石蜡切片免疫荧光实验步骤

石蜡切片免疫荧光实验步骤

1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放

入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。

2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至

1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。

3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体

流失。

4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗

同源血清封闭）。

5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的

一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。

6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每

次5min。切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。

7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每

次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。

8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每

次5min。切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。

9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并

采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；

CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。

10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳

性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。