黑曲霉脯氨酰内肽酶在大肠杆菌中的表达
黑曲霉发酵产酶研究进展
黑曲霉发酵产酶研究进展张熙;韩双艳【摘要】黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属真菌中的常见种,它生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素,是美国FDA认证安全菌种(GRAS)之一,也是重要的酶制剂生产菌种.综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展,并展望了其广阔的应用前景.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2016(033)001【总页数】4页(P13-16)【关键词】黑曲霉;酶;发酵产酶【作者】张熙;韩双艳【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q939.97黑曲霉(Aspergillus niger)，属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是丝状真菌的一个常见种，广泛分布于粮食、植物产品和土壤中。
人类运用黑曲霉的历史悠久，早在中国古代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。
由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国FDA认证为安全菌种(GRAS)。
黑曲霉具有很强的外源基因表达能力及高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，同时重组子具有很高的遗传稳定性。
随着越来越多的外源蛋白在黑曲霉成功表达，且被证明具有较高的产量和活性，黑曲霉成为了一个重要的酶表达体系，也逐渐成为重要的工业酶制剂生产菌种[1]。
据报道，黑曲霉可生产纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果胶酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等多种酶。
作者综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展，并展望了其广阔的应用前景。
纤维素是地球上分布最广泛的一类碳水化合物，也是最丰富的可再生资源，但因其结构复杂、降解难度大，还未实现有效的转化利用。
纤维素酶由葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(β-BG)构成[2]，主要用于水解纤维素的β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素分解成短链糖。
黑曲霉植酸酶基因phyA的克隆及在大肠杆菌中的表达
沈阳农业大学学报，2009－06，40(3)：335-338Journal of Shenyang Agricultural University，2009－06，40(3)：335-338黑曲霉植酸酶基因phyA的克隆及在大肠杆菌中的表达闻雅男，王学英*，夏润玺，王媛媛（沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳110161）摘要：为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂，从自行筛选的黑曲霉中提取RNA，通过反转录合成模板cDNA，根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物，PCR扩增phyA，对扩增片段进行了克隆，通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。
从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列，将其与pET28a+质粒连接，构建pET28a+-phyA重组质粒，并在大肠杆菌中获得高效表达。
本研究成功克隆phyA，该基因全长1404bp，以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，编码467个氨基酸组成的多肽。
SDS-PAGE电泳结果表明，phyA在大肠杆菌中成功表达，成熟植酸酶的分子量约为51kDa。
在0.4g·L-1的IPTG的诱导下，植酸酶活性最大（1174U）。
关键词：黑曲霉；phyA基因；大肠杆菌；克隆载体；高效表达中图分类号：Q949.331文献标识码：A文章编号：1000-1700（2009）03-0335-04Cloning of a phyA from Aspergullus niger and Its over Expression inEscherichia coliWEN Ya-nan,WANG Xue-ying*,XIA Run-xi,WANG Yuan-yuan(College of Biological Science and Technology,Shenyang Agricultural University,Shenyang110161,China)Abstract：In order to acquire a large sum of highly active phytase and develop a new micro-organism biological agent,the research is conducted to amplify and clone the phytase gene phyA from Aspergillus niger with specific primers designed based on phyA gene full-length coding sequence.After restriction endonuclease reaction analysis and rDNA sequencing,the gene phy A was successfully cloned.The gene phyA fragment was recovered from the pBS-T-phyA and ligated with expression vector pET28a+to construct the recombined expression plasmid pET28a+-phyA.The gene phyA was expressed in Escherichia coli for high efficiency.The gene analysis protein reading frame with an initiation ATG codon and a termination TGA codon at the two ends,which encoded a mature peptide consisting of467amino acids.SDS-PAGE electrophoresis analysis and activity measurement showed that the expression product of the molecules,weight of51KD and the phytase activity reached maximum 1174at the condition of0.4g·L-1IPTG induction.Key words：Aspergullus niger；Phytase gene；Escherichia.coli；cloning vector；expressed for high efficiency植酸酶（Myo-inostitol hexaphosphate phosphohydrotase）是催化植酸及其盐类物质水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称，广泛存在于微生物、麦芽和种子等里面[1]。
黑曲霉的紫外诱变及酸性蛋白酶缺陷株的选育
１３ 培养条件 ．
将孢子菌悬液按体积分数 ０ １ ．０的接种量 ， 接种到发酵培养基中，Ｏ℃转速为 １０ｒｍｎ ３ ５ ｉ 的条件下 ／ 培养 ７ｄ 离心收集上清液 ， ， 既为粗酶液 。
基金项 目： 秦皇岛市科学技术研究与发展计划项目（ 项目编号： １０Ａ ７ ） ２ １１ １６ 。 ０
中图分类号 ： ９ ３ Ｑ ３ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：６２７ ８ （ ０ ２ ０ －０２０ １７ － ３ ２ １ ） １ ７ － ９ ０ ５
黑曲霉产酶发酵的历史十分悠久 ， 可用于生产淀粉酶 、 眭蛋 白酶、 酸 纤维素酶、 果胶酶 、 柠檬酸、 没食 子酸等多种酶制剂和食用酸， 是公认的可用于食品生产的高安全 性真菌 【 。此外 ， 曲霉在生物工程 ｌ 】 黑
，
要作用 。目前 ， Ｊ 已采用基 因重组技术从 大肠杆菌 中提取该 酶 ， 由于大肠杆菌表达水平低、 但 提取 困 难， 使其实际应用受到限制 。而黑 曲霉 的 ｐ葡萄糖苷酶基 因表达水平较高 ， 一 利用黑 曲霉作为其生产
菌株有突出优势。研究表 明， 黑曲霉产生的胞外蛋白酶能降解外源基因所表 达的蛋 白， 使表达产物不能 积 累。为使黑曲霉表达异源 ｐ葡萄糖苷酶的效果更好 ， － 必须在不改变蛋 白质外泌能力 的前提下 ， 使其 胞外蛋 白酶活性缺失 【 。本实验 旨在通过紫外诱变方法筛选酸性蛋白酶缺失 ， Ｂ葡萄糖苷酶活性基 ８ Ｊ 而 －
收稿 日期 ： ０ ２Ｏ －９ ２ １－２０
１ 期
刘 畅等
黑 曲霉 的紫外诱 变及酸性蛋 白酶缺陷株 的选育
１ ４ 紫外 诱变 条 件 的筛 选 ．
黑 曲霉经固体斜面培养后 ， 用无菌水洗下新鲜孢子 ， 制成孢子悬浮液 ， 用灭菌吸管吸取 １ Ｌ 孢子 ０ｍ （ 数量为 １ １ｍ Ｌ 于培养皿中， １ 紫外灯下照射 ， Ｏ ～ Ｏ 个／ ） 于 ５ｗ 停止照射后涂布平板 ， 用锡箔纸包裹平板 ， 完全避光 ２ ， ４ｈ 后拆开锡箔纸再培养 ４ ， ８ｈ 计算致死率 。通过改变紫外照射时间、 Ｊ 照射距离和孢子悬 液的浓度 ， 选择最适 的诱变条件 。 １ ５ 酸 性 蛋 白酶缺 陷菌 株 的筛选 ． １５ １ 平板初筛 将诱变后 的黑 曲霉孢子涂布于酪蛋 白平板和 ｐ葡萄糖苷酶筛选平板 ， ．． － ３ Ｏ℃培养 ４ ８
黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
表达检测其蛋 白表达形式 和活性 ， 为构建食 品级载体做准备 。
基金项 目： 国家 自然科学基金（ ｏ ０ ７ ５０ ３ ８ ２９ ） 中央高校基本 国家重点实验室 ＭＥ Ｑ Ｎ ７ ２７ ， ７ ３３ ； ３ ０ Ｋ Ｏ博士构 建 的 ｐ Ｉ９ ．Ｇ２质 粒为模 ＰＣ Ｋ １ １ ３ 科研业务费专项资金资助（ ｏ Ｋ ２ ０ ０ １ Ｊ Ｑ ０９ ２ ） Ｎ Ｙ ０ ９ ２ ， ２０ ０ ２ Ｊ Ｋ
关于黑 曲霉 Ｂ葡 萄 糖苷 酶 基 因 的研 究 报道 仍 然 较 少 ］ 一 。
本课题 将 黑 曲 霉 的 Ｂ葡 萄 糖 苷 酶 基 因 （ ｅ Ｂ ｎ ． Ｇ ｎ ａｋ登 录 号
Ｅ ２ ３ ８ ． ） 隆到 原 核表 达 载 体 ｐ Ｔ２ ａ上 ， Ｕ３７８１ 克 Ｅ ．８ 转化 Ｅ ｃｌ ． ｏ ｉ Ｂ２１ Ｄ ３ 进行 ， Ｉ （Ｅ ） 运用 Ｃ ｌ ９培养基 筛 选 阳性 克隆 ， ｅ— Ｍ 并诱 导
的是丝状真菌 ， 主要为曲霉属和木霉属 ， 而细菌 中研究较 多的 是芽孢杆菌属 Ｊ 。 研究表 明， 黑曲霉 是 Ｂ葡 萄糖 苷酶 酶活 较高 的菌株 ， 一 但
２ ０ｍ ，２ ℃ 高压蒸 汽灭 菌 １ ｎ ２ ０ｍｌ１ｍｏ ・ Ｍｇ ０ ｌ１ １ ５ｍｉ） ０ ， ｌＬ ．
Ｂ ｌ ｌ１ｎｔ ｇｎ ａｍ ｎ ｙＰ Ｒ， ｌｎｄｉｔ ｐ Ｔ２ ａｖｃ ｒ ｎ ａｓ ｒ ｄｉｔ Ｅ ｃｌＢ ２ Ｄ ３ ， ｃｅｎｄｃ ｎ ｓ ｙＣ ｌ ｇ ｆ １ ｅｇ ｅｅｆ ｇ ｅ ｔ Ｃ ｃｏｅ ｏ Ｅ －８ ｅｔ ｄｔ ｎｆ ｍｅ ｏ ．ｏ Ｌ １（ Ｅ ） ｓｒｅ ｅ ｌ ｅ ｂ ｅ ２ ｕ． ｈ ｒ ｈ ｎ ｏａ ｒ ｏ ｎ ｉ ｏ —
ｐ Ｔ２ ａ载体 ， Ｅ ．８ 转化 Ｅ ｃｌＢ２１ Ｄ ３ ，ｅ． ９培养基筛选 阳性克 隆， Ｄ Ａ测序分析 ， ．ｏ Ｉ （ Ｅ ） ｃ １ ｉ Ｍ 经 Ｎ 成功构建 ｐ Ｔ ８ ・ｇ Ｅ ２ ａＢ ｌ 达载体 。Ｓ Ｓ ２表 Ｄ— ＰＧ Ａ Ｅ显示 ， 重组菌经 ＩＴ Ｐ Ｇ诱导后表达 了 目的蛋 白 ， 其相对 分子质量 与预期 结果相符 。结果 Ｓ ＳＰ Ｇ Ｄ ．Ａ Ｅ显示蛋 白以包涵体形式表达 ， 克隆可用 ｅ ｌ ９培养基筛选 。结论 ｅＭ －
黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达周晓明;莫隽颖;陶冶;付水林;宫衡【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2010(27)6【摘要】根据GenBank报道的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因序列设计两对特异性引物,分别以黑曲霉H7总RNA及基因组DNA为模板,扩增出β-葡萄糖苷酶基因bgl 全长及活性中心所在的外显子5序列E5,分别将其连接到pMD18-T载体并转化到大肠杆菌DH5α测序.结果表明,bgl序列全长2583 bp,与β-葡萄糖苷酶基因(XM001398779.1)核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,E5与bgl 外显子5区域同源性为100%.进一步构建表达质粒pET32a(+)-bgl、pET32a(+)-E5、pET28a(+)-E5,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳分析.【总页数】4页(P50-53)【作者】周晓明;莫隽颖;陶冶;付水林;宫衡【作者单位】华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性 [J], 马明飞;李树金;金凤燮;鱼红闪2.黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 [J], 李泰明;庄舰峰;Jean Louis Didier MEKOO;谷春娇;邢芸;刘景晶3.多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和rbgl基因在大肠杆菌中的表达[J], 王艳;马亚茹;万学瑞;王川;吴润;刘桂林;刘原子;吴自祥4.扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达 [J], 邵金辉;赵云;毛爱军;朱雅新;董志扬;江宁5.大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达 [J], 谭华荣;何松;庄增辉;薛禹谷;张其玖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
改善大肠杆菌胞内氨基酰tRNA池提高外源基因表达水平
改善大肠杆菌胞内氨基酰tRNA池提高外源基因表达水平牛丹丹;沈微;王正祥【期刊名称】《中国生物学文摘》【年(卷),期】2007(021)005【摘要】大肠杆菌是研究和高效表达异源蛋白的常用宿主细胞。
由于大肠杆菌和真核生物及大部分古细菌在同义密码子上的使用有很大的差异，来源于真核或古细菌的外源基因在大肠杆菌中表达时，常常由于其带有稀有密码子而带来翻译方面的问题，如产生移码突变和表达量下降等，从而改变异源蛋自的表达质量和表达水平。
在研究常见嗜热菌tRNA结构和组成的基础上，以古细菌α-淀粉酶基因为例，采用增加有argU、ileY和leuW tRNA基因的大肠杆菌DE3为表达宿主，改善了胞内氨基酰tRNA池的大肠杆菌表达异源蛋白，表达量提高约9倍。
【总页数】1页(P29)【作者】牛丹丹;沈微;王正祥【作者单位】江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214036【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.氨基酰-tRNA合成酶及其与相关tRNA的相互作用研究 [J], 王恩多2.改善大肠杆菌胞内氨基酰tRNA池提高外源基因表达水平 [J], 牛丹丹;沈微;王正祥3.谷氨酰—脯氨酰-tRNA合成酶基因多态性与牛氨基酸和脂肪酸组成的关联分析[J], 杨冬宁;田万年4.利用天然乙内酰脲酶启动子在大肠杆菌中诱导N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的可溶性表达 [J], 张伟5.假单胞菌菌株ON-4a中的一个新型N—氨基甲酰—L—氨基酸酰胺水解酶：在大肠杆菌中表达的N—氨基甲酰—L—半胱氨酸酰胺水解酶的纯化和特性研究Ohmachi T等[Appl microbiol biotechnol，2004，65（6）：686．693] [J], 宫倩;朱春宝因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
黑曲霉木聚糖酶在大肠杆菌中的胞外表达和酶学性质研究
黑曲霉木聚糖酶在大肠杆菌中的胞外表达和酶学性质研究李阳阳;刘松;尹小强;堵国成【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2022(48)6【摘要】木聚糖酶能催化木聚糖分解为低聚木糖和木单糖,对于木聚糖高效利用具有重要意义。
该研究将黑曲霉(Aspergillus niger)AG11来源的β-D-1,4内切木聚糖酶(β-D-1,4 endoxylanase,xynA)分泌表达于大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3),并进行了表达条件优化和酶学性质研究。
最终确定xynA最佳表达条件为:诱导剂(异丙基硫代半乳糖苷)浓度0.1 mmol/L、诱导温度20℃、诱导起始OD_(600)值0.5。
在该条件下,胞外xynA活力达到15.8 U/mL,较初始条件提高85.9%。
重组xynA经镍柱纯化至单一条带后进行酶学性质分析。
酶学性质分析表明,重组xynA比酶活力、最适反应温度及最适反应pH分别为175.1 U/mg、50℃和4.0。
重组xynA在40℃半衰期为182 min,且在pH为2.0~9.0内孵育1 h保持在70%以上活性。
以桦木木聚糖为底物,重组xynA的K_(m)和k_(cat)分别为3.45 g/L和58.51 s^(-1)。
研究结果为xynA优良突变体的筛选和在工业生产中的应用奠定了基础。
【总页数】7页(P1-7)【作者】李阳阳;刘松;尹小强;堵国成【作者单位】粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学);江南大学生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.黑曲霉MAN1基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析2.黑曲霉木聚糖酶(xynZF-2)基因克隆、表达及酶学性质分析3.耐热耐碱木聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达及酶学性质研究4.黑曲霉胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究5.黑曲霉内切聚半乳糖醛酸酶A基因在大肠杆菌中的表达及产物酶学性质研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
黑曲霉木聚糖酶基因(xynA)在大肠杆菌中的表达及酶学分析
黑曲霉木聚糖酶基因(xynA)在大肠杆菌中的表达及酶学分析崔罗生;祝茂生;徐顺清;朱辉;梁运祥;张忠明
【期刊名称】《华中农业大学学报》
【年(卷),期】2009(28)1
【摘要】从黑曲霉(Aspergillus niger)F19中克隆得到木聚糖酶基因xynA。
将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a(+)上,并转化E.co-liBL21,获得重组工程菌BLX1。
经过IPTG诱导,xynA获得特异性表达,其表达产物以包涵体和胞内可溶性
蛋白2种形式存在。
经过SDS-PAGE分析,重组蛋白分子质量约为24 ku。
酶学分析表明,最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0,在酸性条件下具有较好的稳定性。
【总页数】6页(P48-53)
【关键词】黑曲霉;木聚糖酶;xynA基因;酶学性质
【作者】崔罗生;祝茂生;徐顺清;朱辉;梁运祥;张忠明
【作者单位】华中农业大学生命科学技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
【相关文献】
1.木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的高效表达 [J], 殷尔康
2.木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的表达研究 [J], 殷尔康
3.硫色曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆、表达及酶学性质分析 [J], 曹云鹤;陈小玲;
贺平丽;陆文清
4.黑曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆及真核表达载体的构建 [J], 张茂;刘德武;林纯;贺晓燕;孟繁明;周庆丰;杜云平;吴珍芳
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黑曲霉MAN1基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析
１０３ ） ５００
（ 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨
摘
要 ：为了通过基 因工程的方法在大肠杆 菌中生产 ／ 甘 露聚糖酶。以／ 甘露聚糖酶生产菌黑曲霉为材料 ， ３ 一 ３ 一
通 过 Ｒ — Ｃ 扩 增 获得 一 露聚 糖 酶 基 因 Ｍ １的 ｃ Ｎ 片段 ，将 该 片段 克 隆连 至 ｐ Ｄ１一 ＴＰＲ 甘 ＡＮ Ｄ Ａ Ｍ ８ Ｔ并 测 序 。Ｂａｔ ｌ 比对 ｓ
ｓ ｑｕ ｎ ｅ ｅ ｅ ｃ ｄ．Ｂｌｓ ｏｍｐ ｉｏ ｓ ｒｓ ｌ ｈ ｗｅ ｈ ｅ ｕ ｎｃ ｕ ｂ ｒＸＭ０ ４０ ０ ３ ｆ Ｇｅ Ｂａ ａ ｅ ａ ｔｃ ａｒ ｎ ｅ ｕｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ｅ ｓ ｑ ｅ ｅ ｎ ｍ ｅ ｓ ｓ ０１ ０ ５ ｏ ｎ ｎｋ ｈ ｖ
Ｓ ｉｎ ｅ ， ｏ ｔｅ ｓ ｒ ｕｔ ｒｌ ｉｅ ｓｔ， ｒｉ ０ ３ ， ｉａ） ｃｅ ｃ ｓ Ｎ ｒ ａ ｔ ｉ ｌ ａ Ｕｎｖ ｒｉ Ｈａ ｂｎ１ ０ ０ Ｃｈｎ ｈ Ａｇ ｃ ｕ ｙ ５
Ａｂ ｔａ ｔ Ｔ ｒｕ ｈｇ ｎ ｔ ｎ ｉｅ ｒ ｇｆ ｒ ｎａｉｎ ｉ ＥＣｏｉ － ｎ ａ ａ ｅ Ｔ ｏ ｇ － ｎ ａ ａ ｅ ｓ ｒ ｃ ： ｈｏ ｇ ｅ ｅｉ ｅ ｇｎ ｅｉ ｍｅ ｔｔ ． ｌ ｍａ ｎ ｎ ｓ ． ｈ ｕ ｈ ３ｍａ ｇ ｎ ｓ ｃ ｎ ｅ ｏ ｎ ３ ／
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黑曲霉尿酸氧化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达
黑曲霉尿酸氧化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达卢苇;荣俊;匡红艳;余知和【期刊名称】《长江大学学报（自然版）理工卷》【年(卷),期】2016(013)006【摘要】目的：：为大量生产医用尿酸氧化酶,对一个黑曲霉菌株的尿酸氧化酶基因进行了克隆和在大肠杆菌中的异源表达。
方法：基因测序结果显示,克隆的黑曲霉尿酸氧化酶基因全长为909bp,编码302个氨基酸残基。
SDS-PAGE和非变性电泳分析结果显示,单体酶分子量在35~37kDa 之间；表达过程中酶蛋白分子自我组装成4聚体蛋白,聚合体蛋白的表观分子量为140~150kDa。
结果：酶蛋白在大肠杆菌细胞液中表达,产物几乎完全以水溶状态存在,最佳溶解 pH 为8.0。
最佳酶促反应温度为35℃。
经过诱导表达后的菌体,按照1∶20(质量/体积)比例重悬于最优缓冲液中,进行超声波破碎后,粗酶液活力为67.69IU/mL,比活性为47.00IU/mg。
结论：提供了一个微生物来源尿酸氧化酶新的获取方法。
【总页数】6页(P1-6)【作者】卢苇;荣俊;匡红艳;余知和【作者单位】长江大学生命科学学院，生物医药研究所，湖北荆州 434100;长江大学生命科学学院，生物医药研究所，湖北荆州 434100;长江大学生物医药研究所，长江大学临床医学院，湖北荆州 434000;长江大学生命科学学院，湖北荆州434100【正文语种】中文【中图分类】R34【相关文献】1.黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其酵母表达载体构建 [J], 黄亮;郭润芳;于宏伟;贾英民2.尿酸氧化酶与肌酐水解酶融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 程新;刘芳;张彦新;蒋云生3.沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 杜翠红;刘静雯;周集体4.海洋细菌低温葡萄糖氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 刘春莹;胡善松;张庆芳;李美玉;于爽;迟乃玉5.黑曲霉尿酸氧化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 卢苇[1];荣俊[1];匡红艳[2];余知和[3]因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western_blot分析
收稿日期:2008-12-25基金项目:内蒙古自治区优秀学科带头人计划项目(20050802)作者简介:安玉麟(1954-),男,内蒙古土默特右旗人,研究员,硕士生导师,主要从事作物栽培、育种研究工作。
黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western blot 分析安玉麟1,孙瑞芬1,张鹤龄2,郭树春1,闫素丽3(1.内蒙古农牧业科学院生物技术中心,内蒙古呼和浩特 010031;2.内蒙古大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特 010021;3.内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特 010019)摘要:为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(GOD)在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株3.758的葡萄糖氧化酶(GOD)基因定向克隆于原核表达载体pE T 11a 上,构建了融合表达的重组质粒pE T/GO,转化E.coli B L21(DE3)plysS,用IPTG 诱导,超声波粉碎细菌细胞,SDS PAGE 电泳检测,GOD 基因获得了表达,表达的融合蛋白相对分子质量为66.5kDa 。
用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(ELISA)测定其效价为106,West ern blot 分析证明表达的融合蛋白与兔抗GOD 血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(GOD)抗体的制备奠定了基础。
关键词:黑曲霉3.758;葡萄糖氧化酶基因;融合表达;抗血清;ELISA;Wes tern blot 中图分类号:TQ920.1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2009)04-0084-04Prokaryotic Expression and Western blot Analysis of Glucose OxidaseGene from Aspergillus nigerAN Yu lin 1,SUN Rui fen 1,Z HANG He ling 2,GUO Shu chun 1,YAN Su li 3(1.Biotechnology Research Center,Inner Mongolia Academy of Agriculture and Husbundary Sciences,Huhhot 010031,China;2.College of Life Science,Inner Mongolia University,Huhhot 010021,China;3.Agricultural College of Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010019,China)Abstract:In order to further study e xpressed level and condition of Glucose oxidase (GOD)from As pergillus niger 3 758in E.coli ,the coding region of GOD from A.niger 3.758was inserted into the prokaryotic e xpression vector pE T 11a,and the recombinant plasmid was transformed into E.coli B L21(DE3)plysS.The result of SDS PAGE showed that the GOD gene was e xpressed by IPTG induction,and the molecular weight of the fusion protein was about 66.5kDa.An tiserum was produced in rabbit immunized with commercial GOD,and ELISA analysis proved that the titer of this antibody was 106.The Western blotting result confirmed that the antibody reacted specifically to the e xpressed fusion protein.The study established basis for preparation of GOD antibody from Aspergillus niger 3.758.Key words:As pergillus niger 3.758;Glucose oxidase gene;Fusion expression;Antiserum;ELISA;Western blot 葡萄糖氧化酶( D glucose:oxygen 1 oxidoreduc tase EC1.1.3.4,简称GOD),催化 D 葡萄糖氧化生成 葡萄糖酸酯和O 2,O 2被还原生成H 2O 2( D glu cose+O 2 glucose lactone+H 2O 2)[1]。
黑曲霉脂肪酶全基因合成及其在毕赤酵母中的表达
ｌ Ａ４混 合 物 为 模 板 进 行 第 二轮 Ｐ Ｒ 扩 增 ， 到 的 产 物 经 加 Ａ 处 理 后 ， 接 到 栽 体 ｐ ｉ ｐ Ｃ 得 连 ＭＤ１ 一 上 ， 取 重 组 子 测序 。 通 ８Ｔ 挑 过 Ｐ Ｒ 扩 增 对 人 工合 成 的基 因 进 行 校 正 ， 到 完 全 正 确 的 ｌｐ基 因。 将优 化 后 的 基 因克 隆到 表 达 栽 体 ｐ Ｉ ９ 上 ， 得 Ｃ 得 ｉ ＰＣ Ｋ 获 的 重 组 质 粒 ｐ Ｉ ｇ ｌ 经 线性 化 后 转 化 毕 赤 酵 母 Ｇ ｌ ５菌株 ， 建 分 泌 型 表 达 Ｌ Ｐ 的 酵 母 工 程 茵 ， ４ ８梯 度 筛选 ， Ｐ Ｃ Ｋ— ｐ ｉ Ｓ１ 构 Ｉ Ｇ １ 得 到 高 拷 贝稳 定 整 合 菌株 。 为 重 组 黑 曲霉 脂 肪 酶 的规 模 化 制 备 奠 定 了基 础 。 关键 词 ： 曲 霉 ； 肪 酶 ； 基 因合 成 ； 赤 酵母 ； 达 黑 脂 全 毕 表 中 图 分 类 号 ： ８ Ｑ７６ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ６ ２ ５ ２ （ ０ ０ ０ —０ ４ — ０ １７— ４５２１）６ ０５ ５
自行保 存 ； ｒ Ｓ ＡＲ ＨＳ Ｄ Ｐｉ Ｔ ｍｅ ＮＡ 聚合 酶 、 ４ Ｄ Ｔ ＮＡ 连 接酶 、 限制性 内切 酶 （ ｏＲ 、 ｔ ） Ｔａ Ｒ Ｅｃ Ｉ Ｎｏ ， Ｋａ ａ公 司 ； Ｉ
Ｓ ｌ ， 生物 工 程 （ 连 ） 限 公 司 ； 粒 提 取 试 剂盒 、 ａ 宝 Ｉ 大 有 质 Ｐ Ｒ 产物 纯化 试 剂 盒 、 回 收试 剂 盒 ， ｙ ｅ Ｃ 胶 Ａｘ ｇ ｎ公 司 ； 电 泳 仪 、 转 仪 ， ｉＲａ 公 司 。 电 Ｂｏ ｄ
黑曲霉_Aspergillusniger__省略_新型基因lipB的克隆_表达及
Research Paper研究报告微生物学报Acta Microbiologica Sinica 49(8):1095-1101;4August 2009ISSN 0001-6209;CN 11-1995 Q http: actamicrocn基金项目: 十一五 863计划(2007A A05Z417,2006AA020203)作者简介:杨江科(1972-),男,湖北天门人,博士,副教授,主要从事工业酶及酶工程等领域的研究。
Tel:+86 27 87792214;Fax:+86 27 87792213;E mail:jiangke yang@ 收稿日期:2009 02 07;修回日期:2009 05 09黑曲霉(Aspergillus niger )F044脂肪酶新型基因lipB 的克隆、表达及酶学性质分析杨江科,张正平,刘立营,闫云君(分子生物物理教育部重点实验室,华中科技大学生命科学与技术学院,武汉 430074)摘要:!目的∀本研究拟克隆新型的黑曲霉(Aspergillus niger )脂肪酶(EC 3 1 1 3)基因,实现其在大肠杆菌(Escherichia coli )的高效表达,并对表达产物进行系统的酶学性质分析,为该脂肪酶的工业化生产及应用奠定基础。
!方法∀通过PCR 和RT PC R 克隆脂肪酶基因,并将其开放式阅读框(ORF)克隆入融合表达载体pE T28a;表达产物经Ni agarose 纯化后对LipB 进行酶学性质分析,并通过圆二色谱进行结构分析。
!结果∀成功地从A .niger F044中克隆了一个新型的脂肪酶基因lipB ,获得了该基因的全基因组序列和cDNA 序列(GenBank:FJ536287、FJ536288),并实现了其在E .coli 中的高效表达。
LipB 分子量约为43 0kDa,最适底物为pNPC(C8),酶学动力学常数K m=5 98mmol L,最适反应温度为50#,最适pH 为6 0;该酶能在40#条件下保持稳定,在60#条件下处理1h 后残余酶活仅为18 8%;该酶对Ca 2+敏感,当脂肪酶经2mmol L Ca 2+处理1h 后,酶活提高了2 6倍。
黑曲霉菌为宿主菌的重组表达性质粒的构建
文章编号:1008-0392(2001)03-0001-03黑曲霉菌为宿主菌的重组表达性质粒的构建刘钟滨1,David J Jeenes 2,David B A rcher2(1.同济大学医学院微生物与免疫学教研室上海 200331;2.Institute of Food Res earch ,Norw ich NR47UA ,UK )摘要:目的 建立以py rG 基因为选择标志,以黑曲霉菌为宿主菌的蛋白质表达系统。
方法 以PC R 扩增获得的黑曲霉菌py rG 基因的部分序列片段为探针作两次噬菌斑原位杂交,从黑曲霉菌A TCC 12049基因文库中克隆获得长度为9.8kb 的DN A 片段,将其中含pyrG 基因的2.3kb 片段亚克隆至表达性载体P IGF 中,获得重组质粒。
对克隆基因进行了全基因测定和分析。
以黑曲霉菌AT CC 12049的pyrG 缺陷株M 54为受体菌,用聚乙二醇/氯化钙方法作基因转化实验,将重组质粒导入该受体菌并在其中表达。
结果 从黑曲霉菌AT CC 12049基因文库中克隆获得了py rG 基因,构建了含该基因的重组表达性载体pYG 1.2。
序列分析表明该基因与黑曲霉菌L112的pyrG 基因编码序列的同源性为93.9%,两者经推导的氨基酸的同源性为98.9%。
重组质粒pYG 1.2可使黑曲霉菌A T CC 12049的pyrG 缺陷株M 54发生基因转化,成为Py r +。
结论 在克隆了pyrG 基因的基础上成功构建了以py rG 基因为选择标志,以黑曲霉菌为宿主菌的重组表达性质粒。
关键词:重组质粒;构建;黑曲霉菌中图分类号:379.6 文献标识码:A收稿日期:2000-12-11基金项目:铁道部科技基金B00(40)作者简介:刘钟滨(1948-),男,教授,博士. 酵母菌是目前在基因工程中被广泛采用的一种真菌表达系统。
丝状真菌中的曲霉菌(aspergillus )由于其有生长迅速、易于培养、可大量产生分泌性蛋白质的特点,也受到人们的很大关注。
黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆与序列分析
黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆与序列分析
黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆与序列分析
以黑曲霉(A.niger)TCCC41013的总RNA作为模板,通过RT-PCR 扩增出含自身信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因,将其插入pUCm-T载体上,经PCR和酶切鉴定后进行测序并分析.所克隆的PEP基因全长为1 581bp,编码526个氨基酸残基,成熟肽为504个氨基酸残基.与GeneBank中已报道的A.niger CBS513.88的PEP序列同源性最高,达到99.75%.脯氨酸蛋白内肽酶是一种新型的丝氨酸蛋白酶,黑曲霉PEP 与已克隆的其他菌种的PEP同源性不高.
作者：杨迪高艳玲路福平周丽娜Yang Di Gao Yanling Lu Fuping Zhou Lina 作者单位：杨迪,高艳玲,路福平,Yang Di,Gao Yanling,Lu Fuping(天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津,300457)
周丽娜,Zhou Lina(齐齐哈尔大学生命科学与工程学院,齐齐哈尔,161006)
刊名：生物技术通报PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年，卷(期)：2008 ""(3) 分类号：Q3 关键词：脯氨酸蛋白内肽酶黑曲霉克隆序列分析。
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M em ory T Lym phocyte Responses A fte Hantavirus In fection [J ].Exp Med ,2002,196(5):579-588.[8]王平忠,白雪帆,张颖,等.HFRS 患者汉滩病毒核蛋白特异性T 细胞克隆及其靶细胞的建立[J ].中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(8):600-607.[9]M idori T aruishi ,K um iko Y oshimatsu ,K oichi Araki ,et al.Analysis of the immune response of Hantaan virus nucleocapsid protein -specific CD8+T cells in m ice[J ].Virology ,2007,365:292-301.[10]薛小平,徐志凯,马文煜,等.汉坦病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析[J ].中国病毒学,2000,15(3):220-224.[11]王斌,赵百慧,钱冬萌,等.汉滩病毒截短核蛋白在大肠杆菌中的表达及其初步应用[J ].中国生物工程杂志,2004,24(1):45-48.[12]Y ue Chen ,Bruce A.M cClane ,Derek J.Fisher ,et al.C onstruction of an Alpha T oxin G ene K nockout Mutant of Clostridium perfringens T ype A by Use of a M obile G roup ⅡIntron [J ].Appl Eviron Microbiol ,2005,71(11):7542-7547.[13]Y ue Chen ,Lori Carus o ,Bruce M cClane ,et al.Disruption of a toxin gene by introduction of a foreign gene into the chrom os ome of Clostridium perfringens using targetron -induced mutagenesis[J ].P lasmid ,2007,58(2):182-189.[14]Y ue Chen ,Ruth Helmus ,Bruce M cClane ,et e of a Clostridium perfringens vector to express high levels of SIV p27protein for the development of an oral SIV vaccine[J ].Virology ,2004,329:226-233.黑曲霉W3350脯氨酰内肽酶在大肠杆菌中的表达周丽娜1.2,张鹭2,路福平3,王晓娟1,杨剑芳1(1.天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津300457;2.齐齐哈尔大学生命科学与工程学院,黑龙江齐齐哈尔161006)摘要:目的:构建pET -PEP 重组原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。
方法:采用RT -PCR 技术从黑曲霉(Aspergillus niger )W3350中扩增出脯氨酰内肽酶(PEP )的基因,插入表达载体pET -22b (+),经Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切和DNA 序列测定验证,将正确的重组质粒转入大肠杆茵BL21(DE3)中,IPTG (终浓度1mm ol ΠL )诱导获得表达。
结果:表达产物进行超声破碎,经S DS-PAGE 电泳检测,PEP 分子质量大约为57kDa ,与理论值相符,通过酶活方法测定脯氨酰内肽酶酶活为0.656U Πml ,约是出发菌株的5倍。
结论:首次成功构建表达载体pET -PEP 并在原核细胞中表达,为进一步研究PEP 的生物学功能奠定了基础。
关键词:RT -PCR ;黑曲霉;脯氨酰内肽酶;基因表达中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)02-0015-03Expression of PEP of Aspergillus niger W 3350in E .coliZH OU Li -na1.2,ZH ANGLu 2,LU Fu -ping 3,W ANG X iao -juan 1,Y ANGJian -fang1(1.T ianjin K ey Lab of Industrial M icrobiology ,C ollege of Biotechnology ,T ianjin University of Science and T echnology ,T ianjin 300457,China ;2.Life Science and Engineering C ollege ,Qiqihar University ,Qiqihar 161006,China )Abstract :Objective :T o construct the prokary otic expression vector of the pET -PEP ,and identify the expressed production.Method :The PEP gene were am plified from Aspergillus niger W3350cells by RT -PCR ,and inserted into the prokary otic expression vector pET -22b (+)and veri 2fied by Eco R Ⅰand Hind Ⅲdigestion and DNA sequencing.The recombinant plasmid was expressed in E .coli BL21(DE3)by inducing of IPTG (1mm ol ΠL )and identified by S DS -PAGE.R esult :A fter s onication ,S DS -PAGE analysis indicated that the relative m olecular mass (M )of the protein was about 57kDa ,and it was equivalent to the expected value.the activity of PEP was 0.656U Πml by determination ,and it is about as five times as the original strain.Conclusion :T o construct the recombinant expression vector and to express the protein in E .coli success fully and to further the study of the biological function of PEP.K ey w ords :RT -PCR ;Aspergillus niger ;PEP ;gene expression收稿日期:2007-11-29;修回日期:2008-01-08作者简介:周丽娜(1982-),女,硕士生,3通讯作者:路福平,男,教授,博士生导师,研究方向:生物药物催化工程、药物设计与合成,E -mail :lfp @ 。
脯氨酰内肽酶(Proline specific endoprotease 简称PEP )[EC3.4.21.26]能特异性水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽键,多应用于食品工业、医药领域、多肽工业等领域;同时作为一种分子生物学的工具酶,可用于蛋白质序列测定、肽谱分析、特异位点的酶切、肽段的修饰和加工等[1]。
PEP 在生物体内含量甚微,直接从组织中分离提取繁琐且低效[2],且其产量和性质也不易控制。
因此,构建和利用基因工程菌作为大规模生产该酶制剂的宿主,成为研究该酶的一种新途径,具有重要的研究价值和潜在的医用价值。
国外Y o 2shim oto T 等已经从脑膜炎脓毒黄杆菌、嗜水气单胞菌、耐热古细菌、人淋巴细胞和猪脑cDNA 库中克隆了PEP 基因[3],国内仅李民等克隆和表达了点状产气单胞菌来源的脯氨酰内肽酶基因[4]。
黑曲霉是美国食品药品管理机构认定的生物安全菌,从黑曲霉中提取脯氨酸蛋白内肽酶应用于食品药品行业安全可靠,然而,迄今为止国内还没有有关黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的报道。
本文通过RT -PCR 从黑曲霉(A .niger )W3350中扩增出PEP 的基因序列,利用表达载体pET -22b (+)构建pET -PEP 重组质粒,并在原核表达菌株BL21中进行表达,为进一步研究PEP 的生理功能和生物学意义奠定基础。
l 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料:菌株E .coli DH5α、E .coli BL2l 和表达载体质粒pET -22b(+)均由本实验室保存。
1.1.2 试剂DNA 片段快速纯化回收试剂盒(博大泰克生物基因技术有限公司);RNase 酶、限制性内切酶(Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ)、T 4DNA 连接酶、T aq DNA 聚合酶(T aK aRa 公司);DNA Marker (fer 2mentas 公司);超绝UNI Q -10柱RNA 抽提试剂盒、RNA 反转录试剂盒(上海生物工程有限公司),其他试剂均为分析纯。
1.1.3 仪器:PT C -200型PCR 基因扩增仪;全自动凝胶成像仪;基因脉冲导入仪M icroPulser ;G ene S pc V 核酸测定仪;DYY-III -6B 型稳压稳流电泳仪;DY C2-24b 型电泳槽;P 型移样器;PHS -2C 型pH 计;HG 75-3电热恒温培养箱;HYG -Ⅱ型回转式恒温调速摇床;G L20A 型冷冻离心机;T C L -12台式高速冷冻离心机。
1.1.4 培养基和培养条件:大肠杆菌培养基为LB 培养基,培养温度37℃,摇床转速200r Πmin ,氨苄青霉素浓度为0.2%。
1.1.5 PCR 引物设计:根据G eneBank 中已发表脯氨酰内肽酶的基因序列,设计PCR 上游引物和下游引物,由T aK aRa 公司合成。
上游引物:5’-CCGG AATT CGG CT CG CCCCCG T CTTG T -3’(Eco R Ⅰ酶切位点);下游引物:5’-CCC AAG CTTT C AAG C AT AAT ACT CCT CC ACCC -3’(Hind Ⅲ酶切位点)。