石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫组化步骤.
石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。
肝组织过氧化物酶含量高。
需增加浓度或增长时间。
蒸馏水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。
（pv法不需要）9.滴加一抗4℃过夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室温或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。
石蜡切片免疫荧光染色方法完整版
石蜡切片免疫荧光染色方法HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。
3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。
修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。
2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
（也可不用去除内源性酶）。
3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
不用洗，用滤纸吸干周边水分。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。
立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。
PBS洗3次，每次5分钟。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
PBS洗涤3次。
每次5分钟。
如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins)7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。
免疫组织荧光染色法实验操作流程
4℃过夜
加Ⅰ抗
0.3%PBST浸洗
2*5min
在加Ⅰ抗的时候，要用吸水纸吸干周围的水，用pad笔画圈，防止Ⅰ抗流失，影响效果。
驴抗兔488
1h
加Ⅱ抗
1×PBS浸洗
3*5min
室温下1h，注意要避光。如果需要进行双标，在从封闭开始进行，
含DAPI的封片液封片
封片
因封片液中含有DAPI染细胞核（蓝色），所以不用做核的染色。
自然冷却
封闭
蒸馏水洗
2*3min
Ⅰ抗为兔抗鼠，Ⅱ抗就应该为**抗兔，所以我们封闭时选用被抗最少的物种，一般选用牛血清或者驴血清。再封闭时，为了防止封闭液流失，可以用pad笔在标本周围画圈，提高液体的利用度。
0.3%PBST浸洗
2*5min
5%驴血清封闭
室温1h
（PBS配）
加Ⅰ抗
0.3%PBST浸洗
2*5min
100%乙醇Ⅰ
5min
100%乙醇Ⅱ
5min
95%乙醇
2min
90%乙醇
2min
80%乙醇
2min
70%乙醇
2min
蒸馏水（浸洗）
3*2min
抗原
修复
高压锅柠檬酸盐缓冲液
3min
先将柠檬酸盐缓冲液加到洗盒里，加热高压锅，待柠檬酸盐缓冲液升温至60℃左右时放入水化后的标本，盖好高压锅，不加压力阀。加热高压锅，待压力阀处冒水蒸汽时，盖上压力阀，加热三分钟。压力降到正常大气压后打开锅盖，待玻片自然冷却。
含DAPI的封片液封片
冰冻切片（贴片）
操作步骤（贴片）
时间
备注
操作步骤（漂片）
时间
备注
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0。
01M PBST漂洗5min × 3/次；• 2％BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min•抗体染色：C孵育30min;︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体（1：8或1:16稀释），放在湿盒中，37• 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡（洗去多余游离的荧光素标记的抗体）。
•缓冲甘油封片–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9。
2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制.•镜检:在荧光显微镜下观察。
•优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项μ•对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；•一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；C的低温，延长染色时间。
︒C可加强染色效果,但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒)可采用0—2︒C),高于37︒–染色温度：多采用室温（25C 30 min效果好的多。
︒–低温染色过夜较37•试验时需设置下列对照：–自发荧光对照（空白对照）：标本加0。
01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验）:标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体.•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色.•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；•经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
免疫荧光单标染色技术石蜡切片脱蜡至水的步骤
免疫荧光单标染色技术是一种用于检测特定抗原或蛋白质的方法，能够在细胞或组织中定位这些分子。
这种技术常常用于生物医学研究、临床诊断和药物开发中。
在进行免疫荧光染色之前，需要进行石蜡切片脱蜡至水的步骤，以确保样品的质量和稳定性。
第一步：脱蜡1.1 在进行免疫荧光染色前，首先需要将样品中的蜡质去除。
通常使用挥发性有机溶剂（如二甲基苯）来溶解蜡质，以达到脱蜡的目的。
1.2 脱蜡过程需要严格控制时间和温度，以避免对样品中的细胞结构和蛋白质的影响。
1.3 脱蜡后，样品需要经过多次洗涤，以保证蜡质完全被去除。
第二步：水洗2.1 脱蜡后的样品需要经过一系列的水洗步骤，以移除残留的有机溶剂，并保证细胞或组织的完整性。
2.2 水洗过程需要使用高纯度的蒸馏水，并频繁更换，以避免污染和离子残留。
2.3 水洗后，样品需要进行去离子处理，以避免水中离子对免疫荧光染色的干扰。
免疫荧光单标染色技术通过上述步骤，可以在细胞或组织中准确地检测和定位特定抗原或蛋白质。
在这个过程中，严格控制的脱蜡和水洗步骤对于提高染色的敏感性和稳定性非常重要。
个人观点和理解：免疫荧光单标染色技术是一种非常重要的生物医学研究工具，它可以帮助科研人员和临床医生更好地理解细胞和组织中的蛋白质定位和表达水平。
而其中的石蜡切片脱蜡至水的步骤，是确保染色质量的关键一环。
只有通过严格的处理和洗涤，才能保证样品的稳定性和免疫荧光染色的准确性。
总结回顾：通过本文的阐述，我们深入探讨了免疫荧光单标染色技术中石蜡切片脱蜡至水的关键步骤。
这些步骤不仅仅是简单的预处理，更是整个染色过程中样品质量的保证。
在未来的研究和实践中，我们应该更加重视这些细节步骤的执行，以确保最终的实验结果的准确性和可靠性。
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石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。
然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。
固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。
2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。
首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。
接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。
最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。
3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。
使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。
切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。
4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。
不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。
修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。
5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。
将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。
然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。
接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。
6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。
使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。
注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。
2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。
3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。
4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。
5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。
石蜡切片免疫组化实验方法
石蜡切片免疫组化实验方法预处理：1.收集组织样品：选择实验需要的组织样品，如病变组织或动物组织，固定在4%的中性缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24小时。
2.脱水：将固定的组织样品进行脱水处理，使用升级的乙醇浓度，如70%乙醇、85%乙醇和95%乙醇各浸泡5-10分钟，然后在无水乙醇中浸泡2-3次，每次浸泡时间为10分钟。
3.渗透剂处理：将组织样品置于染料渗透剂（如苯酚甲醛、苯酚）中进行渗透处理。
渗透剂的选择根据实验需要的类型来确定。
4.包埋：将已经渗透处理的组织样品放入合适大小的模具中，加入石蜡进行包埋，通常使用两次石蜡浸渍15-20分钟，然后定位标本，放入包埋模具中。
切片：1.切片机调节：根据具体的切片机和刀片的不同，调节适当的角度和切片速度。
2. 切片：将包埋好的组织块放入切片机的切片盘中，以适当的角度切出厚度约为4-6um的石蜡切片，切片时需要保持刀片的清洁，避免刮伤组织。
3.切片回收：使用刀片回收装置将切下的切片轻轻回收至水中，再将切片转移到预处理盒中。
染色：1. 去蜡：将石蜡切片放入脱蜡溶液（如xylene）中进行脱蜡处理，每个浸泡站点持续3-5分钟。
2.脱水：将石蜡切片从脱蜡溶液中取出，放入浓度递减的乙醇溶液中，分别浸泡5分钟，如95%乙醇、70%乙醇和纯水。
3.抗原修复：为恢复组织切片的抗原表位，可以选择酶消化、高压加热或微波处理等方法来进行抗原修复，常用的抗原修复方法包括热处理和酶切法。
4.屏障消除：为了阻止非特异性结合，需要进行屏障消除，使用5%非脂干奶粉或血清进行预阻断，通常需要在37°C孵育1小时。
5.一抗处理：将相应的一抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在4°C下孵育过夜。
6.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。
7.二抗处理：将荧光标记的二抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在室温下孵育1小时。
8.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。
石蜡切片和免疫组化 步骤整理
一：步骤石蜡切片（骨组织）1：PFA固定，4℃冰箱过夜后，用10%的EDTA脱钙，时间3-5周，鉴定脱钙完成的标志是：用细针可以刺进骨头。
脱钙完成后开始做实验前需要把骨头放到70%的酒精24h。
2：脱水：70％酒精（1h）→ 80％酒精（30min）→ 95％酒精Ⅰ（20min）→无水乙醇Ⅰ（15min）→无水乙醇Ⅱ（15min）。
3：透明：二甲苯（15min）（如果组织小（例如小鼠和大鼠的组织）就15min，如果透明时间过长组织易脆，如果组织大（例如兔子、人、狗等)时间就可以稍微长一些。
4：浸蜡：恒温56℃～58℃（不超过60℃）。
→石蜡Ⅰ（1-2h）→石蜡Ⅱ（1-2h）。
（如果组织大浸蜡时间可以延长，可以达6-8h。
）5：包埋：待石蜡稍微凝固以后放到4℃冰箱过夜。
6：切片与展片：切片的时候要保持包埋好的蜡块的硬度，如果蜡块软的话切片的时候组织就会碎，所以要把蜡块放在冰上。
在42℃温水中展片（如果组织太脆，就先把组织浸泡在甘油中，几分钟？后在把组织放在冰块上，一段时间后再取出来重新切片。
）7：捞片：捞片时，载玻片45°倾斜，然后将片置于载玻片2/3处。
8：收片子，37℃保存。
HE染色1：脱蜡和脱水：二甲苯，10min×3（不常换，脱蜡用），酒精5min（100%Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；95%；70%），蒸馏水Ⅰ，Ⅱ5min（如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。
如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长）2：染色：苏木精-2-3min3：蒸馏水冲洗（起反蓝的作用）：大概1h-2h4：伊红染色-2min4:脱水 70%→80%→95%Ⅰ→100%ⅠⅡ、Ⅲ酒精各一分钟5：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3min（脱水用，最好是用一次换一次，脱水用的二甲苯要透明干净，质量才好）6：封片用树胶∶二甲苯=3:1（1∶1，3∶2）{现配现用}，树胶多一些，用铅笔或者其他工具赶气泡。
石蜡切片免疫组化实验方法
石蜡切片免疫组化实验方法
石蜡切片免疫组化实验是一种常用的病理组织学方法，用于确定特定的抗原在组织中的位置和表达水平。
以下是石蜡切片免疫组化实验的具体步骤：
1.组织处理。
将取得的组织标本固定在10%的中性缓冲福尔马林中，并进行脱水、浸透及包埋处理，以确保组织样本可以与石蜡相容。
2.石蜡切片制备。
将包埋好的组织样本切成4-5um厚的薄片，并贴附到玻片上，以备后续免疫组化处理。
3.抗原复性。
将石蜡切片置于解离液中，均匀受热数分钟，使样本中的链状分子断裂，恢复抗原的免疫活性。
4.抗体处理。
将待检测的抗体加入到样本中，充分混合并孵育一段时间，以实现抗原与抗体的免疫反应。
这里要注意，不同的抗体使用的孵育时间和检测温度也不同。
5.二次抗体处理。
在完成抗体处理后，将与一级抗体相结合的二级抗体（比如HRP等）加入样本中，进一步实现免疫反应并标记待测抗原。
6.染色处理。
将待检测的免疫活性抗原染色，可以用一些特定的染料，比如DAB染料等。
7.显微镜观察。
最后，将石蜡切片置于光学显微镜下，观察抗原的表达情况，并根据染色结果分析样本中目标抗原的表达、分布和数量。
石蜡切片免疫荧光技巧
石蜡切片免疫荧光技巧
石蜡切片免疫荧光技术是一种常用的免疫组织化学方法，用于检测或定位特定抗原在组织样本中的分布情况。
以下是石蜡切片免疫荧光技术的步骤：
1. 组织固定和包埋：将组织样本固定在含有4%的缓冲甲醛中，以保持其形态和结构。
之后，将组织样本包埋在去离子石蜡中，以增加其硬度和切片的稳定性。
2. 去除蜡并切片：用刀片将固定和包埋的组织样本切割成薄片，通常为4-10微米厚。
3. 抗原解蜡：将蜡切片浸泡在去蜡溶液中，以去除蜡，并将其进行再水化，以恢复组织的水合状态。
4. 抗原检测：用适当的抗体与特定的抗原结合。
首先，用一种可以结合到抗原的初级抗体处理组织切片。
然后，使用荧光标记的二级抗体结合到初级抗体上，从而使标记可见。
5. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察组织切片，并通过选择合适的滤光片来检测和分析特定抗原的荧光信号。
不同的荧光染料可用于标记不同的抗原，以实现多重标记和多抗体检测。
石蜡切片免疫荧光技术具有高度的灵敏性和特异性，可用于检测和研究生物标志物在各种疾病和组织中的分布和表达水平。
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。
2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。
此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。
3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体流失。
4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗同源血清封闭）。
5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。
6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。
7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。
8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。
9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。
10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤
一、样品处理
1、选择适当体积的样品石蜡切片，防止干燥，封好盖子到-80℃，直
到使用时将其取出变性到室温，以备后续操作。
2、室温下取出石蜡切片，施加蛋白酶将切片上原有的细胞、细胞膜
分解，具体操作步骤为：将取出的石蜡切片放入0.1%胰蛋白酶(Protease，Roche)或0.5% Triton X-100溶液中，置于37℃水浴摇床，25min后将石
蜡切片放入3mm×2mm的转移槽内，加入200ul去离子水，搅拌进行超声
处理，30s后用1000ul去离子水冲洗，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。
二、组织切片染色
1、在刻线玻片上放入石蜡切片，用吸水棉柱将石蜡切片固定。
2、用0.1%胰蛋白酶(Protease, Roche)或0.3% Triton X-100溶液
浸泡石蜡切片，置于37℃水浴摇床，15min后去除液体，另用500μl去
离子水洗涤，将含有抗体的抗体溶液稀释至0.3μg/ml，加入石蜡切片上，放入35℃恒温箱，反应1h。
3、取出石蜡切片，加入1000μl去离子水洗涤，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。
三、免疫荧光检测
1、把石蜡切片放入适量的去离子水中浸泡，去除多余的抗体。
2、将放入去离子水中浸泡的石蜡切片放入多孔玻片，在摇床上稀释FITC标记的抗体，加入石蜡切片上，置于37℃水浴摇床上，1h后去除液体。
石蜡切片免疫荧光组化
免疫荧光组化（IHC）1.脱蜡Ⅰ二甲苯：3 minⅡ二甲苯：3 min1:1二甲苯：无水乙醇：3 min2.复水Ⅰ无水乙醇：3 minⅡ无水乙醇：3 min95%乙醇：3 min70%乙醇：3 min50%乙醇：3 min30%乙醇：3 min3.流动的自来水冲洗：5 min（在水龙头上接一个软管，水流放慢，注意管口要放在载玻片反面）4.抗原修复：20 min用双蒸水配制新鲜的10 mM的二水柠檬酸三钠，调节PH=6，加入0.05%的吐温20，将配制好的柠檬酸盐溶液加到染色缸内，放入玻片（带架子），95℃水浴20 min。
5.室温冷却6.PBS冲洗（每次洗换新的）：3X5 min将染色缸中加满PBS，放在水平摇床上，50 rpm，轻摇。
7.透明：10 min配制0.2%的Triton X-100 PBS溶液。
先将载玻片上的PBS吸净，然后用专用笔围绕组织画一个封闭的圆圈，室温晾干后，紧挨内圈再画一个封闭的外圈，室温晾干。
用移液器向封闭圈内加一定量的0.2%的Triton X-100 PBS溶液，保证液体浸没组织。
8.PBS冲洗：3X5 min同步骤6。
9.封闭：30 min（RT）配制1%马血清PBS溶液。
先将载玻片上的PBS吸净，用移液器向封闭圈内加一定量的1%马血清PBS溶液，保证液体浸没组织。
10.孵一抗：在湿盒中4℃过夜。
按比例在封闭液中稀释抗体.先将载玻片上的封闭液轻轻甩掉，将载玻片摆放在湿盒内，用移液器向封闭圈内加一定量的稀释后的抗体溶液，保证液体浸没组织。
11.PBS冲洗：3X5 min同步骤6。
12.孵二抗：30 min（RT，避光）按比例在封闭液中稀释抗体。
先将载玻片上的PBS吸净，用移液器向封闭圈内加一定量的稀释后的抗体溶液，保证液体浸没组织。
13.PBS冲洗：3X5 min同步骤6。
14.梯度脱水30%乙醇：3 min50%乙醇：3 min70%乙醇：3 min95%乙醇：3 minⅡ无水乙醇：3 minⅠ无水乙醇：3 min15.1:1二甲苯：无水乙醇：3 minⅠ二甲苯：3 minⅡ二甲苯：3 min（14-15可选）16.封片将载玻片放在白色纸盒中，在载玻片上滴加适量mounting buffer，盖盖玻片，室温水平放置，过夜后观察。
石蜡切片免疫组化实验步骤
石蜡切片免疫组化实验步骤石蜡切片免疫组化实验是一种常用的实验方法，用于研究细胞或组织中特定蛋白质的表达情况。
下面将详细介绍该实验的步骤。
一、标本固定1.1 选取需要研究的组织标本，如肿瘤组织或正常组织。
1.2 将组织标本进行固定，常用的固定剂有4%的中性缓冲福尔马林溶液。
固定时间一般为24小时。
二、脱水和浸渍2.1 将固定的标本进行脱水，使用不同浓度的酒精进行逐渐脱水，通常是从低浓度到高浓度的酒精。
2.2 脱水后，将标本进行浸渍，使用石蜡和酯类溶剂混合制备浸渍剂，将标本浸渍在浸渍剂中，使其逐渐渗透。
三、石蜡包埋3.1 将浸渍的标本放入石蜡溶液中，使其充分浸泡。
3.2 使用石蜡包埋机将标本置于石蜡中，使其被石蜡完全包裹。
3.3 将石蜡包埋的标本放置于冷冻台上，使石蜡迅速凝固。
四、切片4.1 使用切片机将石蜡包埋的标本切成薄片，通常厚度为4-6微米。
4.2 将切好的标本片放入温水中，使其展开。
4.3 使用载玻片将标本片捞起，放置于载玻片上。
五、脱脂5.1 将载玻片上的标本片放入脱脂剂中，去除石蜡。
5.2 脱脂时间根据实验需求而定，一般为10-20分钟。
六、抗原修复6.1 标本片上的抗原可能在脱脂过程中被破坏，需要进行抗原修复，以使其恢复原有的形态和免疫反应性。
6.2 常用的抗原修复方法有热处理法和酶解法。
热处理法是将标本片放入缓冲溶液中，进行高温加热处理；酶解法是使用特定的酶对标本进行酶解处理。
七、抗体反应7.1 将修复后的标本片进行抗体反应。
首先将载玻片上的标本片加入抗体溶液中，使其与目标蛋白质结合。
7.2 抗体反应时间一般为1-2小时，温度一般为室温或4摄氏度。
7.3 抗体反应后，使用洗涤缓冲液洗涤标本片，去除未结合的抗体。
八、检测与显色8.1 将洗涤后的标本片加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗溶液中，使其与一抗结合。
8.2 二抗结合后，使用显色底物，如DAB（3,3'-二氨基联苯）溶液，进行显色反应。
石蜡切片及免疫荧光
一、石蜡切片1. 固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。
凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。
同时能使组织硬化，有利于切片的进行。
2.脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。
3.透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。
材料块在透明剂浸渍过程称透明。
4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。
先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5.包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。
6.切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。
通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。
7.贴片与烤片：一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。
8.切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。
9.染色：经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。
实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
二、冰冻切片1.取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
2.速冻：1）将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。
2）如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
3）当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 min；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M PBS终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min；11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
如何用石蜡切片做出高质量组化和荧光图之经验
[原创] 如何用石蜡切片做出高质量免疫组化和免疫荧光图之经验组织病理染色是我们做研究经常需要用到的实验技术，是基本的实验室技术之一。
很多人都认为病理染色相对Western blot（之前我也专门写了一篇经验贴）来说更容易出结果，这一点我不否认，但要想做出一张漂亮的图还是有点难度的，尤其是免疫荧光。
本人在这方面算得上是有点经验，做出来的图片受到导师和同学们的一致认可。
今天我就跟大家分享一下我艰辛摸索出来的经验。
我将从取材部分开始讲，到显微镜拍片结束。
由于我是基本只做中枢神经系统的研究，所以下面以鼠脑为例。
一、取材1、物品试剂准备：生理盐水或PBS（每只小鼠80ml），4%多聚甲或者10%中性福尔马林（每只小鼠100ml），麻药，250ml玻璃烧杯两个，泡沫箱两个，泡沫箱盖子一个，1ml注射器一个，20ml注射器两个，7号头皮针一个，大头针四个，止血弯钳（12.5cm）两把，组织剪一把（25cm），眼科剪一把，眼科弯镊一把，10mlEP管若干（一个鼠脑一管，提前装好固定液）。
2、取材步骤心脏灌注首先是麻醉小鼠。
等待麻醉诱导时把两个烧杯分别装上生理盐水和多聚甲，然后将烧杯半埋在冰中预冷。
麻醉后用大头针将小鼠固定于泡沫箱盖子上（用组织剪戳个洞，用以引流灌注出来的废液至泡沫箱中），暴露小鼠胸腔和心脏（用止血钳固定，用组织剪剪皮和开胸），注意别剪破肝脏和肺脏了，暴露后持止血弯钳稍微用力夹住一点心尖部（不要锁死钳子,留出进针的缝隙），微微用力向上提，仔细看心尖两侧颜色深浅，较浅那边是左心室部分，然后用头皮针（剪断针尖斜面，以防戳穿心底，提前接上装满生理盐水的注射器并赶走导管中的气泡）从心尖沿着左心室的长轴进针，全神贯注体会手感，当刚好有突破感时再进一点点，这时锁死止血钳。
然后用眼科镊夹起右心耳，并以眼科剪剪破之，见暗红的血涌出，接着手推注射器活塞，大概半分钟推完20ml生理盐水，连推4管，这期间观察肝脏颜色、肺脏大小及口鼻有无渗液。
石蜡组织免疫双色荧光操作步骤
石蜡组织免疫双色荧光操作步骤以下是石蜡组织免疫双色荧光的一般操作步骤：1. 组织固定：将待检测的组织标本固定在石蜡切片上，常见的固定剂包括福尔马林和乙醛。
2. 切片制备：使用组织切片机将固定的组织切割成薄片，通常厚度为4-6微米。
切片后将其放置在载玻片上。
3. 反蜡处理：将玻片连同组织切片一起放入石蜡热解蜡剂中，以去除石蜡并使组织暴露。
4. 抗原修复：根据需要，对组织切片进行抗原修复，以增强抗原的可见性。
抗原修复方法包括热处理或酶解。
5. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合的抗体或血清对组织切片进行处理，以阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
6. 第一次抗体孵育：将特异性的第一次抗体加入到切片上，与目标抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
7. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤切片，以去除未结合的第一次抗体。
8. 第一次荧光标记：加入与第一次抗体结合的荧光标记物，以使目标抗原可视化。
9. 第二次抗体孵育：加入与第一次抗体特异性结合的第二次抗体，形成第一次抗体-第二次抗体复合物。
10. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤切片，以去除未结合的第二次抗体。
11. 第二次荧光标记：加入与第二次抗体结合的另一种荧光标记物，使第二次抗体可视化。
12. 核染色：如果需要，可以对细胞核进行染色，常见的核染色剂包括DAPI或荧光素。
13. 盖玻片：将一滴适当的封片剂加在载玻片上，然后用盖玻片覆盖标本。
14. 显微镜观察：使用荧光显微镜观察标本，并拍摄图像。
以上步骤是一般的操作流程，具体的步骤和试剂使用可能会根据实验的具体要求和试剂的特性而有所不同。
在进行实验之前，请确保严格按照实验室的安全操作规程和相关实验方案进行操作。
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石蜡切片免疫荧光实验步骤
1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放
入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。
2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至
1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。
此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。
3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体
流失。
4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗
同源血清封闭）。
5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的
一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。
6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每
次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。
7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每
次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。
8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每
次5min。
切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。
9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并
采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；
CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。
10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳
性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。