测试新冠肺炎的原理
验血测试新冠肺炎的原理涉及两个方面：病毒检测和免疫应答检测。
首先，病毒检测主要通过检测血液中的新冠病毒RNA来判断是否感染了新冠病毒。
这种检测方法通常使用一种称为“实时定量聚合酶链反应”（RT-PCR）的技术。
它使用特定的引物和荧光染料，通过扩增血液样本中的新冠病毒RNA，并利用荧光信号来确定是否存在病毒。
这种方法可以提供高度敏感的结果，因此是当前新冠肺炎诊断的主要方法之一。
其次，免疫应答检测主要通过检测血液中特定抗体（免疫球蛋白M和免疫球蛋白G）的存在来确定是否感染了新冠病毒。
当人体感染新冠病毒后，免疫系统会产生这些抗体来对抗病毒。
这种检测方法通常使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）或荧光免疫分析法（FIA）等技术。
这些方法能够检测抗体与新冠病毒相关的特定蛋白结合的情况，从而确定体内是否存在这些抗体，进而判断是否感染了新冠病毒。
需要注意的是，这些检测方法都需要在专业实验室中进行，并由专业人员进行解读和分析。
此外，这些测试结果只能作为初步的判断依据，最终的确诊仍需要医生综合其他临床表现和检查结果来进行判断。
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进入计算机管理系统
由于标本多，还要进行pooling。为便于管理， 由于标本多，还要进行pooling。为便于管理， 减少人为错误，最好使用全自动工作站，这样 POOLING号、标本号都统一自动记录，不易搞错 POOLING号、标本号都统一自动记录，不易搞错
提高工作效率
降低工作强度, 降低工作强度,缩短实验时间
试剂的稳定性Leabharlann 试剂的灵敏度 试剂内标的最佳标准 试剂与全自动工作站的磨合
完善实验室管理
• • •
技术要求更高 操做要求更专业 质量控制更严格
降低ELISA检测的阳性率 降低ELISA检测的阳性率
完善采血前的筛查制度 提高血液初筛试剂的质量
完善的NAT阳性献血员的追踪制度 完善的NAT阳性献血员的追踪制度
由于有内标进行每管阳性质控，因此批阳性质控 主要目的是监控实验细微的系统误差。因此阳性 质控浓度选择要低 过低的质控会影响工作，因此不宜使用最低灵敏 度浓度 建议灵敏度的3 建议灵敏度的3-5倍较好
多阳性和阴性质控
不宜固定位置，最好随机分布 由于有内标，多阳性质控偶有个别出现问题，实 验结果也有保证
内标的作用：避免假阴性 内标的作用：避免假阴性
内标的种类：
同源、异源
内标的作用： 内标的作用：
真实反应扩增效率 避免假阴性：假阴性是目前血液筛查中最 重视的问题之一，内标全程进行质量监控 质控
核酸检测中遇到的问题 与解决方案
人员素质和清洁很重要
血筛用NAT对低浓度要求太高，高灵敏 血筛用NAT对低浓度要求太高，高灵敏 度的试剂操作对人员要求高，同样的 平台不同的实验员有很大的差距。
标本处理
标本留样和处理：也是核酸检测质量控制体 系中的重要环节，否则在检测之前病毒核酸已 降解，造成假阴性检测结果。 临床基因扩增检验实验室工作规范》 《临床基因扩增检验实验室工作规范》临床用 RNA(如 RNA)扩增检测的血标本建议进行 于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本建议进行 抗凝处理，并尽快(3小时以内)分离血浆， (3小时以内 抗凝处理，并尽快(3小时以内)分离血浆，以 避免RNA的降解。如未作抗凝处理， RNA的降解 避免RNA的降解。如未作抗凝处理，则抽血后 必须在1小时内分离血清。 必须在1小时内分离血清。 《全国艾滋病检测技术规范》用于核酸定性检 全国艾滋病检测技术规范》 测时，采集的抗凝全血应在4 8h内分离PBMC和 测时，采集的抗凝全血应在4∼8h内分离PBMC和 血浆，否则应在24∼48h内分离血浆和血细胞。 血浆，否则应在24∼48h内分离血浆和血细胞。
特异性
核酸的特异性高，几乎没有方法学假阳性 但要防止污染
内标（内对照）
为避免假阴性，要求每管阳性质控
自动化
大规模、高通量
关于灵敏度的几个问题
厂家宣传的灵敏度均指单人份检测，而非推荐 pooling方案的实测灵敏度 pooling方案的实测灵敏度 实际应用灵敏度=宣传灵敏度×pooling数 实际应用灵敏度=宣传灵敏度×pooling数 IU才有可比性：WHO标准品以及国家一级标准品均以 IU才有可比性：WHO标准品以及国家一级标准品均以 IU为单位 IU为单位 HCV、HIV窗口期浓度高，因此对灵敏度要求较低。 HCV、HIV窗口期浓度高，因此对灵敏度要求较低。
实时荧光优点 实时荧光优点
特异性好
引物、探针双重保证特异性 方法学假阳性很少
扩增检测同时进行，速度快，且不对扩 增产物进行处理，不易污染 荧光检测灵敏度高 罗氏第二代的NAT试剂也是使用实时荧 罗氏第二代的NAT试剂也是使用实时荧 光检测
内标设计原理
内标
样本
内标为一已知低含量 的与模板扩增效率相 似的一段DNA片段，将 似的一段DNA片段，将 它加入PCR反应液中， 它加入PCR反应液中， 与模板共同扩增，以 反应每管真实的扩增 情况，如果内标和样 品都未扩增出结果， 则表示该管扩增无效 ，应重新做。
缺点：
成本较高、并需要一定的仪器(半自动、全自动) 成本较高、并需要一定的仪器(半自动、全自动) 。完全手工工作量太大
实时荧光定量 PCR技术原理 PCR技术原理
所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应 中每一个循环产物荧光信号 的实时检测从而实现对起始 模板定量及定性的分析。在 实时荧光定量 PCR 反应中, 反应中, 引入了一种荧光化学物质， 随着 PCR 反应的进行，PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信 号强度也等比例增加。每经 过一个循环，收集一个荧光 强度信号，这样我们就可以 通过荧光强度变化监测产物 量的变化，从而得到一条荧 光扩增曲线图 。
美国FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被 美国FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被 检出
HBV的窗口期标本在30-300IU/ml之间，因此对灵敏 HBV的窗口期标本在30-300IU/ml之间，因此对灵敏 度要求高 低于灵敏度也有检出的可能，这与取样几率有关
目的和要求不同
定性与定量
临床使用核酸检测主要目的是定量监测，进行疗效分析。 血筛用于病原体的定性筛查
灵敏度和特异性
临床在漏检与误差之间更重视误差 血液筛查用核酸目的是保证用血安全，更重视漏检
质控要求不同
临床用与血液筛查用质控要求也不同。临床试剂以定量准确和防 止误报为质控目标 血筛用以防止漏检为主要目的
血液筛查常用的NAT技术 血液筛查常用的NAT技术
核酸提取均使用磁珠法
磁珠提取的原理：
将磁珠上标记特异性吸附核酸的物质特异性吸附 核酸，并通过磁分离技术将病毒核酸从裂解液中 提取出来
步骤：
裂解—吸附—洗涤—洗涤—洗涤— 裂解—吸附—洗涤—洗涤—洗涤—洗脱
优点：
磁珠提取特异性高，受标本因素影响小，灵敏度 高 易于实现自动化
平台建立初期会有较大问题 对人员素质要求与自动化程度成反比
实验室及仪器清洁很重要
由于少有高浓度标本，因此大面积的污染 不易发生。但由于试剂灵敏度高，如不随 时注意清洁，污染有积累效应，会出现散 发性样本污染，引起假阳性
采血样管的处理
玻璃器皿在使用前应高压处理，因为 玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最 玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最 好是热灭菌，250℃烘烤4 好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可 使RNA酶永久性失活。异硫氰酸胍盐 RNA酶永久性失活。异硫氰酸胍盐 (Guanidine thiocyanate,GITC)可使 thiocyanate,GITC)可使 DNA酶和RNA酶立即失活。 DNA酶和RNA酶立即失活。
阳性率也不同
临床更多的阳性；血筛更多是阴性
对自动化要求不同
临床更多用于病人,单人份检测, 临床更多用于病人,单人份检测,标本量少 血筛更多用于正常人，因此检测量不同，对自动化的要求也不同
血筛用NAT平台的要求 血筛用NAT平台的要求
灵敏度
HBV≤10IU/ml；HCV、HIV≤ HBV≤10IU/ml；HCV、HIV≤200IU/ml
标本汇集
利用STAR工作平台, 利用STAR工作平台,编制汇集软件。 合理的Pooling方案 合理的Pooling方案
Pooling方案 Pooling方案
灵敏度因素
检出血液中最低的病毒含量与标本汇集数 量呈正比
成本因素
试剂价格以test为单位，检测单位成本与 试剂价格以test为单位，检测单位成本与 pooling方案有关 pooling方案有关
核酸检测在血液筛查中的应用
无偿献血的新动态
“ 定期无偿献血者是低危的献血者” 定期无偿献血者是低危的献血者 ” ， 但是“ 以体检为目的定期无偿献血 但是 “ 者是高危献血者” 者是高危献血者 ” 而且这部分人群的 献血队伍正在扩大。 献血队伍正在扩大 。 这部分人群窗口 期的机率高于其他人群。 期的机率高于其他人群 。 因为在他们 中间高危的传播行为经常发生。 中间高危的传播行为经常发生。 经过治疗后的HBsAg 转阴， ELISA 方法 经过治疗后的 HBsAg转阴 ， ELISA方法 检测阴性的献血者。 检测阴性的献血者。
检测标本量及检测时间因素
扩增检测量=提取量×3(HBV、HIV、 扩增检测量=提取量×3(HBV、HIV、HCV) 与仪器密切相关
影响灵敏度因素
Pooling方案 Pooling方案 内标的浓度 标本的加样量 磁珠的量和混匀 模板制作过程的损失和提取量
批质控的选用及设定
使用低浓度样本为批阳性质控
完善制度 持之以恒 不断总结
内标与结果的判定
内对照（IC）使质控成为每管质控 内对照（IC）使质控成为每管质控
使用双免荧光，保证内对照和样本反应条件绝对 一致 竞争性设计，保证受影响因素一致 结果判断原则：
样本检测阳性，无诊IC情况均报阳性 样本检测阳性，无诊IC情况均报阳性 样本检测阴性：
内对照阳性，可以报阴性结果 内对照阴性，需要复检
NAT与ELISA互补 NAT与ELISA互补
病毒变异 免疫静默期 实验操作失误 病毒感染的窗口期
病毒检测窗口期
项目 HBsAg 抗-HCV 抗-HIV ELISA窗口期 ELISA窗口期 项目 56 72 22 HBV HCV HIV NAT窗口期 NAT窗口期 25 59 11
血筛用NAT试剂与临床用的不同 血筛用NAT试剂与临床用的不同
通过软件自动判断，但建议要人工复核
核酸实验室管理软件
在实验室管理软件的基础上增加核酸 检测的管理模块，实现计算机管理, 检测的管理模块，实现计算机管理,检 验结果自动控制。
NAT与ELISA检测的配合 NAT与ELISA检测的配合
1 同步检测 2 先做常规检测，再做核酸检测
自动化要求
保证质量
核酸检测对技术要求高，特别是血筛用对灵敏度 要求更高，所以自动化保证质量的持续性