免疫荧光染色方法
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤切片免疫荧光染色是一种常用的生物学实验方法，用于研究组织或细胞样本中的特定蛋白质标记。
下面是一般的切片免疫荧光染色的具体步骤：步骤一：取样步骤二：切片将固定的组织样本或细胞样本进行切片处理。
可以使用切片刀或者切片机来获得薄片。
切片的厚度往往是几微米到几百微米。
切片完成后，可以将其放在载玻片上。
步骤三：预处理载玻片上的切片需要进行一些预处理步骤，以去除可能会影响后续染色的物质，如脂质或其他杂质。
预处理步骤可能会包括洗涤、脱水和透明化等。
步骤四：抗原修复细胞或组织样本中的抗原有时会受到固定过程的影响，使得抗原无法与抗体结合。
因此，需要进行抗原修复步骤来恢复抗原的免疫原性。
抗原修复可以通过热处理、酸碱处理或酶解等方式进行。
步骤五：阻断非特异结合物为了减少非特异抗体的结合，需要使用一种阻断剂来防止非特异结合。
典型的阻断剂包括牛血清蛋白、胎牛血清等。
阻断剂可以在洗涤缓冲液中加入。
步骤六：初级抗体染色在预处理和阻断步骤之后，将含有特定初级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。
初级抗体是特异性结合到目标蛋白质的抗体。
孵育时间和温度可以根据实验的需要来确定。
步骤七：洗涤之后，用缓冲液洗涤样本，将未结合的抗体和杂质去除。
洗涤是非常重要的步骤，可以通过多次洗涤来提高特异性和背景的对比度。
步骤八：二级抗体染色二级抗体通常是带有荧光标记的抗体。
与初级抗体相比，二级抗体对特定的初级抗体更具选择性，并且能够增强荧光染色的信号。
将含有二级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。
步骤九：洗涤与前面的步骤类似，需要用缓冲液洗涤样本，去除未结合的二级抗体和杂质。
步骤十：荧光显微镜观察片片染色完成后，放入荧光显微镜中观察。
通过荧光显微镜，可以看到标记的荧光信号并进行图像记录和分析。
需要注意的是，切片免疫荧光染色步骤根据具体实验目的的不同可能会有所不同。
此外，具体的步骤和实验条件可以根据实验室的需要进行优化和修改。
细胞免疫荧光染色
细胞免疫荧光染色1.盖玻片处理：用前1天用纱布擦净灭菌，放入6孔板。
2.接种细胞：较低密度为适宜，约2000－10000个/孔（根据细胞生长状态决定，常用5000个/孔），2ml（浓度为2500/ml）3.24h后细胞贴壁，根据需要同步16－18h，干预处理，细胞融合60－70％时染色最佳4.37度PBS洗涤，3ml/孔，贴边加（可将6孔板倾斜，加完样在放正以防冲掉细胞，0.5min。
室温PBS也可，但4度禁止，否则细胞易皱缩。
5.固定：4％多聚甲醛(1ml)，先常温稳定5min，然后4度，10min，（可放在饭盒内）。
6.吸掉多聚甲醛，迅速加PBS 5ml/孔，洗涤5min×3次，镜下观察，细胞形态如前。
7.透化：0.1％－4％triton×－100，1ml/孔，室温透化5min（triton是去污剂，目的是将脂质成分破坏，如细胞膜、核膜等，故不影响实验结果，可不用洗涤）8.5％BSA（滤过）室温封闭至少20min（可配制含5％BSA和0.2％triton的混合液，将两步合成一步）风干9.用5％BSA将一抗1：50或1：100（常用）稀释至EP管200ul/玻片10.将纱布垫在饭盒中，去离子水润湿纱布，准备封口膜。
11.吸去BSA，迅速滴加一抗，从玻片1中央滴加，液体会自行扩散至全片。
为保持细胞湿润，将6孔板封好，放入饭盒，37度孵育1－2h（有利于抗体结合），再室温3－4h。
（或室温2h后，4度过夜）注意勿晃动6孔板，防止抗体不均或从玻片洒出。
12.PBS洗涤10min*3次（可用western的摇床）13.用5％BSA将二抗1：50稀释（得到的实际浓度为1：100，因二抗本身已经被甘油稀释1倍），也可1：200稀释。
室温1.5h后可显荧光（放在饭盒里，避光）14.PBS洗涤10min*3次（可用western的摇床）15.免疫荧光显微镜观察。
泡在2ml的PBS中保存。
16.多聚甲醛: 4度避光保存100ML PBS加4克多聚甲醛，磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下，最好用细粉末的多聚甲醛，如仍不溶，滴加NaOH,(1N或0.1N），最后调PH值，7.4左右。
免疫荧光染色(多标)步骤
免疫荧光染色(多标)步骤一、免疫荧光染色的多标技术简介免疫荧光染色的多标技术是通过同时使用多个荧光染料，标记不同的抗体，从而实现对多个目标分子的检测。
该技术广泛应用于生物医学研究、免疫组化和细胞生物学等领域，可以提供更全面的信息和更准确的结果。
二、免疫荧光染色的多标步骤免疫荧光染色的多标步骤主要包括标本处理、抗原修复、非特异性结合阻断、一级抗体处理、荧光二抗处理和显微镜观察等。
1. 标本处理将待检样品制备成组织切片或细胞涂片，并固定在载玻片上。
可以使用多种组织固定剂，如乙醛、甲醛等。
固定后，需进行脱水、透明化处理，以便后续步骤的进行。
2. 抗原修复组织样本经过固定处理后，可能导致抗原的空间结构发生改变，影响后续的抗原-抗体结合。
因此，需要进行抗原修复处理，如热解、酶解等方法，以恢复抗原的免疫原性。
3. 非特异性结合阻断为减少假阳性结果的产生，需要对标本进行非特异性结合阻断。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、鱼胶蛋白等，与标本中的非特异性结合位点结合，阻断后续试剂的非特异性结合。
4. 一级抗体处理将标本与一级抗体一起孵育，使一级抗体与目标抗原结合。
一级抗体通常是由小鼠、兔子等动物制备的，可以识别与特定抗原结合的抗体。
一级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
5. 荧光二抗处理将与一级抗体不同动物来源的荧光标记的二级抗体与标本一起孵育。
荧光二抗能与一级抗体特异性结合，从而实现对目标抗原的荧光标记。
不同荧光染料的荧光二抗可以同时使用，以实现多标的目的。
6. 显微镜观察将处理好的标本放置在显微镜下观察，可使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备进行观察。
通过不同的荧光染料，可以同时检测多个目标分子的位置和表达水平。
三、免疫荧光染色的多标技术应用免疫荧光染色的多标技术广泛应用于生物医学研究中，如疾病诊断、蛋白质定位和分析、细胞信号通路研究等。
通过同时检测多个目标分子，可以提供更全面的信息，有助于深入了解生物过程的机制。
组织-免疫荧光染色
组织免疫荧光步骤：
1）取出切片，用 M PBS冲洗5min×3次；
2）滴加10%正常山羊血清37℃封闭45 min；
3）吸去多余液体，加入抗TSHR的一抗（1：100），放入湿盒中，37℃孵育1h后置于4℃冰箱中过夜（保持在湿盒中）；
4） M PBS冲洗5min×3次；
（至下一步开始要适度避光操作，防荧光淬灭！）
5）在黑暗条件下加入山羊抗兔IgG-FITC（1：200），37℃温育45 min；6）在黑暗条件下吸弃二抗 (注：不再冲洗)，加入DAPI染液（μg/ml），室温作用20 min；
7）在黑暗条件下 PBS冲洗5min×6次；
8）在黑暗条件下防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。
核实好下边的问题你就可以操作了：
1、准备 M PBS 500 ml，冲洗时动作既要轻柔防脱片，又要保证冲洗
彻底；
2、抗TSHR的一抗用1：100，用抗体稀释液稀释；
3、实验室有没有山羊抗兔IgG-FITC，使用浓度是1：200；
4、DAPI染液（μg/ml）实验室有吗
5、防荧光淬灭剂封片实验室有吗。
免疫荧光（IF）细胞化学染色方法
免疫荧光（IF）细胞化学染⾊⽅法免疫荧光（IF）细胞化学染⾊⽅法⼀、标本制作 可制作涂⽚、印⽚、细胞单层培养物、组织切⽚，经适当固定或不固定，作免疫荧光染⾊⽤。
⼆、荧光抗体染⾊⽅法 （⼀）直接法 1．染⾊切⽚经固定后，滴加经稀释⾄染⾊效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗⼈γ-球蛋⽩荧光抗体或兔抗⼈IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染⾊30min，切⽚置⼊能保持潮湿的染⾊盒内，防⽌⼲燥。
2．洗⽚ 倾去存留的荧光抗体，将切⽚浸⼊pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再⽤蒸馏⽔洗1min，除去盐结晶。
3．⽤50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）⽢油封固、镜检 4．对照染⾊ ①正常免荧光⾎清染⾊，如上法处理切⽚，结果应为阴性。
②染⾊抑制试验（⼀步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋⽩或⾎清（相同）等量混合，如上法处理切⽚。
结果应为阴性。
为证明此种染⾊抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可⽤盐⽔代替未标记抗⾎清，染⾊结果应为阳性。
此法结果较⼆步法稳定。
③类属抗原染⾊试验，前⾯已作叙述。
直接法⽐较简单，适合做细菌、螺旋体、原⾍、真菌及浓度较⾼的蛋⽩质抗原如肾、⽪肤的检查和研究。
此法每种荧光抗体只能检查⼀种相应的抗原，特异性⾼⽽敏感性较低。
（⼆）间接法 （1）切⽚固定后⽤⽑细滴管吸取经适当稀释的免疫⾎清滴加在其上，置于染⾊盒中保持⼀定的湿度，37℃作⽤30min。
然后⽤0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，⽤吸⽔吸去或吹⼲余留的液体。
（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗⼈γ-球蛋⽩荧光抗体等），同上步骤，染⾊30min，37℃，缓冲盐⽔洗两次10min，搅拌，缓冲⽢油封固，镜检。
对照染⾊：①抗体对照：⽤正常兔⾎清或⼈⾎清代替免疫⾎清，再⽤上法进⾏染⾊，结果应为阴性。
②抗原对照：即类属抗原染⾊，亦应为阴性。
③阳性对照。
间接法中上述⽅法称双层法（Double Layer Method）。
免疫荧光染色法观察线粒体
免疫荧光染色法是一种用于观察和定位细胞内特定蛋白质或分子的方法之一，包括线粒体。
以下是一般的步骤，用于使用免疫荧光染色法观察线粒体：
1. **细胞培养：** 首先，您需要培养您感兴趣的细胞系，这些细胞中包含线粒体。
这可以是细胞培养皿中的细胞、组织切片中的细胞等。
2. **固定细胞：** 在观察之前，您需要使用适当的固定剂来固定细胞。
常用的固定剂包括甲醛或乙醛。
3. **透明化和渗透化：** 固定后，您可能需要进行透明化和渗透化处理，以增强抗体对细胞内结构的渗透性。
这可以通过使用Triton X-100 或Tween 20 等表面活性剂来实现。
4. **抗体染色：** 接下来，您将使用与您感兴趣的线粒体蛋白质特异性结合的抗体进行染色。
这些抗体通常会与荧光染料共轭，以便在观察中发出荧光信号。
5. **洗涤：** 洗涤细胞，以去除未结合的抗体和染料。
6. **荧光显微镜观察：** 使用荧光显微镜观察固定、染色和洗涤后的细胞。
线粒体应该在适当的波长下发出荧光信号，从而可以看到它们的位置和分布。
7. **成像和分析：** 使用荧光显微镜拍摄图像，并进行进一步的分析，以研究线粒体的数量、形态、分布和与其他细胞结构的关系。
需要注意的是，线粒体可以使用不同的抗体标记不同的线粒体蛋白质，以研究它们的不同特性。
此外，免疫荧光染色法也可以用于研究其他细胞内蛋白质和结构，是细胞生物学研究中常用的重要工具之一。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
组织切片免疫荧光染色
组织切片免疫荧光染色
组织切片免疫荧光染色是一种常用的方法，用于检测组织样本中特定抗原的表达情况。
它可以帮助研究者研究细胞、组织的结构和功能，以及疾病的发生和发展过程。
这种染色方法的基本步骤如下：
1. 取得组织样本：通常从动物（如小鼠、大鼠）或人体中取得组织样本。
样本可以是固定的组织块或细胞培养物。
2. 制备组织切片：将组织样本固定、包埋、切片，得到薄片。
常用的固定剂包括甲醛或乙醛等。
切片可以通过切片机或手工操作。
3. 抗原解露：将组织切片进行抗原解露处理，使得目标抗原能够与特异抗体结合。
解露方法包括热解露或酶消化等。
4. 抗原结合：将特异性抗体加入到切片上，与目标抗原结合。
这些抗体通常是通过动物免疫反应获得的。
5. 检测染色：使用荧光染料或酶联二抗法等方法标记抗体，以可视化与抗原结合的抗体。
荧光染料通常是荧光素和荧光素衍生物。
6. 显微镜观察：将染色的组织切片放置在荧光显微镜下观察和拍照。
荧光显微镜能够通过荧光染料的发射光进行可视化。
通过组织切片免疫荧光染色，研究者可以可视化特定抗原在组织中的位置和表达水平，从而了解细胞和组织的功能以及疾病的机制。
免疫荧光染色方法
免疫荧光染色方法免疫荧光染色方法是一种广泛应用于生物学研究领域的技术，可以用于检测和定位特定抗原分子在细胞或组织中的分布和表达情况。
该方法利用抗体与特定抗原结合，并利用荧光染料标记抗体，通过显微镜观察荧光信号来确定抗原的位置和表达量。
免疫荧光染色方法具有高灵敏度、高分辨率和广泛的应用范围，因此在细胞生物学、分子生物学、免疫学等领域得到了广泛应用。
首先，需要固定样品以保持细胞或组织的形态和结构。
常用的固定剂包括乙醛、甲醛和氯酸等，可以在细胞或组织中形成交联结构，固定抗原。
固定剂的选择应根据具体实验目的和样品类型来确定。
接下来，渗透化步骤是为了提高抗体与抗原的结合效率，并使抗体能够穿透细胞或组织进行染色。
常用的渗透剂包括甲醇、乙醇、Triton X-100等。
渗透化的时间和条件需根据样品的特性和实验要求来确定。
最后，通过荧光检测来观察和分析抗原在样品中的分布和表达情况。
荧光检测通常利用荧光显微镜来观察光信号。
在荧光染色中，主要有两种常用荧光染料，一种是荧光素和异硫氰酸荧光素（FITC），另一种是罗丹明（Rhodamine）。
这些染料在特定波长下能产生荧光，并且可以选择性地与抗体结合，形成荧光复合物。
通过荧光显微镜观察这些标记的复合物，可以确定抗原在样品中的位置和表达量。
除了基本的免疫荧光染色方法，还有一些其他的变种方法可供选择，例如间接免疫荧光染色、多重免疫荧光染色、双标记荧光染色等。
这些方法可以进一步提高检测的敏感性和分辨率，并提供更多的信息。
总的来说，免疫荧光染色方法是一种重要的生物学研究工具，可以用于检测和分析抗原的表达和定位。
随着技术的不断发展，免疫荧光染色方法在细胞和分子生物学研究中的应用前景将更加广阔。
免疫荧光染色名词解释
免疫荧光染色诊断是利用免疫荧光染色及显微镜做病理的一种诊断手法，通常用于检查免疫性疾病患者的各类标本。
免疫荧光染色又叫做FISH，主要是通过荧光标记抗原抗体，观察抗原抗体反应的高度特异性来做疾病的诊断。
比如乳腺癌组织中人表皮生长因子受体-2免疫组化染色显示2+，那么就必须做免疫荧光染色。
免疫荧光染色诊断可以分为直接免疫荧光染色诊断和间接免疫荧光染色诊断。
1、直接免疫荧光染色诊断：所用的染色方法为直接染色法，直接染色法常使用被标记的特异荧光抗体，使之与抗原反应一段时间后，洗去未参加反应的抗体后在显微镜下观察，根据阴阳标本对照得出诊断结果；
2、间接免疫荧光染色诊断：所用的染色方法为间接染色法和抗补体染色法。
间接染色法常用已标记和未标记的抗体分别与抗原反应，将形成的两种复合物再次结合形成新的复合物，洗去多余抗体后在显微镜下观察得出诊断。
免疫荧光染色诊断，应根据疾病的需要采取相应的检测方法。
细胞免疫荧光的染色方法
不通透的染色方法:封闭液:3%BSA 用PBS 配制不加吐温-20,一抗,二抗用封闭液配制.1.4% PFA（多聚甲醛）室温固定15min。
2.1xPBS 洗三次，每次5min。
3.3%BSA（不加吐温-20）封闭1hr。
4.一抗4度过夜5.1xPBS 洗三次，每次5min。
6.二抗37度2hr。
7.1xPBS 洗三次，每次5min。
8.DAPI 染色5min。
9.1xPBS 洗三次，每次5min。
蔺红方法染色：蔺红用的方法封闭液里不加土温20 。
我们模拟这个方法封闭液里加了土温20。
1.4% PFA（多聚甲醛）固定15min。
2.1xPBS 洗三次，每次5min。
3.0.2% tritonX-100 通透15min。
4.1xPBS 洗三次，每次5min。
5.3%BSA封闭0.5hr。
6.一抗4度过夜。
7.1xPBS 洗三次，每次5min。
8.二抗37度1hr。
9.1xPBS 洗三次，每次5min。
10.DAPI 染色5min。
11.1xPBS 洗三次，每次5min。
12.封片。
通透的染色方法:封闭液: :3%BSA 用PBS 配制，加千分之一吐温-20一抗，二抗用封闭液配制。
1、细胞铺板，处理2、弃上清，甲醇-20℃固定10min3、预冷的1X PBS 冲洗两遍4、0.2% NP40(PBS配)室温通透8min5、1X PBS 洗5min X 3次6、1%BSA(PBS+1千分之一的土温20配) 室温封闭40min7、一抗4℃（1%BSA配制）孵育过夜8、1X PBS 洗5min X 3次9、二抗（1%BSA配制）室温避光孵育1h10、1X PBS 洗5min X 3次，拍照。
免疫荧光技术：染色方法
免疫荧光技术：染色方法（一）制片选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。
用时取出用绸布擦净。
将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。
也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。
（二）固定除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。
固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。
标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
（三）水洗固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（四）染色染色分直接染色法与间接染色法。
1．材料与试剂（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。
（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。
甘油有减少非特异性荧光的作用。
（4）带盖方盘2．直接染色法（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。
（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。
（3）蒸馏水冲洗。
（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。
2．间接染色法（1）检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS 液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。
检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。
免疫荧光染色方法-use
实验方法/免疫细胞化学/030724星期四细胞表面抗原/细胞内抗原免疫荧光染色方法【实验准备】1.试剂（1）4%PFA或免疫荧光专用固定液（2）PBST（含0.5%TritonX-100/PBS，打孔作用，0.1M PBS配制）（3）0.1M PBS；0.01M PBS（4）正常羊血清（封闭非特异抗体）（原液1:20稀释）（5）2%BSA：用于配制一抗（为了使抗体能够进入细胞质或细胞核内，可用0.2% TritonX-100/PBS稀释抗体）；10%BSA（6）封片剂（甘油明胶）（7）一抗：鼠抗（单克隆抗体）；兔抗（多克隆抗体）；（8）对照一抗：羊抗鼠IgG；羊抗兔IgG.（9）二抗：羊抗兔IgG -TRITC；羊抗兔IgG –DyLight 488；兔抗鼠IgG -TRITC；兔抗鼠IgG - DyLight 4882.器械及其它：湿盒、加样枪、眼科镊子、注射器针头（挑细胞爬片）、六孔板3.样品：细胞爬片【操作步骤】1.细胞爬片用PBS漂洗两次；易脱落细胞较脆弱细胞用DMEM漂洗（在六孔板上操作）在六孔板内加入4%PFA，RT固定10min；2.0.1M PBS漂洗3次，每次5min；3.若检测细胞内抗原，需加入PBST打孔（含0.5%Triton X-100/PBS），室温或37℃孵育30～60min（核抗原时间要长）（可以中间换三次液5min ⨯ 3）；4.2%BSA或正常羊血清室温或37℃封闭30～60min（放入湿盒）；5.用2% BSA或0.2% PBST稀释一抗（1:100）；加一抗4℃过夜或37℃染色1小时（在有封口膜的载玻片上操作，需要一抗20～30μl，放入湿盒内）；6.PBS或PBST（细胞内抗原）漂洗3次，每次5min（洗的时间不要太长）；7.用2%BSA或0.2% PBST稀释二抗（1:50）；加二抗，室温或37℃孵育30min；8.PBS或PBST漂洗3次，每次5min；9.蒸馏水漂洗一次；10.甘油明胶封片；荧光显微镜下观察或-20℃避光保存。
免疫荧光染色技术及应用
免疫荧光染色技术及应用人类在面对各种疾病时，免疫荧光染色技术是一项十分重要的检测手段。
该技术利用荧光染料与抗体结合，并显示在微管中，从而帮助研究人员快速高效地检测出特定蛋白质及其存在的位置。
本文将介绍这一技术的基本原理、使用方法及其在生物医学领域中的应用。
一、免疫荧光染色技术基本原理免疫荧光染色技术（Immunofluorescence staining technique）是利用抗体特异性与组织靶分子相结合，再用荧光染料标记，进而检测特定蛋白质的位置。
该技术的基本原理是先用特异性的一抗（一种PECAM-1抗体）结合靶蛋白，再用荧光标记的二抗特异性结合第一抗体，从而形成荧光染色物，进一步观察其荧光信号的分布位置，同时判定靶分子的种类和分子量大小。
二、免疫荧光染色技术的使用方法首先，准备抗原或刺激物的样本，在荧光显微镜下将样品观察，选择合适的荧光标记，分别标记标本中要检测的特定蛋白质和待测试的抗体。
通过荧光显微镜观察这两种荧光染色物表现的方式和位置，如果两者在同一位置，则说明这种蛋白质与该抗体正好配对，是检测对象。
荧光显微镜的不断升级和发展，使得直接观察荧光成像成为一种非常高效且准确的技术。
三、免疫荧光染色技术在生物医学领域中的应用免疫荧光染色技术在生物医学领域中有广泛应用，其中包括诊断、治疗和预防疾病方面。
1.免疫组织化学分析免疫组织化学分析是免疫荧光染色技术的一种应用方式，它可以通过检测已知层面上蛋白质是否存在来帮助诊断疾病。
例如，LE会知道，如果一人有强直性脑脊髓炎，其免疫系统经常锁定GAD65（钩状攻角度分布并通过卷积峰在从35°到70°的较宽范围内）这种抗体。
该技术可以帮助诊断出很多常见疾病，如糖尿病、强直性脑脊髓炎、乳腺癌、白血病等。
2.病毒学方面的应用另外，在病毒学领域，免疫荧光染色技术也有着广泛的应用。
例如，利用该技术可以定量测定患者身上病毒负荷、病毒流行病学的强度、病毒分布情况，还可以分析病毒种群，为研究病毒的散布做出贡献。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色实验步骤1.细胞处理：将需要进行染色的细胞培养于培养皿中，通常使用生理盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，以去除培养基或其它细胞残留物。
2.固定：使用适当的固定剂，如甲醛或乙醛，固定住细胞。
通常在室温下固定细胞10-30分钟，然后用PBS洗涤。
3.渗透化处理：为了增强抗原与抗体的结合，需要使用渗透化剂如BSA（牛血清白蛋白）或胎牛血清等，封闭其它非特异结合位点。
浓度通常为1-5%的BSA，可以根据实验需要调整。
4.预处理：通过预处理，可以增强抗原的可见性。
预处理方法包括煮沸、酶解或蛋白酶处理等。
具体方法应根据需要选择。
5.抗原特异性溶液：将具有特异性的抗体溶液加入到含有细胞的培养皿中，使其与抗原结合。
抗体通常与标记物如荧光染料共价结合，使得标记的抗原能够被荧光显微镜观察。
6.清洗：将细胞用PBS洗涤，以去除未与抗体结合的游离抗体。
7.荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察染色后细胞中的抗原。
荧光显微镜具有特殊的光学透镜和滤光片，可以选择和激发不同荧光染料的发光。
根据需要，可以选择合适的滤光片来检测多个染色的细胞。
8.影像分析：通过图像处理软件对荧光显微镜下观察到的细胞图像进行分析和量化。
常见的分析内容包括抗原的位置、表达强度和相对数量等。
9.结果解读：根据荧光染色的结果来解读细胞中其中一抗原的表达情况。
可以通过比较实验组和对照组的亮度或表达分子的定量来确定差异。
补充说明：2.正、阴对照：在进行抗原染色前，应设置正、阴对照实验。
正对照是指使用已知表达目标抗原的样本，而阴对照是指使用未表达目标抗原的样本。
通过对照实验可以判断染色结果是否可靠。
3.染色条件优化：染色条件如温度、时间、抗体的浓度等都可能影响染色效果。
因此，需要对染色条件进行优化，以确保得到准确的结果。
4.扩展检测：除了直接染色，还可以使用间接染色方法来增强信号。
通过使用辅助抗体，可以将多个标记物同时进行检测，提供更多的信息。
总结起来，免疫荧光染色实验步骤是：细胞处理→固定→渗透化处理→预处理→抗原特异性溶液→清洗→荧光显微镜观察→影像分析→结果解读。
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!!11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
免疫荧光染色方法
免疫荧光染色方法（一）制片选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。
用时取出用绸布擦净。
将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。
也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。
（二）固定除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。
固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。
标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
（三）水洗固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（四）染色染色分直接染色法与间接染色法。
1．材料与试剂（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。
（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。
甘油有减少非特异性荧光的作用。
（4）带盖方盘2．直接染色法（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。
（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。
（3）蒸馏水冲洗。
（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。
2．间接染色法（1）检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。
（2）检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。
细胞免疫荧光染色操作步骤
细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。
实验步骤如下：1.已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
2. 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。
3.吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。
4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。
6. 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。
7.加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。
次日：8.取出细胞复温至室温约1h。
9.冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
10.配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用PBS或FBS配制。
浓度1:20011.加入二抗，室温孵育1小时(避光)。
12. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
13.DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。
14. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
15.加入防荧光淬灭封片剂，避光。
16.上机confocol建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
4.不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光实验步骤大全(精华版)免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。
2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。
5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。
6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。
10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。
11.次日取出切片，室温下复温30分钟。
12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。
14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。
16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。
贴壁细胞免疫荧光法1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。
2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。
3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
6.使用1% BSA室温封闭30分钟。
7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
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免疫荧光染色方法〔一〕制片选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。
用时取出用绸布擦净。
将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。
也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。
〔二〕固定除研究细胞外表抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。
固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。
标本的固定原那么是：①不能损伤细胞的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
常用抗原物质的固定方法〔三〕水洗固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
〔四〕染色染色分直接染色法与间接染色法。
1．材料与试剂〔1〕荧光抗体，稀释至应用浓度。
〔2〕0.01Mol/L pH7.4PBS液〔3〕9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。
甘油有减少非特异性荧光的作用。
〔4〕带盖方盘2．直接染色法〔1〕将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。
〔2〕PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。
〔3〕蒸馏水冲洗。
〔4〕滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。
2．间接染色法〔1〕检查抗原：①取固定标本，加的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。
〔2〕检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然枯燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液〔按1﹕100～1﹕500稀释〕，37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。
〔五〕结果显示荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。
荧光强度的表示方法如下：＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。
＋＋：荧光明亮，呈黄绿色。
＋：荧光较弱，但清楚可见。
± ：极弱的可疑荧光。
－：无荧光。
〔六〕标本保存由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。
因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进展荧光染色之后应立即观察。
保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂〔Fluormount〕或碱性优质纯甘油固剂等封固。
这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。
荧光原位杂交〔FISH〕实验步骤仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OLYMPUS BX51荧光显微镜；4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂〔1〕1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；〔2〕20×SSC〔pH7.0〕；〔3〕2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；〔4〕25mg/ml蛋白酶K消化液。
〔5〕变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml 蒸馏水；28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
〔6〕杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
实验步骤 1、脱蜡：1〕二甲苯脱蜡3次，每次5min；2〕100％酒精两次，每次2min；3〕移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气枯燥。
2、蛋白酶处理:1〕每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液参加管，摇动直到酶溶解。
2〕37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3〕×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4〕梯度酒精脱水〔-20℃预冷〕。
3、变性：1〕每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2〕78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3〕78℃孵育8min；4〕即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精，每缸2min；5〕空气枯燥。
4、杂交：1〕准备探针；2〕取一个较大的湿盒，穿插放置切片；3〕滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4〕盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5〕镊子小心去除盖玻片；6〕43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7〕2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8〕切片放人染色缸的1×PBS待检测，勿使切片枯燥。
检测：9〕从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，防止标本枯燥。
把切片放入湿盒，同时处理4切片。
10〕每切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11〕去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。
1×PBS 室温下洗3次，每次2min。
扩增：12〕从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13〕每切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14〕去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。
1×PBS 室温下洗3次，每次2min；15〕从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16〕每切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17〕1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：1〕切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；2〕尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒保存在-20℃冰箱。
切片在染色之后1h可以在显微镜下观察。
PRINS步骤 1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；2、用0.2mol/L盐酸处理5min；3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃15min；4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片；6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；8、片于65℃10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min；10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h；11、BufferⅢ液洗5min；12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。
FISH-荧光原位杂交实验〔原位杂交〕1. 实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的根本原理和在生物学、医学领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理荧光原位杂交〔Fluorescence in situ hybridization FISH〕是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的根底上开展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组构造研究、染色体精细构造变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH的根本原理是用的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原那么，与待检材料中未知的单链核酸进展特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进展杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1〕染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合严密，杂交信号强，易于检测；2〕全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3〕特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进展标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进展检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进展放大，从而可以检测500bp的片段。
而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。
直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进展信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
3. 实验用具及材料Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。
4. 实验方法及步骤1〕探针及标本的变性〔1〕探针变性将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。
〔2〕标本变性①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。
〔经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片〕。
②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。
③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气枯燥。
2〕杂交将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜〔约15～17h〕。