细胞裂解

我以前做蛋白大量表达超声破碎时，总体积为200ml，功率300瓦，超3秒，停3秒，60次为一个循环，每个循环之间停5min，共作了3个循环，效果很好。

不知你的“原来的80倍”是多少，如果和我的差不多，是要延长总时间，但要注意样品要放在冰上，中间停一会，防止产生的热量太多，使蛋白变性。

我的方案是：

1 细胞先用无菌PBS洗二次；

2 吹下细胞后，4度12000rpm/min离心10min，再用无菌PBS悬浮，重复离心一次；

3 常规超声波处理。

注意事项：

1 全部处理过程一定要在冰上进行；

2 超声波时，一定不要有泡沫产生；

3 在冰上超声波处理。

由于上次求助无人回应，一气之下遍找资料，汇总出菌体/细胞裂解的常用方法和配方，希望能对其它求助兄弟有所帮助。

菌体/细胞裂解法汇总

一、反复冻融法：

1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

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2、至少3次以上冻溶。

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3、IFCC推荐法：

收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。

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4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻

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二、超声波处理法

1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。

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2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。

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3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40％功率。5

秒超声，9秒间隔。超声至少90min。

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4、综合冻融和超声的方法：

1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。

将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。可选择：4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。

Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol

三、渗透法：

冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。

《精编分子生物学实验指南》

四、裂解液处理法：

1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。

/bbs/actions/archive/post/1166442_0.html

2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。

/bbs/post/view?bid=65&id=4936753&sty=3&keywords=SDS+%C1%D1%BD%E2

3、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。

/bbs/actions/archive/post/2524891_0.html

4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。

/bbs/actions/archive/post/196557_1.html

5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声呢？直接水煮不就可以了吗？/bbs/actions/archive/post/2492252_0.html

6、将1ml菌离心弃上清，留大概50ul，再加50ul 2×上样缓冲液，煮10min，取20ul上样，就可以了。/bbs/post/view?bid=65&id=4591035&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#4591035

7、检测蛋白诱导：

从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl （pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油）中，100℃加热3min，然后12000g×1min离心。上样15ul，6％SDS-PAGE电泳。

《分子克隆》P826

8、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液（100℃加热）。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置（或-20℃放置），然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。

2×SDS上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2％（w/v）DTT，8％SDS，0.002％（w/v）溴酚蓝，40％甘油。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。

9、裂解液：50mMTris-HCl(pH8.5~9.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。/c?word=%B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2&url=http%3A//www%2E bioon%2Ecom/experiment/mb/mb1/200410/80878%2Ehtml&b=0&a=3&user=baidu

10、我们用NP40（NP40：NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇，是一种非离子表面活性剂。）加DTT和蛋白